IV.5 Kekerabatan terdekat Sampel Mikroba Kawah Hujan
IV.5.1 Kekerabatan terdekat sampel Kawah Hujan A
Gambar IV.17 Elektroforegram hasil reamplifikasi gel DGGE tanpa pita.
(1-2) posisi di antara pita-pita; (3) kontrol negatif; (4,7) posisi di bawah pita terendah; (5) posisi di atas pita tertinggi; (6) posisi di antara pita dari kultur koloni tunggal; (8) marker pUC/HinfI.
IV.5 Kekerabatan terdekat Sampel Mikroba Kawah Hujan
Analisis filogenetik dimaksudkan untuk melihat hubungan kekerabatan terdekat antara urutan fragmen gen 16S rRNA sampel dengan urutan DNA mikroba yang sudah ditemukan saat ini. Terhadap urutan DNA sampel dilakukan penjajaran dengan data nukleotida yang ada di GenBank dengan menggunakan program BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Semua urutan DNA yang menunjukkan kemiripan tertinggi dengan urutan sampel pada hasil penjajaran dijadikan sebagai urutan pembanding pada pembuatan pohon filogenetik. Metode yang dipakai dalam penyusunan pohon filogenetik adalah metode jarak melalui program DNADIST (Phylip versi 3.6) dengan menggunakan model F84 untuk model substitusi nukleotida.
IV.5.1 Kekerabatan terdekat sampel Kawah Hujan A
IV.5.1.1. Kekerabatan terdekat sampel hasil filtrasi dari Kawah Hujan A
Berdasarkan pendekatan filogenetik molekular yang digunakan pada penelitian ini, komunitas mikroba yang terdeteksi ada pada Kawah Hujan A menunjukkan diversitas yang rendah. Semua urutan fragmen gen 16S dari sampel Kawah Hujan A tanpa kultivasi yang diperoleh melalui lisis sel enzimatik maupun bead-beating menunjukkan kedekatan dengan kelompok bakteri. Urutan DNA dari metode lisis sel enzimatik sebagian besar membentuk cluster paling dekat dengan gamma Proteobakteria dan satu urutan berada di antara gamma dan beta Proteobakteria
1 2 3 4 5 6 7 8 1419 517 396 214 pb
(Gambar IV.18). Hasil yang hampir sama ditunjukkan oleh urutan DNA yang dilisis dengan metode bead-beating (Gambar IV.19). Kemiripan hasil analisis filogenetik menunjukkan bahwa kedua metode lisis sel yang digunakan tidak memberikan perbedaan yang signifikan dalam mendeteksi ragam mikroba dari sampel Kawah Hujan A.
Hasil penjajaran urutan nukleotida di antara sampel Kawah Hujan A yang membentuk satu cluster pada pohon filogenetik, baik hasil lisis sel secara enzimatik maupun bead-beating, menunjukkan variasi yang cukup tinggi (Gambar IV.20A-B). Pada umumnya perbedaan di antara urutan-urutan nukleotida tersebut mencapai 4% atau lebih dan terjadi di daerah variabel V7 dan V8. Beberapa perbedaan yang teramati di luar daerah variabel V7 dan V8 juga tidak terjadi di daerah lestari, kecuali untuk sampel K6 dan Z7 yang menunjukkan perbedaan satu basa di daerah lestari (ditunjukkan oleh arah panah pada Gambar IV.20A-B). Posisi daerah variabel dan daerah lestari pada gen 16S rRNA E. coli dapat dilihat pada Lampiran E.
Variasi urutan yang cukup besar teramati juga pada hasil penjajaran urutan DNA sampel dengan urutan DNA mikroba kelompok gamma Proteobakteria pembanding yang berdekatan pada pohon filogenetik (Gambar IV.21). Perbedaan urutan terutama teramati pada daerah variabel V7 maupun V8, dan beberapa urutan variabel di luar V7 dan V8 kecuali untuk sampel K6 dan Z7 yang secara konsisten menunjukkan perbedaan di daerah lestari.
Gambar IV.18 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rRNA sampel filtrasi Kawah Hujan A dengan metode lisis sel enzimatis
Gambar IV.19 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rRNA sampel filtrasi Kawah Hujan A dengan metode lisis sel bead-beating
Gambar IV.20. Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rRNA sampel Kawah Hujan A hasil filtrasi
(A) sampel hasil lisis sel secara enzimatis; (B) sampel hasil lisis sel dengan bead-beating. Daerah berwarna abu-abu merupakan domain variabel V7dan V8. Tanda panah hitam menunjukkan perbedaan urutan sampel di daerah lestari A B V7 V8 V7 V8
Gambar IV.21 Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rRNA sampel filtrasi Kawah Hujan A dengan urutan pembanding
Daerah variable V7 dan V8 ditunjukkan dengan warna abu-abu. Perbedaan urutan sampel di daerah lestari (conserved) ditunjukkan dengan kotak. Tanda titil (.) menunjukkan urutan nukleotida yang sama.
V7
Di dalam sel, gen 16S rRNA biasanya berjumlah lebih dari satu kopi (multi copy). Variasi urutan nukleotida dari masing-masing kopi dapat berbeda-beda (Case et al., 2007). Salah satu contoh hasil penjajaran gen 16S rRNA multi kopi yang diambil dari urutan genom lengkap spesies Geobacillus kaustophilus dan Methylococcus capsulatus pada posisi yang bersesuaian dengan urutan sampel menunjukkan hampir tidak ada perbedaan (Gambar IV.22). Pada spesies Geobacillus kaustophilus dari 9 multi kopi fragmen gen 16S rRNA, 7 kopi memiliki urutan nukleotida yang sama, satu kopi menunjukkan perbedaan satu basa dan satu kopi lainnya terdapat 4 nukleotida yang berbeda. Sedangkan 2 kopi pada Methylococcus capsulatus menunjukkan urutan yang sama.
Gambar IV.22 Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rRNA multi kopi. (A) Geobacillus kaustophilus; (B) Methylococcus capsulatus
Berdasarkan kemiripan urutan multi kopi fragmen gen 16S rRNA pada satu spesies, perbedaan urutan nukleotida di antara sampel mengindikasikan bahwa
A
urutan fragmen gen 16S rRNA tersebut bukan berasal dari organisme yang sama. Variasi urutan yang terjadi di daerah variabel dapat menunjukkan perbedaan pada level genus atau spesies. Perbedaan urutan yang cukup tinggi antara sampel Kawah Hujan A dengan pembanding menunjukkan bahwa mikroba yang teridentifikasi dari sampel Kawah Hujan A berbeda dengan mikroba yang sudah terkulturkan saat ini walaupun masih berada dalam kelas yang sama, yaitu gamma Proteobakteria. Adanya perbedaan di daerah lestari memperbesar kemungkinan bahwa mikroba yang terdeteksi pada sampel Kawah Hujan A merupakan mikroba yang khas dan berbeda dengan yang sudah terdeteksi dari tempat lain.
Seperti yang sudah disebutkan sebelumnya, Kawah Hujan A memiliki temperatur dan tekanan tinggi. Kondisi tersebut dan letak sumber air yang berada di bawah permukaan tanah menyebabkan Kawah Hujan A kemungkinan besar merupakan habitat yang anoksik. Dengan demikian, mikroba yang hidup dominan pada habitat tersebut, selain bersifat termofilik diduga bersifat anaerob dan memiliki toleransi terhadap tekanan (barotoleran). Pada sel mikroba, temperatur dan tekanan tinggi akan mempengaruhi fisiologi dan biokimia sel seperti struktur dan aktivitas membran dan proteinnya (Madigan dan Martinko, 2006). Keunikan kondisi Kawah Hujan A diduga akan menyebabkan mikroba yang terdeteksi pada kawah tersebut juga bersifat unik. Dugaan ini diperkuat dengan hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rRNA sampel yang menunjukkan perbedaan dibandingkan dengan urutan yang sudah ditemukan saat ini.
Keterbatasan diversitas komunitas Kawah Hujan A yang hanya didominasi oleh kelompok gamma Proteobakteria kemungkinan karena hanya mikroba yang mampu menempel pada batuan dan sedimen yang dapat bertahan hidup dalam arus bertekanan tinggi dengan sumber nutrisi yang rendah. Habitat dengan kondisi berarus seperti di aliran Octopus Spring dan Calcite Springs juga menunjukkan diversitas mikroba yang rendah. Octopus Spring didominasi oleh bakteri pink filament dan cyanobacteria (Reysenbach et al., 1994; Ferris et al., 1996; Huber et al., 1998) sedangkan Calcite Springs didominasi oleh archaea (Reysenbach et al., 2000). Kedua tempat tersebut berada di Yellowstone National Park, USA.
Kelompok gamma Proteobakteria beberapa spesiesnya dikenal karena bersifat pathogen. Akan tetapi, pada saat ini gamma Proteobakteria banyak terdeteksi pada lingkungan termal seperti sumber air panas (Baker et al., 2001; Ghosh et al., 2003; Khalil et al., 2006) dan lubang hidrotermal (Hou et al., 2004), dan juga pada batuan bertekanan sangat tinggi (Zhang et al., 2005). Selain itu, gamma Proteobakteria seringkali merupakan kelompok bakteri utama yang terkulturkan dari bawah permukaan tanah (Biddle et al., 2005), dan beberapa diketahui merupakan bakteri pengoksidasi besi (Edwards, et al., 2003; Dhugana et al., 2007).
IV.5.1.2. Kekerabatan terdekat sampel hasil kultivasi dari Kawah Hujan A
Biodiversitas mikroba dari sampel Kawah Hujan A yang ditumbuhkan dalam beberapa media kompleks berbeda dengan kelompok mikroba yang terdeteksi pada hasil filtrasi. Sebagian besar urutan fragmen gen 16S rRNA dari mikroba yang ditumbuhkan dalam media berbeda membentuk cluster yang dekat dengan Anoxybacillus, dua urutan lebih dekat dengan Geobacillus, dan satu dekat dengan Thermus (Gambar IV.23). Anoxybacillus dan Geobacillus keduanya termasuk dalam filum Firmicutes, sedangkan Thermus termasuk filum Deinococcus.
Gambar IV.23 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rRNA sampel Kawah Hujan A hasil kultivasi dalam beberapa media
Gambar IV.24 Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rRNA sampel Kawah Hujan A hasil kultivasi
(A) dekat dengan Anoxybacillus; (B) dekat dengan Geobacillus; (C) dekat dengan Thernus. Daerah hipervariabel V7dan V8 ditunjukkan dengan kotak abu-abu. Perbedaan urutan sampel di daerah lestari ditunjukkan dengan panah.
A B C V7 V8 V7 V8
Hasil penjajaran urutan nukleotida sampel dengan mikroba pembanding terdekatnya menunjukkan adanya perbedaan, baik dari kelompok urutan yang membentuk cluster dengan Anoxybacillus, Geobacillus, maupun Thermus (Gambar IV.24). Perbedaan urutan sampel yang dekat dengan kelompok Anoxybacillus terutama berada pada daerah variabel V7. Dua sampel (PB2 dan T3) memperlihatkan perbedaan satu basa di daerah lestari (Gambar IV.24A). Perbedaan urutan sampel yang dekat dengan kelompok Thermus dan Geobacillus tidak sebanyak kelompok Anoxybacillus. Perbedaan hanya teramati pada beberapa basa saja di daerah variabel. Dalam pohon filogenetiknya, urutan sampel yang dekat dengan kelompok Anoxybacillus membentuk cluster berbeda terhadap kelompok Anoxybacillus yang sudah terkulturkan.
Berdasarkan hasil penjajaran urutan nukleotida, mikroba yang terdeteksi dekat dengan Thermus (Gambar IV.24B) dan Geobacillus (Gambar IV.24C) kemungkinan memiliki kedekatan yang sangat tinggi dengan Thermus dan Geobacillus yang sudah diisolasi saat ini. Sedangkan untuk sampel yang memiliki kedekatan dengan Anoxybacillus yang menunjukkan perbedaan urutan nukleotida cukup tinggi dibandingkan dengan urutan pembanding kemungkinan merupakan galur berbeda dengan yang sudah ada saat ini.
Keberadaan Geobacillus dan Anoxybacillus pada Kawah Hujan A tidak mengherankan karena kedua organisme ini banyak ditemukan pada area geotermal (Pikuta et al., 2000; Baker et al., 2001; Belduz et al., 2003; Indrajaya dkk, 2003; McMullan et al., 2004; Akhmaloka et al., 2006; Pavlostathis et al., 2006; Faiz et al., 2007). Geobacillus dan Anoxybacillus merupakan bakteri gram positif berbentuk batang, dapat berspora, dan dapat menggunakan banyak macam sumber karbon untuk pertumbuhan secara heterotrop atau autotrop. Geobacillus bersifat aerobik dan anaerobik fakultatif, sedangkan Anoxybacillus bersifat anaerobik dan anaerobik fakultatif. Penanganan sampel yang bersifat aerobik tanpa aerasi masih memungkinkan untuk menumbuhkan mikroba yang bersifat aerob maupun anaerob fakultatif (Madigan dan Martinko, 2006).
Keberadaan genus Thermus pada lingkungan termal juga telah banyak dilaporkan. Bakteri ini telah ditemukan pada sumber air panas (Nunes et al., 1995; Brock, 1998), area di bawah permukaan tanah (Marteinsson et al., 2001; Kieft et al., 1999). Sebagian besar strain Thermus bersifat aerobik obligat, beberapa bersifat anaerobik fakultatif dan dapat menggunakan O2, NO3-, Fe (III), dan S0 sebagai akseptor elektron akhir (Kieft et al., 1999).