BAHAN DAN METODE
1. Kapur api
Kapur api (CaO) yang digunakan sebagai bahan pengering dalam penelitian ini berfungsi sebagai absorben. Bahan ini diperoleh dari tempat pembakaran batu kapur “PD Kapur Jaya” di kecamatan Leuwiliang kabupaten Bogor. Kapur api yang digunakan adalah kapur api yang baru keluar dari pembakaran (tidak mengandung air) dan langsung dimasukkan kedalam kaleng tertutup rapat agar tidak menyerap air dari lingkungan sekitarnya. Komposisi proksimat kapur api yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran Tabel 15.
2. Mikroorganisme dan medium
Dalam penelitian ini digunakan kultur murni Saccharomyces cerevisiae (NRLL Y-2034 = BCC. F. 0074), yang diperoleh dari Laboratorium Kultur Balai Penelitian Veteriner Bogor. Medium yang digunakan yaitu medium padat Potato Dextrose Agar (Difco), dan media cair Potato Dextrose Broth (Difco), aquades.
Medium untuk produksi sel adalah sebagai berikut : glukosa, ekstrak khamir (Difco, USA), polypepton (Shin-Nihon Seiyaku, Tokyo); KH2PO4; (NH4)2SO4; MgSO4. 7H2O; CaCl2. 2H2O, (Merck), dan antifoam (Adecanol LG-294, Asahi Denka, Tokyo), NaOH dan H2SO4 untuk mengatur pH.
Alat-alat
1. Fermentor tipe biostat-V
Alat yang digunakan untuk produksi sel kamir adalah fermentor tipe Biostat-V, dengan spesifikasi : Total volume (15 L), kapasitas volume (12.5 L), volume kerja (10 L), inpeler (3 buah), diameter tangki (0.197 m), diameter inpeler (0.09 m), dan jarak inpeler (0.10 m).
Lemari pengering berbentuk lemari tertutup dengan ukuran 50 cm x 50 cm x 60 cm. (modifikasi Julianti 2003), seperti terlihat pada Gambar 11. Lemari pengering mempunyai 5 rak pengering yaitu 2 rak absorben yang terdapat di bagian atas dan bawah, dan 3 rak bahan dibagian tengah yang terbuat dari kawat kasa yang diberi bingkai. Dinding lemari pengering terdiri atas tiga lapis yaitu bagian luar terbuat dari tripleks dengan ketebalan 2 cm, yang bagian dalam dilapisi isolator berupa stirofoam dan fiberglass, agar lemari pengering ini benar-benar kedap terhadap gas maupun panas.
Lemari pengering mempunyai dua pintu, pintu bagian dalam berupa pintu kaca, sedangkan pintu luar terdiri atas dua lapis dan terbuat dari tripleks dengan ketebalan 2 cm, yang bagian dalam dilapisi isolator berupa stirofoam. Di bagian dalam alat pengering ditempatkan thermohigrometer untuk mengukur suhu dan kelembaban selama proses pengeringan berlangsung. Alat ini juga dapat dilengkapi dengan timbangan untuk mengukur berat sampel selama proses pengeringan.
3. Scanning electron microscope (SEM)
Digunakan untuk pengamatan morfologi sel, scanning electron microscope (SEM) yang digunakan adalah tipe JEM-JEOL JSM-5200. Alat ini dilengkapi kamera digital dengan film Polaroid tipe 55 untuk mencetak gambar yang dihasilkan.
B
Gambar 11. Konstruksi lemari pengering kemoreaksi dengan 5 rak (A), dan bagian- bagiannya (B) (modifikasi Julianti, 2003)
4. Transmission electron microscope (TEM)
Digunakan untuk pengamatan struktur bagian dalam dari sel, TEM yang digunakan adalah tipe JEM-100 CX TEM (Jeol, Boston, MA). Alat ini dilengkapi sistem kamera untuk mengambil gambar yang dihasilkan dengan menggunakan film Kodak 4489 Electron Microscope Film.
5. Atomic absorption spektrofotometer (AAS)
Digunakan untuk analisis konsentrasi ion K+ dan Ca++ pada sel setelah mengalami kebocoran. Alat yang digunakan AAS tipe Solaar M-5.
6. Spectrofotometer uv
Digunakan untuk analisis kadar protein dan asam nukleat yang terdapat pada air rendaman dari sel setelah mengalami kebocoran. Alat yang digunakan adalah Double Beam Spektrofotometer (Model U-2000, Hitachi Instrumens, Inc., Westone, MA).
7. Konduktometer
Digunakan untuk analisis ion-ion mineral yang keluar dari sel melalui air rendaman dari sel yang mengalami kebocoran berdasarkan daya hantar listrik. Alat konduktometer yang digunakan adalah tipe digital conductometer.
Peralatan lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik, otoklaf, inkubator goyang, sentrifus, desikator (yang telah diatur kelembaban-nya dengan larutan garam jenuh), hygrometer, mikroskop cahaya, ultra-mikrotom, colony counter, oven (untuk sterilisasi kering, oven vakum, clean bench (ruang inokulasi yang dilengkapi dengan penghembus udara steril), dan seperangkat alat-alat gelas.
Pelaksanaan Percobaan
Persiapan Bahan
Tujuan adalah untuk menyediakan sel khamir Saccharomyces cerevisiae untuk percobaan pengeringan kemoreaksi. Prosedur kerjanya adalah mula-mula kultur murni Saccharomyces cerevisiae (NRLL Y-2034 = BCC. F. 0074) disegarkan pada larutan NaCl 0.85% dan ditumbuhkan dalam 250 ml larutan Broth dalam erlemeyer 500 ml. Prosesnya dilakukan secara aerobik diatas rotary shaker pada suhu kamar selama 24 jam atau pada fase logaritmik.
Selanjutnya disiapkan medium untuk produksi sel dibawah kondisi aerobik yang terdiri dari 100 g/L glukosa; 6 g/L ekstrak khamir; 6 g/L polypepton; 6 g/L KH2PO4; 5 g/L (NH4)2SO4; 0.5 g/L MgSO4. 7H2O; 0.1 g/L CaCl2. 2H2O dan 0.05 ml antifoam (Adecanol LG-294). pH medium diatur sekitar 5 dengan NaOH atau H2SO4 (Kuriyama & Kobayashi 1993). Semua bahan disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 0C selama 20 menit, lalu di dinginkan sampai suhu ruang.
Inokulan kemudian dipindahkan kedalam larutan media produksi dalam batch fermentor yang telah berisi 10 L media produksi. Fermentor dilengkapi dengan sistem pengontrol terhadap suhu (± 25 0C), pH medium (± 5) dan antifoam (adecanol). Disamping itu diatur sistem agitasi pada 350 rpm dan sistem pemasukkan O2 dan pengeluaran CO2. Semua peralatan dan bahan bahan sebelum digunakan, telah disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 0C selama 20 menit. Proses produksi dilakukan secara aerobik selama 48 jam atau setelah tercapai produksi optimum dari sel kamir. Kemudian hasil produksi dipindahkan dalam erlemeyer, masing-masing ukuran 5 L dan diendapkan dalam ruangan dingin (5 0C) selama 24 jam, sebagian supernatan dibuang, dan bagian endapan dipisahkan dengan sentrifus. Sel yang diperoleh dicuci 3 kali dengan bufer fosfat 0.1 M, pH 5. Hasil akhir adalah sel kultur kamir berbentuk pasta yang disebut juga krim khamir, dan siap untuk dikeringkan. Proses produksi sel khamir dapat dilihat pada Gambar 12.
Kultur stock
Saccharomyces cerevisiae
Inokulasikan dalam 100 ml larutan PDB, 24 jam
(Starter)
Sterilisasi medium produksi dalam autoklaf (121 0C, 20 menit) • 100g/L glukosa • 5g/L ekstrak kamir • 5g/L bactopepton • 5g/L KH2PO4 • 5g/L (NH4)2SO4.7H2O • 0.1g/L CaCl2.2H2O
Produksi sel dalam Fermentor 350 rpm, pH : ±5; 25 0C, 48 jam Asam / basa Antifoam Pemisahan sel
sentrifugasi pada 3500 rpm, 20 menit
Kultur khamir
Berbentuk pasta (Krim khamir) O2
CO2
Pemanenan sel khamir
Endapan sel
dicuci dengan bufer fosfat 0.1M, pH 5, sentrifugasi pada 3500 rpm, 20 menit
supernatan
supernatan
Gambar 12. Diagram alir produksi sel khamir
Penelitian ini terdiri dari 5 tahap, dan masing-masing tahapan dengan tujuan dan hasil yang diharapkan dirangkum dalam Tabel 2, dan ringkasan percobaan pada Tabel 3. Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 13.
Tabel 2. Tahapan penelitian, tujuan dan hasil yang diharapkan
Tahap Penelitian Tujuan Hasil yang diharapkan Penelitian 1
Proses pengeringan kemoreaksi
Penelitian 2
Penentuan isotermi sorpsi air kultur kering
Penelitian 3
Penentuan pola stres dan kematian kultur kering pada kondisi air terikat
Penelitian 4
Pengamatan perubahan morfologi dan mikro-struktur sel kultur kering
Penelitian 5
Analisis kerusakkan dan kebocoran sel
Mengkaji dan menganalisis faktor-faktor dalam proses pengeringan kemoreaksi yang berpengaruh terhadap viabilitas kultur kering yang dihasilkan
Mempelajari pola isotermi sorpsi air (ISA) dan
menganalisis kadar air kritikal pada fraksi air terikat kultur kering
Mempelajari pola stres dan kematian kutur kering pada masing-masing fraksi air terikat
Mengetahui morfologi dan mikrostruktur sel kultur segar dan kultur kering pada berbagai kondisi air terikat
Mengetahui tingkat kerusakan struktur sel dan kebocorannya pada berbagai kondisi air terikat
Diperoleh kultur kering dengan kadar air akhir rendah, waktu pengeringan yang singkat dan viabilitas yang tinggi
Diperoleh pola ISA dan kadar air kritikal yang berpengaruh terhadap kestabilan kultur kering pada masing-masing fraksi air terikat
Diperoleh data dasar mekanisme stres kering dan dampaknya terhadap
viabilitas pada masing-masing fraksi air terikat
Diperoleh gambaran perubahan pada bagian-bagian sel pada masing-masing fraksi air terikat
Diperoleh data dasar dan gambaran tingkat kerusakkan dan kebocoran sel pada saat dorman, stres dan mati
Tabel 3. Ringkasan percobaan dari setiap tahap penelitian
Penelitian Faktor Pengamatan/analisis Penelitian I
Kemoreaksi
Penelitian 2
Penentuan Isotermi Sorpsi Air Kultur Kering
Penelitian 3
Penentuan Pola Stres dan Kematian Kultur Kering pada Kondisi Air Terikat
Penelitian 4
Pengamatan Morfologi dan Mikrostruktur Sel Kering Penelitian 5
Analisis Kerusakan dan Kebocoran Sel
pengeringan
• 5 rasio penggunaan CaO
16 tingkatan RH dalam penyimpanan 10 tingkatan RH dalam penyimpanan 10 tingkatan RH dalam penyimpanan 10 tingkatan RH dalam penyimpanan
• Viabilitas kultur kering
• Kadar air kesetimbangan
• Analisis kapasitas air terikat
• Total khamir
• Khamir sehat (tidak stres)
• Khamir stres
• Tidak tumbuh (dorman/mati)
• Perubahan morfologi
• Perubahan mikrostruktur
• Daya hantar listrik (DHL)
• Kebocoran ion K+ dan Ca++
• Kebocoran protein dan asam nukleat
Penelitian 1. Proses Pengeringan Kemoreaksi
Lemari pengering sebelum digunakan, terlebih dahulu dibersihkan dan disterilkan dengan alkohol 96%, diamkan dalam keadaan tertutup rapat ±1 jam. Kemudian masukkan kapur api sebanyak 4 kg dan lemari ditutup rapat, lalu dibiarkan selama 24 jam. Setelah 24 jam kapur api diganti dengan yang baru, kemudian dimasukkan sampel yang akan dikeringkan. Selama proses pengeringan berlangsung, pintu lemari harus dalam keadaan tertutup rapat. Diagram alir proses pengeringan kemoreaksi dapat dilihat pada gambar 14.
Perlakuan pada percobaan ini adalah : 1) Penentuan tebal lapisan pengeringan
K R IM K H A M I R I. P E N G E R IN G A N K E M O R E A K S I P E R L A K U A N T E B A L L A P IS A N P E R L A K U A N R A S IO C a O P R O S E S P E N G E R IN G A N T E R B A I K K U L T U R K H A M I R K E R IN G P E N Y IM P A N A N D I D A L A M 1 6 D E S IK A T O R B E R B A G A I R H : (1 1 % - 9 7 % , S U H U ± 2 8 C , L A M A 1 5 H A R I III. P E N E N T U A N P O L A S T R E S D A N K E M A T IA N K U L T U R K E R IN G IV . P E N G A M A T A N M O R F O L O G I D A N M IK R O S T R U K T U R S E L (S E M /T E M ) V . A N A L IS IS K E B O C O R A N S E L K U L T U R K H A M I R K E R I N G T E R B A IK II. P E N E N T U A N P O L A IS A D A N A N A L IS IS A T P ; A T S ; A T T
LEMARI PENGERING BERISI CaO Setelah 24 jam (RH 0-1%, suhu ruang 280C, suhu CaO 290C ) LEMARI PENGERING KOSONG ( RH 80%, suhu 28 0C) LEMARI PENGERING BERISI CaO + KULTUR KHAMIR
Awal 0-1 jam (RH 70%, suhu ruang 29 0C, suhu CaO 30-35 0C, kadar air khamir ± 80%)
LEMARI PENGERING BERISI CaO + KULTUR KHAMIR
Setelah 24 jam (RH 0-1%, suhu ruang 280C, suhu CaO 29 0C, kadar air khamir ± 4%)
KULTUR KHAMIR KERING