IV.5 Kekerabatan terdekat Sampel Mikroba Kawah Hujan
IV.5.2 Kekerabatan terdekat sampel Kawah Hujan B
Kawah Hujan B bersifat sangat asam dengan kadar sulfat sangat tinggi dan kandungan Fe yang cukup tinggi, seperti yang sudah disampaikan pada bagian sebelumnya. Pada saat ini, mikroba termofilik yang toleran terhadap asam telah banyak terdeteksi dari bermacam-macam habitat seperti sumber air geothermal, kolam lumpur, dan lubang bawah laut (deep-sea vents) (Cleaver et al., 2007; Boyd et al., 2007; Kozubal et al., 2008). Beberapa di antara mikroba-mikroba tersebut menggunakan senyawa anorganik tereduksi, seperti hidrogen, sulfida, sulfur, tiosulfat, metana, atau Fe(II) sebagai sumber energi untuk metabolismenya (Kozubal et al., 2008).
IV.5.2.1. Kekerabatan terdekat sampel hasil filtrasi dari Kawah Hujan B
Berdasarkan hasil analisis filogenetik, pada sampel Kawah Hujan B terdeteksi adanya mikroba dari kelompok bakteri dan archaea, baik dari hasil lisis sel secara enzimatis maupun dengan cara bead-beating. Dari hasil lisis sel secara enzimatis, sebagian besar urutan fragmen gen 16S rRNA membentuk cluster yang dekat dengan filum Crenarchaeote (archaea) dan satu urutan dekat dengan Glacial ice bacterium dari kelas gamma Proteobakteria (bakteri) (Gambar IV.25). Sedangkan sebagian besar mikroba sampel Kawah Hujan B yang dilisis dengan cara bead-beating termasuk ke dalam kelas gamma Proteobakteria. Hanya 3 urutan yang membentuk cluster yang dekat dengan Crenarchaeote. Pada kelompok gamma Proteobakteria, tiga urutan dekat dengan Aeromonas, dua urutan dekat dengan Pantoea atau Enterobacter, dan dua urutan cenderung dekat dengan Aeromonas atau Xenorhabdus (Gambar IV.26).
Gambar IV.25 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rRNA sampel filtrasi Kawah Hujan B dengan metode lisis sel enzimatis
Gambar IV.26 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rRNA sampel filtrasi Kawah Hujan B dengan metode lisis sel bead-beating.
Hasil penjajaran urutan nukleotida di antara sampel yang membentuk cluster dengan archaea pada sampel filtrasi dengan metode enzimatis menunjukkan variasi yang cukup tinggi. Perbedaan urutan menyebar hampir di semua bagian fragmen gen 16S rRNA. Variasi urutan juga terlihat pada hasil penjajaran sampel dengan urutan pembanding yang paling dekat, yaitu archaea dari filum Crenarchaeota. Perbedaan urutan tidak hanya terlihat di daerah variabel, tetapi juga terlihat di daerah-daerah yang lestari. Beberapa perbedaan di daerah lestari maupun di daerah variabel konsisten di antara sampel dibandingkan dengan urutan pembanding. Di daerah V7 terlihat cukup banyak perbedaan yang mengelompok antara urutan sampel dibandingkan dengan urutan pembanding, demikian juga di luar daerah variabelnya (Gambar IV.27).
Pada sampel yang memiliki kedekatan dengan kelas gamma Proteobakteria, perbedaan urutan terutama terlihat pada daerah variabel V7 dan V8. Hasil penjajaran ditunjukkan pada Gambar IV.28. Beberapa variasi juga terlihat di luar daerah V7 dan V8, akan tetapi sebagian besar merupakan urutan yang variabel. Beberapa perbedaan basa pada sampel berada di daerah lestari.
Berdasarkan hasil penjajaran di atas, sampel filtrasi Kawah Hujan B yang dekat dengan kelompok archaea menunjukkan perbedaan yang sangat besar dibandingkan dengan urutan kelompok Crenarchaeota pembandingnya. Hal ini menjadi indikasi bahwa kelompok archaea pada sampel Kawah Hujan B sangat berbeda dengan archaea yang sudah dikulturkan atau terdeteksi saat ini. Sedangkan sampel yang dekat dengan kelas gamma Proteobakteria lebih menunjukkan kedekatan dengan mikroba yang sudah teridentifikasi saat ini, walaupun kemungkinan merupakan organisme yang unik dari kelas gamma Proteobakteria.
Gambar IV.27 Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rRNA sampel Kawah Hujan B hasil filtrasi menggunakan metode lisis enzimatis dengan urutan nukleotida pembandingnya.
Daerah hipervariabel V7dan V8 ditunjukkan dengan kotak abu-abu.
V7
Gambar IV.28. Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rRNA sampel Kawah Hujan B hasil filtrasi menggunakan metode lisis enzimatis dengan urutan pembanding dari kelas gamma Proteobakteria
Daerah hipervariabel V7 dan V8 ditunjukkan dengan kotak abu-abu. Perbedaan urutan sampel di daerah lestari ditunjukkan dengan panah.
Dugaan bahwa pada sampel Kawah Hujan B terdapat mikroba dari kelompok archaea yang khas diperkuat dengan hasil penjajaran urutan nukleotida sampel dari metode lisis bead-beating dengan urutan pembanding yang paling dekat (Gambar IV.29A). Seperti halnya sampel Kawah Hujan B yang dilisis secara enzimatis, urutan nukleotida yang dekat dengan archaea menunjukkan perbedaan yang sangat tinggi terhadap urutan pembandingnya. Perbedaan tersebut tersebar di sepanjang fragmen gen 16S rRNA, baik di daerah variabel maupun di daerah lestari.
Variasi urutan cukup tinggi terlihat juga pada sampel yang dekat dengan Aeromonas (Gambar IV.29B). Perbedaan di daerah variabel V7 maupun V8 terlihat cukup banyak. Perbedaan juga teramati pada bagian awal fragmen gen 16S rRNA, sebelum daerah variasi V7. Pada bagian tersebut sebagian besar merupakan daerah dengan urutan yang lestari. Di antara semua sampel filtrasi Kawah Hujan B, sampel yang dekat dengan Pantoea/Enterobacter memiliki kemiripan urutan yang paling tinggi terhadap urutan pembandingnya.
Berdasarkan hasil analisis filogenetik sampel filtrasi Kawah Hujan B yang diperoleh dari metode lisis enzimatis menunjukkan diversitas yang sedikit berbeda dibandingkan dengan metode bead-beating. Mikroba-mikroba yang memiliki kedekatan dengan Aeromonas dan Pantoea/Enterobacter yang terdeteksi dengan metode lisis bead-beating tidak terdeteksi dengan metode enzimatis. Sebaliknya, sampel yang memiliki kedekatan dengan Glacial ice bacterium/Pseudomonas yang terdeteksi dengan metode enzimatis, tidak terdapat pada sampel dengan lisis secara bead-beating. Yang konsisten dari kedua metode tersebut adalah dapat mengidentifikasi keberadaan archaea walaupun dengan jumlah sampel yang berbeda.
Gambar IV.29AHasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rRNA sampel Kawah Hujan B hasil filtrasi menggunakan lisis sel bead-beating yang dekat dengan kelompok archaea.
Daerah hipervariabel V7dan V8 ditunjukkan dengan kotak abu-abu. Tanda titil (.) menunjukkan urutan nukleotida yang
A V7
Gambar IV.29B Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rRNA sampel Kawah Hujan B hasil filtrasi menggunakan lisis sel bead-beating yang dekat dengan Aeromonas
Daerah hipervariabel V7dan V8 ditunjukkan dengan kotak abu-abu. Tanda titil (.) menunjukkan urutan nukleotida yang sama.
B V7
Kondisi fisik Kawah Hujan B yang berada di permukaan tanah dengan temperatur tinggi merupakan lingkungan yang memiliki kontak yang relatif luas dengan oksigen. Walaupun demikian, kelarutan oksigen pada temperatur tinggi relatif kecil. Berdasarkan sifat kimianya, Kawah Hujan B memiliki pH yang sangat asam dengan kandungan sulfat tinggi. Dengan demikian, berdasarkan kondisi fisik dan kimia lingkungannya, Kawah Hujan B merupakan habitat potensial bagi kelompok mikroba yang bersifat aerob atau fakultatif anaerob, termofilik, dan asidofilik, serta menggunakan senyawa sulfur atau sulfida sebagai sumber energi metabolismenya (Madigan dan Martinko, 2006).
Keberadaan Crenarchaeota pada habitat Kawah Hujan B diduga berhubungan dengan kondisi fisik dan kimia lingkungannya. Crenarchaeota termasuk kelompok archaea yang banyak ditemukan pada lingkungan sangat ekstrim (Boyd et al., 2007; Kozubal et al., 2008). Sebagian besar Crenarchaeota merupakan hipertermofilik yang diisolasi dari laut atau area vulkanik. Beberapa spesies merupakan termoasidofil yang tinggal pada lingkungan dengan konsentrasi sulfat yang tinggi (Boyd et al., 2007). Crenarchaeota bersifat aerob, anearob fakultatif dan anaerob, kemoorganotrop maupun litotrop, dan beberapa menggunakan sulfur sebagai sumber energi metabolismenya (Bintrim et al. 1997; DeLong et al. 1994; Furhman et al.1992; Hersberger et al.1996).
IV.5.2.2. Kekerabatan terdekat sampel hasil kultivasi dari Kawah Hujan B
Sampel Kawah Hujan B telah dikulturkan dalam beberapa macam media kaya (media P, PB, dan ¼ LB). Berdasarkan hasil analisis filogenetik, mikroba yang terdeteksi pada kultur dalam media yang berbeda menunjukkan diversitas berbeda. Pada media P, semua sampel memiliki kedekatan dengan kelas gamma Proteobakteria. Sebagian besar urutan sampel memiliki kedekatan dengan Pantoea/Enterobacter, tiga urutan membentuk cluster berbeda, dan satu urutan paling dekat dengan Pseudomonas (Gambar IV.30).
Gambar IV.30 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rRNA sampel Kawah Hujan B hasil kultivasi dalam media P
Berbeda dengan kultur dalam media P, kultur mikroba dalam media PB sebagian besar memiliki kedekatan dengan Alicyclobacillus dari filum Firmicutes. Hanya tiga sampel yang dekat dengan kelompok gamma Proteobakteria, dan dua di antaranya dekat dengan Pantoea/Enterobacter (Gambar IV.31). Keberadaan sampel yang dekat dengan Alicyclobacillus juga terdeteksi dalam kultur yang ditumbuhkan dalam media ¼ LB (Gambar IV.32). Empat urutan sampel dalam media ¼ LB cenderung membentuk cabang dekat dengan kelompok Alicyclobacillus, dan hanya satu urutan yang berada di antara klas gamma Proteobacterium.
Gambar IV.31 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rRNA sampel Kawah Hujan B hasil kultivasi dalam media PB
Gambar IV.32 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rRNA sampel Kawah Hujan B hasil kultivasi dalam media ¼ LB
Hasil penjajaran urutan sampel dalam media P yang dekat dengan Pseudomonas menunjukkan beberapa perbedaan, terutama pada daerah variabel V7, dibandingkan dengan urutan DNA pembanding dari GenBank yang telah diketahui sebelumnya. Beberapa variasi urutan di luar daerah V7 pada umumnya merupakan urutan yang variabel. Hanya satu basa yang berbeda di daerah lestari (Gambar IV.33). Berdasarkan hasil penjajaran tersebut, Pseudomonas yang terdeteksi dalam kultur media P kemungkinan merupakan spesies atau galur baru yang berbeda.
Gambar IV.33 Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rRNA sampel kultivasi Kawah Hujan B dalam media P dengan urutan pembanding
Hasil penjajaran urutan sampel kultur dalam media ¼ LB yang dekat dengan Alicyclobacillus menunjukkan perbedaan cukup besar terutama di daerah variabel V7 dan V8 (Gambar IV.34A). Pada umumnya perbedaan antara urutan sampel dengan urutan pembanding mengelompok di antara sampel. Sampel yang berada di antara kelompok gamma Proteobakteria pada kultur ¼ LB tidak menunjukkan perbedaan yang berarti dengan urutan pembandingnya yang paling dekat, yaitu uncultured gamma Proteobakteria (Gambar IV.34B).
Gambar IV.34A Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rRNA sampel Kawah Hujan B hasil kultivasi dalam media ¼ LB dengan pembandingnya yang dekat dengan Alicyclobacillus
Daerah hipervariabel V7dan V8 ditunjukkan dengan kotak abu-abu. Tanda titil (.) menunjukkan urutan nukleotida yang sama.
V8 V7
Gambar IV.34B Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rRNA sampel Kawah Hujan B hasil kultivasi dalam media ¼ LB dan pembandingnya yang dekat dengan kelas gamma Proteobakteria
Daerah hipervariabel V7dan V8 ditunjukkan dengan kotak abu-abu. Tanda titil (.) menunjukkan urutan nukleotida yang sama.
V7
Berdasarkan hasil analisis filogenetik, komunitas mikroba yang terdeteksi dalam kultur berbeda dengan komunitas yang terdeteksi dari sampel filtrasi. Pada kultur terdeteksi mikroba dari filum Firmicutes (Alicyclobacillus) yang tidak terlihat pada sampel hasil filtrasi. Demikian juga, kelompok archaea yang dominan pada sampel filtrasi tidak terdeteksi pada kultur. Hal ini kemungkinan karena media yang digunakan untuk kultivasi tidak sesuai bagi pertumbuhan archaea. Dari hasil penjajaran antara urutan nukleotida sampel dengan urutan pembanding, untuk mendapatkan mikroba yang berbeda dengan isolat yang sudah ada saat ini sangat memungkinkan terutama untuk genus Alicyclobacillus.