BAHAN DAN METODE
KULTUR KHAMIR KERINGCaO
(kapur api) Ca(OH)2 KRIM KHAMIR Ca(OH)2 CaO (kapur api)
Gambar 14. Diagram alir proses pengeringan kemoreaksi
Dalam pelaksanaan penelitian ini mula-mula disiapkan beberapa cawan Petri yang telah diketahui luas alasnya (± 154 cm2), kemudian dialas dengan lembaran plastik. Cawan Petri diisi dengan sampel (sel khamir), masing-masing 20 ml; 40 ml dan 60 ml (dilakukan secara triplo). Diperoleh perbandingan masing-masing : 20 ml /154 cm2; 40 ml / 154 cm2 dan 60 ml / 154 cm2 atau ketebalan 1.3 mm; 2.6 mm; dan 3.9 mm. Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam lemari pengering yang telah diisi dengan CaO dalam jumlah berlebih agar dicapai kadar air akhir yang
rendah dalam waktu singkat sehingga viabilitas kultur tetap terjaga. Pengamatan dilakukan terhadap kadar air yang dihasilkan dalam selang waktu 6 jam.
Tahap selanjutnya adalah pengujian penggunaan CaO yang efektif untuk pengeringan. Dilakukan dengan beberapa perbandingan CaO dan sampel yang akan dikeringkan, yaitu 5 : 1; 10 : 1; 15 : 1; 20 : 1 dan 25 : 1 atau R5; R10; R15; R20; R25. Pengamatan dilakukan terhadap kadar air dan viabilitas kultur yang dihasilkan .
Penelitian 2. Penentuan Isotermi Sorpsi Air Kultur Kering dan Pengaruh Bahan Pelindung
Untuk menentukan kurva isotemi sorpsi air perlu diketahui kadar air yang berkesetimbangan terhadap RH lingkungan penyimpanan dari sampel kultur khamir kering. Setelah diketahui pola isotermi, dapat dihitung masing-masing kapasitas air terikatnya.
1) Penentuan kadar air kesetimbangan dan pengaruh bahan pelindung
Pelaksanaan penelitian ini mula-mula dilakukan penyetimbangan dalam ruang desikator yang telah diatur pada RH 11.2% sampai 97%, untuk mendapatkan kadar air kesetimbangan (Me). Pengukuran kadar air kesetimbangan (Me) adalah dengan cara menempatkan 1 g sampel (berat awal) pada cawan, kemudian dimasukkan ke dalam desikator berisi larutan garam jenuh dengan RH tertentu (Tabel 4). Desikator disimpan dalam ruangan yang suhunya konstan selama 15-20 hari dan dicapai keseimbangan antara sampel dengan RH desikator.
Pengamatan yang dilakukan terhadap kadar air, kemudian kadar air dihitung berdasarkan basis kering. Kadar air yang diperoleh di plot dalam kurva isotermi sorpsi air. Dari kurva yang terbentuk dapat diidentifikasi model isotermi sorpsi air dari kultur kering khamir serta dapat ditentukan fraksi-fraksi air terikat.
Perlakuan pada tahap percobaan ini adalah : a) Kultur kering tanpa bahan pelindung
b) Kultur kering ditambah bahan pelindung 2% tepung agar-agar c) Kultur kering ditambah bahan pelindung 2 % CMC.
Tabel 4. Berbagai larutan garam jenuh dan nilai RH yang digunakan dalam penentuan sorpsi isotermi sorpsi air (Rockland dan Nishi 1980)
No
Larutan Garam Jenuh RH (%) pada suhu 30o C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 LiCl CH3COOK MgCl2 NaI K2CO3 Mg(NO3)2 NaBr NaNO2 KI SrCl2 11.2 22.6 32.4 36.3 43.0 51.3 57.5 64.0 69.0 71.0
11 12 13 14 15 16 17 18 NaNO3 NaCl KBr KCl K2CrO4 BaCL2 KNO3 K2SO4 73.8 75.5 80.7 84.0 87.0 90.3 93,0 97.0
2) Analisis kapasitas air terikat
Untuk menduga air terikat primer (ATP) digunakan persamaan BET (Brunauer, Emmett dan Teller 1938 didalam Suyitno 1994). Untuk menduga kapasitas air terikat sekunder (ATS) atau titik peralihan dari air terikat sekunder ke air terikat tersier digunakan persamaan Soekarto (1978). Sedangkan kapasitas air terikat tersier (ATT) dihitung dengan menggunakan model polinomial ordo 2 dan secara interpolasi kuadratik (Julianti 2003).
Penelitian 3. Penentuan Pola Stres dan Kematian Kultur Kering
Prosedur penentuan pola stress ini adalah dengan menyimpan kultur kering
Saccharomyces cerevisiae pada berbagai kondisi suhu dan RH (11 – 96 %) ruang penyimpanan. Setelah sampel mencapai kadar air kesetimbangan, lalu dihitung jumlah khamir yang hidup dan yang mengalami stres pada masing-masing daerah air terikatnya. Sebagai kontrol adalah khamir kering sebelum penyimpanan pada berbagai RH.
Stres dan kematian mikroba ditentukan dengan menumbuhkan sel kering pada medium PDA dan PDA+7.5% NaCl, lalu koloni dari khamir yang hidup dihitung jumlahnya. Jumlah koloni pada PDA adalah sel yang sehat dan sel yang stres, sedangkan yang tumbuh pada PDA+7.5% NaCl adalah sel yang sehat, sebagai kontrol digunakan sel kering yang tidak disimpan pada desikator.
Ó koloni pada PDA -Ó koloni pada PDA+7.5% NaCl % sel stres = x 100% Ó koloni pada PDA
Ó koloni kontrol pada PDA - Ó koloni pada PDA
% sel mati = x 100% Ó koloni kontrol pada PDA
Pola stres dan kematian mikroba dapat digambarkan dalam suatu kurva hubungan antara log jumlah mikroba yang hidup pada media PDA dan media PDA + 7.5% NaCl dari masing-masing aktivitas air (aw) atau kadar air kesetimbangannya.
Pada tahap penelitian ini yang diamati adalah perubahan pada bagian permukaan sel menggunakan Scanning Electron Microscope (SEM) dan bagian dalam sel menggunakan Transmission Electron Microscope (TEM).
Dalam pelaksanaan penelitian ini, mula-mula kultur kering disimpan di dalam desikator yang telah diatur RHnya dan mewakili masing-masing daerah air terikat. Setelah terjadi kesetimbangan antara bahan dengan RH penyimpanan (selama 15 – 20 hari penyimpanan), lalu diamati perubahan yang terjadi pada bagian luar dan di dalam sel, lalu dibandingkan dengan sel dari kultur segar.
1) Pengamatan morfologi sel
Metode yang digunakan dalam persiapan sampel untuk pengamatan morfologi sel adalah modifikasi dari metode Bozzolla dan Russel (1999). Sampel yang digunakan adalah sel kering yang telah mencapai kesetimbangan dengan RH ruang penyimpanan.
Sebanyak 5 mg sampel disuspensikan dalam 5 ml buffer sodium cocodylate 0,1M, dilakukan pencucian sebanyak 3 kali. Sel dalam suspensi dikumpulkan melalui penyaringan dengan membran nitroselulosa ukuran 0.2 ì m. Sel yang terkumpul pada membran di rendam dengan glutaraldehid 3% (didalam buffer cocodylat 0.1M, pH 7.2) selama 2 jam, kemudian membran dicuci 3 kali dengan buffer cocodilat 0.05%, masing-masing 20 menit. Selanjutnya difiksasi dengan osmium tetroxide 1% didalam buffer kokodilat 0.05%, pH 7.2 selama 2 jam, lalu dicuci dengan air “double destilat” (DDH2O) 3 kali, masing-masing 2 menit. Membran yang berisi sel selanjutnya dikeringkan dengan etanol bertingkat (30%; 50%; 70%; 80%; 95% dan 3 kali dalam 100%), lalu direkatkan pada meja sampel (aluminium stubs) dan dilapisi argon (Ar+), melalui proses vakum (60 -70 g/cm) selama 15 menit dengan ketebalan pelapisan 20-30 nm.
2) Pengamatan mikrostruktur
Metode yang digunakan dalam persiapan sampel untuk pengamatan mikro- struktur adalah modifikasi dari metode Bozzolla dan Russel (1999). Sampel yang digunakan adalah sel kering yang telah mencapai kesetimbangan dengan RH ruang penyimpanan. Tahap-tahap dalam persiapan sampel adalah sebagai berikut
a) Fiksasi. Kira-kira 10 mg sampel dari khamir kering dimasukan dalam tabung eppendorf lalu dicuci dengan 500 ìl buffer sodium kokodilat 0.1M (pH 7.4) sebanyak 3 kali. Kemudian sel khamir diimersi selama 24 jam (4 0C) dalam 500 ìl glutaraldehid 5% (v/v) dalam sodium kokodilat + 3% sukrosa, setelah itu dicuci dan difiksasi dengan osmium tetraoksida 2% + K3Fe(CN)6 2.5% dalam buffer selama 2 jam (4 0C). Selanjutnya dicuci kembali dengan buffer 3 kali.
b)Dehidrasi. Pelet yang sudah difiksasi dihidrasi dalam etanol bertingkat :
30%; 50%; 70% (masing-masing 1 kali, 10 menit); 95% (3 kali, 10 menit); dan etanol absolute (3 kali, 20 menit) pada suhu 40 C.
c) Infiltrasi. Pellet dalam tabung ependorf ditambah 1 ml campuran etanol absolute dan propilen oksida dengan perbandingan; 2:1; 1:1; 1:2 dan propilen oksida murni, masing-masing 30 menit pada suhu ruang.
d) Embedding. Pelet ditambah campuran propilen oksida dengan plastic spurr’s (1:1) selama 30 menit pada suhu ruang, kemudian buang ½ bagian campuran dan ganti dengan dengan spurr’s murni selama 30 menit. Kemudian ganti kembali semua campuran spurr’s dengan spurr’s murni, dan disimpan dalam ruangan vakum selama 16 jam. Selanjutnya pisahkan pellet dari spurr’s dan masukkan kedalam block tube dan tambahkan plastic spurr’s murni dan dkeringkan dalam inkubator vakum pada suhu 70
0C selama 16 jam.
e) Pemotongan. Contoh yang telah berbentuk balok dikeluarkan dari block tube, kemudian dipotong dengan ultra microtome (tipe LKM Ultra Microtome), hingga diperoleh irisan contoh yang berisi sel berbentuk lepengan berwarna keemasan dengan ketebalan 30-60 nm, irisan contoh dikumpulkan dan ditempelkan pada grid yang telah dilapisi formvar
dan dikeringkan.
f) Pewarnaan. Bahan yang digunakan adalah uranyl asetat 5-10% dalam DDH2O selama 30 menit, kemudian dicuci dengan DDH2O (5 kali) dan dikeringkan. Pewarnaan dilanjutkan dengan Lead sitrat selama 15 menit, dan dicuci kembali dengan DDH2O (5 kali) dan dikeringkan.
g) Pengamatan. Selanjutnya contoh diidentifikasi dengan JEM-100 CX TEM (Jeol, Boston, MA).
Penelitian 5. Analisis Kebocoran Sel
Kebocoran dinding sel atau membran sitoplasma diperiksa dengan menguji adanya komponen-komponen mikroseluler yang dilepas kedalam supernatan (air rendaman), khususnya nukleotida, asam nukleat, asam amino dan protein serta ion-ion mineral yang terkandung pada struktur sel.
Analisis kebocoran sel dilakukan terhadap sampel sel khamir kering yang telah disetimbangkan dengan RH ruang penyimpanan, kemudian 0.1 g sampel direndam didalam 100 ml air bebas ion selama 24 jam. Kemudian supernatan dipisahkan dari endapan menggunakan sentrifus, endapan sel diproses dengan pengabuan secara basah untuk analisis ion-ion K+ dan Ca++ yang tersisa didalam masing-masing sampel, sedangkan supernatan digunakan untuk pengamatan daya hantar listrik dan senyawa analisis protein dan asam nukleat yang dilepas dari sel yang bocor ke dalam air rendaman sel atau supernatan.
Analisis dan Pengamatan
Kadar air dihitung berdasarkan berat yang hilang setelah pengeringan. Kadar air dari krim sel, dan sel khamir kering (± 1 g) dengan menempatkannya pada cawan aluminium yang telah diketahui beratnya, lalu dikeringkan dalam oven pada 80o C selama 24 jam. Setelah pengeringan sampel segera ditutup, untuk mencegah masuknya uap air ke dalam sampel. Kemudian sampel ditimbang.
a - b Kadar air (bb) = --- x 100 a
dimana : a = berat contoh awal (g) b = berat contoh akhir (g)
Jumlah Mikroba (Fardiaz 1989)
Pengamatan terhadap jumlah mikroba adalah berdasarkan pada metoda standar perhitungan koloni. Prosedurnya adalah : 0,1 - 1 g inokulum dimasukan dalam 10 ml larutan garam fisiologis 0.85%. Kemudian diencerkan dengan larutan yang sama sampai konsentrasi 10-2. Hasil pengenceran dituang kedalam cawan petri yang berisi medium PDA. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Selanjutnya khamir yang hidup dihitung koloninya dengan menggunakan Quebec Colony Counter.
Analisis Senyawa Protein dan Asam Nukleat (Davidson & Branen 1980)
Sel kering S. cerevisiae dengan masing-masing kadar air yang sudah setimbang dengan RH penyimpanan, sebanyak 1 g mula-mula direndam dengan air bebas ion selama ± 24 jam pada suhu kamar. Kemudian supernatan dipisahkan dari endapan menggunakan sentrifus pada kecepatan 10 000 rpm selama 20 menit. Supernatan disaring kembali melalui kertas saring (0.20
µm). Supernatan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 280 nm (penentuan kadar protein) dan 260 nm (penentuan asam nukleat) yang sebelumnya discaning pada 200 - 800 nm (untuk menentukan panjang gelombang dari sampel yang diukur).
Dari angka-angka absorbansi yang terukur dapat dihitung kadar protein, asam amino, nukleotida dan asam nukleat yang dilepas kedalam air rendaman sel, dengan pendugaan berdasarkan hukum Beer’s atau persamaan berikut :
A = a b c
dimana A = absorban, c = konsentrasi, b = ukuran kuvet larutan yang diukur (1 cm) dan a adalah absopsivitas senyawa yang diukur (Penner, 1994). Cara perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 17.
Pengukuran Daya Hantar Listrik (Budiarti 1999)
a - b
Kadar air (bk) = --- x 100% b
Pengukuran daya hantar listrik (DHL) dilakukan dengan cara merendam 1 g sampel kultur kering (masing-masing kadar air yang sudah setimbang dengan RH penyimpanan) dalam air bebas ion selama ± 24 jam pada suhu kamar. Kemudian massa sel dipisahkan melalui penyaringan menggunakan kertas saring “Whattman No 1. lalu supernatan diukur daya hantar listriknya dengan alat konduktometer. Sebelum digunakan alat konduktometer dikalibrasi dulu dengan air bebas ion. Angka yang terbaca pada alat konduktometer menunjukkan konsentrasi ion-ion mineral yang keluar melalui membran sel akibat rusaknya membran sel dari kultur kering.
Analisis Kebocoran K+, dan Ca++ (Park 1996)
Sebanyak 1 g sampel khamir kering (pada kadar air yang sudah disetim-bangkan), disuspensikan dalam 100 ml air bebas ion, direndam ± 24 jam pada inkubator goyang, kemudian massa sel dan supernatan dipisahkan dengan sentrifus pada kecepatan 3500 rpm selama 20 menit. Massa sel diabukan melalui pengabuan basah dengan penambahan asam kuat (HNO3 + H2SO4 + HClO4). Kemudian dari supernatan hasil pengabuan, ditentukan total K dan Ca mengguna-kan AAS (Atomic Absorption Spectroscopy). Prosedur kerja proses pengabuan pada Lampiran 18.
Konsentrasi ion-ion yang keluar dari sel dihitung dalam mg/g berat kering dan hasilnya merupakan persentase dari angka yang diperoleh dibandingkan dengan kontrol (sel kering pada kadar air sebelum disetimbangkan).
Perhitungan : X (%) = {(A – B) /A} x 100%, dimana
X = Persentase ion (X) yang dilepas kedalam air rendaman
A = Kadar mineral awal didalam sel sebelum penyetimbangan kadar air B = Kadar mineral yang masih tersisa di dalam sel setelah penyetimbangan
kadar air
Viabilitas Sel (Messer et al. 1985 didalam Fu & Etzel 1995)
Viabilitas dari sampel krim sel (sel yang belum dikeringkan), kultur kering, dan kultur kering dengan kadar air yang sudah disetimbangkan, masing-masing diukur berdasarkan metode standar penghitungan koloni. Kultur kering direhidrasi dengan air steril deionisasi hingga mencapai konsentrasi padatan yang sama dengan kultur cair. Kemudian sampel ditumbuhkan pada medium PDA, dan dihitung koloni yang terbentuk pada masing-masing sampel setelah inkubasi pada 32o C selama 5 hari.
Koloni dari masing-masing sampel kultur kering, dikoreksi terhadap konsentrasi padatan yang sama dengan larutan kutur segar. Koreksian menggunakan persamaan : N = Nm x Sf/ Sm, dimana N adalah nilai koloni/ml yang dilaporkan dari larutan sampel kering dengan konsentrasi yang sama dengan larutan kultur segar. Nmadalah koloni/ml larutan yang diukur, Sf adalah konsentrasi padatan dari larutan kultur segar, dan Sm adalah konsentrasi padatan dari larutan
yang diukur. Persentase survival = 100 ( o), dimana o adalah koloni/ml dari larutan kultur segar.