Pengukuran genotip e ikan dilakukan menggunakan metode RAPD (Nugroho, 1997) diawali dengan proses ekstraksi DNA genom, kemudian uji kualitas DNA, seleksi primer, amplifikasi DNA menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) dan terakhir adalah analisis data.
Ekstraksi DNA
Sampel ikan berupa sirip dorsal ditimbang sebanyak 0,5-1 mg dan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 ml, kemudian dilisis dengan menambahkan larutan lisis (10mM tris HCl pH 7,5, 125mM NaCl, 10mM EDTA pH 7,5, 0,5% SDS dan 4 M urea) sebanyak 500 ul dan Protein Kinase sebanyak 15 ul. Setelah itu dikocok menggunakan alat vorteks dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam atau sampai sirip hancur. Selanjutnya ditambahkan larutan Fenol : Kloroform : Isoamilalkohol (PCI) dengan perbandingan 25:24:1 sebanyak 1000 ul dan di sentrifugasipada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan lalu dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan etanol 90% sebanyak 1000 ul dan Na asetat sebanyak 10 ul lalu di sentrifugasipada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pellet dikering anginkan sampai etanol menguap. DNA dilarutkan dengan menambahkan rehydration solution sebanyak 100 ul dan disimpan pada suhu 4oC selama semalam atau pada suhu 65oC selama 1 jam. Jika DNA belum akan digunakan dalam jangka waktu lama maka disimpan pada suhu – 20oC (Gambar 4).
Uji kualitas DNA
Uji kualitas DNA dilakukan dengan teknik elektroforesis. Pengujian ini pada prinsipnya adalah mengukur laju migrasi DNA pada gel agarose. Agarose 1% dilarutkan dalam buffer TBE 1x dan dipanaskan sampai mendidih dan larutan bewarna bening. Setelah itu larutan agarose hangat-hangat kuku dituangkan ke dalam cetakan gel yang telah dilengkapi sisir. Gel dibiarkan membeku dan sisir diambil secara hati-hati. Gel kemudian ditempatkan pada alat/tangki elektroforesis dengan posisi lubang berada pada posisi kutub negatif. Larutan buffer TBE1x dituang sampai gel terendam. DNA yang akan dianalisis dicampur dengan bromophenol blue 6x untuk menandai laju migrasi. Alat elektroforesis kemudian ditutup untuk dihubungkan dengan aliran listrik. Elektroforesis berlangsung pada 100 Volt selama 30 menit. setelah selesai penutup alat elektroforesis dibuka, gel agarose diambil kemudian direndam dalam larutan etidium bromida dengan konsentrasi final 0,5 µg/ml selama 15-30 menit dan selanjutnya dibilas dengan akuades. Hasil divisualisasi menggunakan ultra violet transluminator.
Amplifikasi DNA dengan teknik PCR
Sebelum amplifikasi DNA, dilakukan seleksi primer untuk mendapatkan jenis primer yang sesuai. Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan metode PCR dengan komposisi bahan sebagai berikut : 2 ul DNA genom hasil ekstraksi, 2 ul primer, 8,5 ul
distilled water dicampur dengan 12,5 ul master mix PCR Fermentas (komposisi : PCR buffer, enzim Taq polymerase, MgCl2 dan dNTP mix) sehingga total volume menjadi 25 ul. Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR yang sudah diprogram. Secara umum proses PCR terdiri dari tiga tahap yaitu denaturasi (penguraian
utas ganda DNA), penempelan primer (annealing) dan pemanjangan utas DNA
(elongasi). Pre-denaturasi dilakukan pada suhu 94oC selama 2 menit untuk memastikan kesempurnaan denaturasi, sedangkan denaturasi dilakukan pada suhu 94oC selama 1 menit, annealing pada suhu 36oC selama 1menit, dan elongasi pada suhu 72oC selama 2
menit. Elongasi akhir dilakukan pada suhu 72oC selama 7 menit untuk meyakinkan
proses elongasi berjalan sempurna, proses PCR ini berjalan sebanyak 35 siklus. Untuk mengetahui keberhasilan amplifikasi primer yang dicobakan, campuran 9 ul hasil PCR dengan 2 ul loading dye dielektroforesis pada gel agarose 2% (w/v) dalam larutan TBE dan tegangan 100 Volt selama 30 menit. Gel direndam dalam larutan etidium bromida
agar pita DNA dapat terlihat pada cahaya ultra violet untuk keperluan dokumentasi menggunakan kamera. Gene Ruler 100bp DNA ladder digunakan sebagai standar untuk menentukan ukuran fragmen hasil amplifikasi (Gambar 5).
Sampel 0.5-1 mg
(+) larutan lisis 500 ul
(+) Protein Kinase 15 ul
Vorteks
Inkubasi suhu 37oC sampai hancur
(+)Fenol:Kloroform:Isoamilalkohol (PCI) 1000 ul Sentrifugasi 10.000 rpm, 10 mnt Ambil supernatan (+) etanol 90% 1000 ul (+) Na asetat 10 ul sentrifuge 10.000 rpm, 10 mnt ambil pellet
kering anginkan sampai tdk ada etanol
(+) DNA rehydration sol. 100 ul, suhu 4oC 1 mlm/65oC 1 jam
Jk blm akan digunakan : elektroforesis Simpan suhu 2-8oC (short term)
Suhu –20oC (long term)
12.5 ul master mix Pure Taq Polymerase
(+)2 ul DNA template
(tergantung banyak atau tidaknya DNA) (+) 2 ul Primer
(+) 8.5 ul Aquades
spin atau sentrifuge 7000 rpm selama 1 mnt sampai gelembung hilang
dimasukkan ke dalam thermocycler PCR
94oC 2 mnt 94oC 1 mnt 36oC 1mnt 72oC 2 mnt 72oC 7 mnt 4oC 2 mnt DNA hasil PCR (+) 2 ul loading dye Ambil 9 ul
dimasukkan dalam sumur gel agarose 1% Running elektroforesis Hasil
Gambar 5. Diagram alir prosedur RAPD menggunakan teknik PCR
35 siklus
Pengumpulan Data Pendukung
Pengumpulan data pendukung dilakukan untuk mengetahui pengaruh lingkungan terhadap perubahan morfologi maupun genotip e ikan nilem. Pengaruh lingkungan yang diamati adalah: sistem budidaya (pemupukan, padat tebar, nutrisi) dan sistem rekrutmen (peremajaan). Pengumpulan data dilakukan melalui wawancara dengan pembudidaya di lokasi pengambilan sampel dan melalui data sekunder.
Tabel 1. Kriteria nilai mutu untuk sistem budidaya dan rekrutmen
Parameter Kriteria Nilai Mutu
3 2 1 0
Sistem Budidaya
Pemupukan Pupuk + kapur Pupuk atau
pengapuran saja
Tanpa pupuk atau pengapuran
Tidak diketahui Padat Penebaran per
kolam Jumlah padat penebaran disesuaikan ukuran ikan Jumlah padat penebaran sesuai dengan padat penebaran awal yg terbaik Jumlah padat penebaran tidak disesuaikan dengan kapasitas kolam Tidak diketahui Jenis Pakan yg diberikan
Pakan buatan Utama pakan alami
dan pakan buatan sebagai selingan
Pakan alami Tidak
diketahui Frekuensi pemberian pakan 2 kali sehari sesuai ukuran besarnya ikan
1 kali sehari tidak diberi pakan Tidak
diketahui
Pola budidaya Polikultur Monokultur Tidak
diketahui Jenis wadah
pemeliharaan
kolam air deras Karamba jaring
apung
Kolam Tidak
diketahui
Rekrutmen
Sumber induk beberapa lokasi satu lokasi - Tidak
diketahui Jumlah pasang
induk yang digunakan
100 pasang > 25 pasang < 25 pasang Tidak
diketahui Melakukan
pembenihan sendiri atau tidak
Analisis data
Parameter yang diukur dalam penelitian ini adalah keragaman genetik dan morfologi serta filogenetik dari ikan nilem yang ada di daerah Jawa Barat. Untuk mengukur parameter tersebut di atas, ada beberapa karakter yang dianalisis sebagai berikut:
1. Karakter fenotipe truss morfometrik dan meristik a. Rerata truss morfometrik
b. Rerata koefisien keragaman (CV) karakter truss morfometrik dan persentasi ukuran fenotipe meristik
c. Uji signifikansi dan korelasi
d. Analisis canonical discriminant dilakukan untuk mendapatkan pola penyebaran karakter morfologi ikan nilem
Zjk = a + W1X1k + W2X2k+...+WnXnk
Dimana :
Zjk = Nilai (skor) diskriminan dari responden (obyek) ke- i
a = Intercept
Xnk = Variabel independen n untuk objek ke-k
Wn = Koefisien atau timbangan diskriminan untuk variabel independen e. Analisis sharing component
f. Analisis hirarki cluster dilakukan untuk mendapatkan matriks jarak genetik dan dendogram populasi ikan nilem
Analisis data dilakukan menggunakan program software SPSS 11.5 2. Karakter genotip dengan RAPD
a. Derajat polimorfisme
P 0.95 = Jumlah lokus polimorfik x 100% Jumlah lokus total
n h = 1 – S Xi2 i=1 Dimana : h= heterozigositas n= jumlah sampel Xi2 = frekwensi alel ke –i
c. Jarak genetik D= -ln Jab (Ja x Jb)0.5 Dimana :
D = Jarak genetik
Jab = frekwensi haplotipe pada lokus populasi yang sama Ja dan Jb = frekwensi haplotipe pada populasi A dan B
Untuk menentukan jarak genetik dan pembuatan dendrogram dilakukan dengan
metode Unweight Pair Group Methods Arithmetic (UPGMA), data biner
dianalisis dengan menggunakan program komputer Tools For Population
Genetic Analysis (TFPGA) (Miller, 1997).
3. Data Pendukung