METODE PENELITIAN
7. KOH standar (misal larutan KOH 2 N)
Sebanyak 112,2 g KOH ditimbang dan dilarutkan menjadi 1000 ml dengan aquades. Larutan disimpan di udara terbuka selama 2 hari lalu dikalibrasi.
Kalibrasi: Asam oksalat ditimbang ± 0,01 g lalu ditambah aquades dan 3 tetes indikator PP. Larutan diaduk sampai larut. Kemudian dititrasi dengan larutan KOH 0,2 N sampai berwarna merah jambu.
8. NaHCO3
NaHCO3 setara x gr KOH ditimbang dan diencerkan sampai 100 ml dengan aquades bebas ion.
Prinsip analisis
Fe, Zn, Ca, dan P pada sampel dihidrolisis dari ikatannya dengan protein menggunakan enzim-enzim pencernaan yang terdapat di lambung dan usus halus. Mineral bebas yang terdapat dalam larutan sampel akan berdifusi melalui membran semipermeabel ke dalam kantung dialisis yang berisi buffer NaHCO3. Mineral dalam dialisat menunjukkan jumlah mineral yang diserap tubuh.
Prosedur
N KOH = mg asam oksalat ml titrasi x 63,037
Kebutuhan NaHCO3 = N KOH x 56,1 x ml titrasi x T1 x 100
1000 T2 20 = x gr KOH
Sejumlah sampel dihaluskan dengan blender. Sampel setara 2 g protein ditimbang dalam gelas piala yang diketahui beratnya. Selanjutnya ditambah aquades bebas ion sampai 100 g, apabila terlalu kental dapat ditambah air sampai didapat kekentalan yang bisa diaduk. pH diatur menjadi 2.0 dengan HCl 4 N. gelas piala bersama sampel ditimbang (A): T1 ± 20 g untuk analisis bioavailability serta T2 ± 20 g untuk menghitung total asam tertitrasi. Sampel pada T1 dan T2 ditambah suspensi pepsin 1 ml lalu diinkubasi 37ºC selama 2 jam. Setelah itu sampel dimasukkan ke freezer.
Sampel T2 (total asam tertitrasi) di-thawing dalam shaker water bath dengan suhu 37º C. Sampel ditambah 5 ml pankreatin bile lalu ditambah indikator PP. Setelah itu dititrasi dengan KOH standar sampai berwarna merah jambu. Kantung dialisis sepanjang ± 15 cm dipotong lalu direndam dalam air bebas ion kemudian diikat salah satu ujungnya. Setelah itu diisi dengan 20 ml larutan NaHCO3 hasil perhitungan. Salah satu ujung kantung dialisis kemudian diikat, usahakan tidak ada gelembung. Kemudian direndam dengan sisa larutan NaHCO3 dalam gelas piala 200 ml.
Sampel T1 (sampel bio) di-thawing dalam shaker water bath dengan suhu 37º C. Kantung dialisis dimasukkan dalam T1 lalu diinkubasi pada suhu 37º C selama 30 menit. Setelah itu ditambah ± 5 ml pankreatin bile dan diinkubasi kembali pada suhu 37º C selama 2 jam. Kantung dialisis diangkat. Ikatan kantung dialisis dibuka, isinya dituangkan dalam gelas piala atau erlenmeyer 100 ml bebas ion yang sudah diketahui beratnya. Bagian dalam kantung dicuci dengan air bebas ion. Kemudian dialisat ditimbang dan dicatat. Dialisat ditambah 10 ml H2SO4 pekat dan 10 ml HNO3 pekat. Dialisat didiamkan selama semalam. Setelah itu ditambah H2O bebas ion dan dipanaskan sampai jernih. Kemudian dialisat diencerkan dalam labu 50 ml.
Perhitungan
Total mineral dalam dialisat = (ppm sampel – blanko) x aliquot x fp x total dialisat 1000 gr dial analisis ana
Total mineral dalam sampel bio (mg/100 g) = gr sampel bio x total Ca, Fe, Zn x 100 gr sampel setara 2 g protein + air (A)
% bioavailability = total mineral dalam dialisat (mg) x 100 total mineral dalam sampel bio (mg)
Uji Antioksidan dengan DPPH a. Ekstraksi dengan pelarut Aseton (Awika et al. 2003)
Sampel sebanyak 10 gram ditempatkan dalam botol sentrifuse, selanjutnya ditambahkan 100 ml aseton 70 %. Sampel di shaker dengan kecepatan 350 rpm selama 2 jam pada suhu kamar, kemudian disimpan pada suhu -20o C ditempat gelap selama 24 jam. Setelah 24 jam larutan di equilibrium selama 1 jam pada suhu ruang. Larutan selanjutnya di sentrifuse selama 30 menit pada kecepatan 3000 rpm. Residu sampel selanjutnya dicuci sebanyak 4 kali dengan menambahkan aseton 70 %, selanjutnya di shaker selama 1 jam dan disentrifuse kembali selama 30 menit pada 3000 rpm. Lima supernatan yang diperoleh ditampung pada Erlenmeyer, disaring dengan kertas saring whatman no. 41 dengan bantuan pompa vakum, kemudian dikeringkan dengan rotary evaporator pada suhu 40o C untuk menguapkan aseton. Larutan sisa pengeringan dengan rotary evaporator selanjutnya dikeringkan kembali dengan menggunakan freeze dryer pada suhu -75o C. Ekstrak kering hasil freeze dryer yang didapat selanjutnya dibuat sebagai larutan stok uji konsentrasi 200 mg/ml pelarut.
b. Uji Anti Radikal Bebas DPPH (Kubo et al. 2002)
Buffer asetat 100 mM (pH 5.5) sebanyak 1.5 ml ditempatkan pada tabung reaksi, kemudian ditambahkan 2.85 ml etanol PA, 1 ml DPPH 10 mM dalam methanol 0.020 ml ekstrak bekatul. Campuran divorteks dan disimpan pada ruang gelap dengan suhu kamar selama 20 menit. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 517 nm. Sebagai standar digunakan asam askorbat dengan konsentrasi 0; 6.25; 12.5; 25; 50; dan 100 mg/l. satuan aktivitas antioksidan dinyatakan dalam AEAC (Asorbic acid Equivalent Antioxidant Capacity). Bagan alir prosedur analisis antioksidan dan pembuatan standar vitamin C dapat dilihat pada lampiran 1. Aktifitas penangkapan radikal bebas dihitung sebagai presentase berkurangnya warna DPPH dengan menggunaka persamaan :
Aktivitas antioksidan (%) = {(A0-A1)/A0} x 100% Keterangan : A0 = Absorbansi Kontrol
A1 = Absorbansi sampel
Vit C standar (mg) = konsentrasi Vit C (mg/l) x volume sampel AEAC (mg/g) = (persen aktivitas antioksidan – b)/a
Keterangan : a & b berasal dari persamaan garis y=28.764x-0.1665 (kurva standar vitamin C)
AEAC (mg vit C/100 g) =
Dibuat kurva standar asam askorbat dengan perbandingan antara kapasitas (%) dan konsentrasi asam askorbat (ppm). Antioksidan pada ekstrak bekatul dinyatakan dalam mg vitamin C equvalen/100 g berat sampel. Nilai tersebut menunjukan kesetaraan aktivitas antioksidan 100 gram bekatul dengan 1 mg vitamin C dalam hal mereduksi radikal bebas. Kurva standar pengukuran aktivitas antioksidan dengan standar vitamin C dapat dilihat pada lampiran 2.
Analisis Vitamin E Metode HPLC
Timbang 2 gram sampel dan masukan kedalam tabung sentrifuge 50 ml, ditambahkan 5 ml etanol-ascorbic acid 0.1 % dan 4 ml KOH 50 %. Kemudian sampel dipanaskan pada suhu 70o C selama 30 menit, lalu dikocok dengan menggunakan vortex selam 10 menit. Setelah dipanaskan sampel kemudian didinginkan. Setelah dingin lalu ditambahkan 5 ml n-hexane kemudian kocok selam 5 menit. Diamkan beberapa saat sampai larutan terpisah.
Pisahkan n-hexane kedalam gelas kimia. Kemudian ditambahkan 1 ml methanol-ascorbic acid 0.1 % atau larutan BHT 0.01 %. lakukan hal ini berulang samapai sampel terekstraksi semua. Setelah terkumpul, n-hexane diuapkan sampai kering diruangan atau tepat yang gelap. Hasil yang didapat kemudian dilarutkan dengan methanol HPLC grade. Larutan kemudian dipindahkan kedalam labu ukur 50 ml, kemudian himpitkan dengan methanol dan homogenkan. Hasil itu kemudian disaring dengan filter 0.45 µm. Hasil saringan
dimasukan kedalam vial aotosampler, kemudian disuntikan 20 µl kesistem
kromatografi pada kondisi oktadesilsilana (RP-18); laju alir : 0.7 ml/menit; λ :292 nm; FG = Methanol :dapar fosfat (4:96). Langkah diatas berlaku untuk blanko. Perhitungan :
Keterangan :
Csp : konsentrasi contoh µg/g (ppm) Asp : area contoh
Ast : area standar
Cst : konsentrasi standar µg/g (ppm) Vsp : volume pelarut sampel (ml) Wsp : bobot contoh (g)
Analisis Oryzanol Metode Spektofotometri Persiapan larutan standar
Ditimbang sejumlah standar oryzanol dan dilarutkan dengan etanol sehingga diproleh konsentrasi standar oryzanol 10; 12.5; 15; 17,5; 20 ppm. Kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 328 nm.
Persiapan larutan sampel
Ditimbang sejumlah sampel bubuk bekatul awet dan masukan kedalam labu takar 25 ml. Kemudian masukan etanol sampai batas tera lalu kocok. Larutan kemudian disaring dengan kertas saring wathman 42. Hasil saringan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 328 nm.
Organoleptik Bahan Baku Bubuk Bekatul Awet
Tujuan dari organoleptik bahan baku serbuk bekatul awet ini yaitu untuk mendapatkan bahan baku yang berkualitas tinggi dan sesuai dengan penerimaan panelis. Organolpetik bahan baku ini meliputi uji mutu hedonik dan hedonik (kesukaan). Atribut yang digunakan pada uji organoleptik ini yaitu aroma, kekentalan, rasa, bau/odor, dan warna. Skala yang digunaka pada uji organoleptik ini yaitu skala numerik dengan skala 1-5. Untuk skala hedonik yaitu 1) Tidak suka, 2) Agak tidak suka, 3) Biasa, 4) Agak suka, 5) Suka. Sedangkan untuk skala mutu hedonik dapat dilihat pada lampiran 3.
Identifikasi Senyawa Volatil Metode GC-MS Kondisi Alat GC-MS
Instrument : Agilent Technologies 6890 Gas Chromatograph with Auto Sampler and 5973 Mass Selective Detector and Chemstation data system.
Ionisation mode : Electron Impact Electron energy : 70 eV
Coloumn : HP WAX . Capilarry Coloumn Length (m) 25 X 0.25 (mm) I.D X 0.25 (m) Film Thickness.
Oven Temperature : Initial temperature at 60oC hold for 1 minute, rising at 3oC/min to 150 oC hold for 2 minutes and finally rising 15 o
C/min to 240 oC hold for 20 minutes. Injection port temperature : 250 oC
Ion Source Temperature : 230 oC Interface Temperature : 280 oC Quadrupole Temperature : 140 oC
Carrier gas : Helium
Column mode : Constant Flow
Flow Column : 0.6 µl/menit Injection volume : 20 µL
Split : 250 : 1
Method File : MGNONWAX
Persiapan Sampel
Di timbang 1 gram bubuk bekatul dan di tambah 5 ml etil asetat pro analisa. kemudian sampel ekstraksi menggunakan alat rotary evaporator selama 30 menit dan selanjutnya di sentrifuge selama 10 menit. Diambil fase organik dan di uapkan menggunakan gas nitrogen sampai kering, lalu di larutkan dengan 200 ul etil asetat pro analisa dan di injek ke GC MS.
Penelitian tahap II
Penelitian tahap II yaitu menentukan formulasi minuman bekatul. Tujuannya yaitu untuk mendapatkan formula minuman bekatul yang sesuai. Selanjutnya dilakukan uji organoleptik terhadap minuman bekatul dengan penambahan berbahgai jenis dan konsentrasi flavor. Uji organoleptik tersebut dilakukan dengan tujuajn untuk mengetahui pengaruh jenis dan konsentrasi flavor terhadap penerimaan panelis pada produk minuman bekatul siap seduh.
Penentuan formula untuk minuman bekatul siap seduh
Setelah didapat bekatul siap seduh dengan ukuran 60 mesh kemudian dilakukan uji panelis terbatas yang berjumlah 10 orang. Tingkat penambahan sukralosa yang diujikan adalah 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, dan 30 % dari berat bekatul sebesar 15 gram. Kemudian masing-masing tingkat konsentarsi sukralosa ditambahkan 15 gram bekatul dan 0.1 % garam dari volume minuman yang dibuat (100 ml). Hal ini dilakukan untuk mendapatkan tingkat konsentrasi penambahan sukralosa yang paling disukai yang nantinya akan digunakan pada uji organoleptik. Namun hal tersebut sudah dilakukan pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Henry Farizal dan didapat konsentarsi tebaik untuk penambahan sukralosa pada produk minuman bekatul siap seduh ini yaitu 20% b/b dan 0.1% garam dari volume minuman 100 ml.
Formulasi selanjutnya adalah penambahan flavor yaitu flavor coklat, vanila, jasmine tea, sirsak, dan anggur merah dengan konsentarsi masing- masing 0.1 %; 0.3 %; dan 0.5 %. Konsentrasi penambahan flavor pada penelitian ini adalah berdasarkan anjuran dari perusahaan yang memproduksi flavor yang digunakan.SNI tentang penambahan flavor untuk minuman, yaitu berkisar antara 0.5-1%. Perbandingan antara jumlah bekatul : sukralosa : garam : air adalah sama untuk setiap formula dan yang berbeda adalah konsentarsi penambahan flavor. Setelah semua bahan dicampur kemudian dilarutkan dalam air 200 ml dan diaduk sampai tercampur sempurna. Masing-masing formula minuman selanjutnya dibuat agar mencukupi untuk analisis organoleptik yang menggunakan 33 panelis.
Uji Organoleptik
Uji organoleptik merupakan uji dengan menggunakan indra manusia sebagai instrument. Uji ini sering digunakan untuk menilai mutu komoditas hasil pertanian dan makanan (Soekarto 1990). Uji organoleptik yang dilakukan pada
penelitian lanjutan ini adalah uji mutu hedonik dan uji hedonik (uji kesukaan) oleh 33 panelis semi terlatih (mahasiswa).
Uji Mutu Hedonik
Uji mutu hedonik merupakan uji dari karakteristik produk. Pada penelitian ini atribut mutu yang digunakan yaitu rasa, aroma flavor, aroma keseluruhan, warna, dan bau/odor (Lampiran 5). Skala yang digunakan yaitu sebagai berikut:
Bau/Odor Rasa Aroma
Flavor Aroma keseluruhan 1. Apek 2. Agak apek 3. Sedang 4. Agak harum 5. Harum 1.Tidak enak 2. Agak tidak enak 3. sedang 4. Agak enak 5. Enak 1. Lemah 2. Agak lemah 3. Sedang 4. Agak kuat 5. Kuat
1. Off flavor (menyimpang) 2. Agak menyimpang 3. Tidak ada bau
4. Agak harum/agak wangi 5. Harum /wangi
Uji Hedonik
Uji hedonik atau uji kesukaan merupakan salah satu uji penerimaan. Dalam uji ini panelis diminta mengungkapkan tanggapan pribadinya tentang kesukaan atau sebaliknya ketidaksukaan, disamping itu panelis juga mengemukakan tingkat kesukaan/ketidaksukaan. Uji hedonik pada penelitian ini, panelis diminta mengungkapkan tanggapan pribadinya terhadap rasa dari sampel. Skala hedonik yang digunakan adalah menggunakan 5 skala numerik yaitu amat tidak suka (1), agak tidak suka (2), biasa (3), agak suka (4), suka (5) (Lampiran 4).
Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian tahap I dan tahap II adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL). Faktor yang digunakan dalam
penelitian tahap I adalah jenis campuran kehalusan bekatul yaitu bekatul halus tanpa bekatul yang tidak lolos aykan 20 mesh dan bekatul halus yang
dicampurkan kembali dengan bekatul yang tidak lolos ayakan 20 mesh dengan dua kali ulangan. Penelitian tahap IIfaktor yang digunakan adalah konsentrasi penambahan flavor pada minuman bekatul instan, terdiri dari tiga taraf yaitu sebesar 0.1, 0.3, dan 0.5 persen, dengan dua kali ulangan.
Model matematika dari rancangan percobaan tersebut adalah: Yij = + Ai + Eij
Keterangan:
Yij = Nilai pengamatan respon karena pengaruh presentase. Penambahan flavor terhadap minuman bekatul taraf ke-i pada tingkat adisi pada ulangan ke-j
i = Taraf dari faktor A
J = Banyaknya ulangan (j = 1,2) = Rataan sebenarnya
Ai = Pengaruh perlakuan akibat faktor A pada taraf ke-i Eij = Kesalahan percobaan karena pengaruh faktor A terhadap
Pengolahan dan Analisis Data
Data yang diproleh selain disajikan dalam bentuk deskriptif (presentase atau kadar) juga dilakukan analisis statistik. Analisis statistik yang digunakan adalah uji t (independent sampel t-test). Analisis statistik tersebut dilakukan pada data hasil analisis proksimat, serat pangan, kadar mineral Ca, Fe, dan Zn, bioavaibiliti mineral Ca, Fe dan Zn, aktifitas antioksidan, kadar vitamin E, kadar oryzanol, dan organoleptik bahan baku bekatul awet. Data hasil uji organoleptik terhadap penambahan beberaapa jenis flavor pada tiga taraf konsetrasi (0.1; 0.3; dan 0.5 %) kemudian dianalisis dengan uji Friedman. Hal ini untuk mengetahui pengaruh jenis flavor dan konsentrasinya terhadap penerimaan minuman bekatul oleh panelis. Software yang digunakan adalah Microsoft Exel 2007.