Plasmid pPICZα yang mengandung gen anti-EGFRvIIIscFv (pPICZαA-
scFv-41) telah berhasil dikonstruksi dan dan dilaporkan Hertati (2013). Gen scFv
diinsersikan pada situs XhoIsetelah sinyal sekresi mating factor-α (MF-α) untuk
sekresi protein rekombinan keluar sel. Plasmid pPICZα-scFv telah diverifikasi
dengan teknik sekuensing dan selanjutnya digunakan dalam kontruksi fusi protein antibodi. Plasmid ini digunakan untuk mengkonstruksi fusi protein scFv::HPR. Fusi protein scFv::HPR memiliki ukuran yang relatif kecil sehingga diharapkan dapat bekerja efektif dalam penargetan terhadap sel atau jaringan tumor. Plasmid
pPICZα-scFv klon no.41 telah dikonfirmasi baik dari ukuran plasmid, sekuen gen,
dan posisi gen dalam plasmid. Selanjutnya klon plasmid ini digunakan dalam subkloning gen berikutnya. Vektor pPICZα dipilih dan digunakan karena
diharapkan dapat mengekspresikan dan mensekresikan protein fusi rekombinan yang sangat kompleks yang dikonstruksi dalam penelitian ini pada sel inang P. pastoris. Protein fusi scFv::HPR sangat kompleks karena masing-masing domain
protein fusi tersebut memiliki lebih dari satu ikatan disulfida.
4.1.2 Subkloning genHPRke dalam plasmidpPICZα-scFv
Gen HPR telah berhasil disisipkan ke dalam plasmid pPICZα yang
mengandung gen anti-EGFRvIII scFv. Seleksi koloni transforman dilakukan
dengan metode PCR koloni terhadap 100 koloni transforman dengan pasangan primer HPR-F dan HPR-R untuk mendeteksi gen HPR yang terinsersi dalam plasmid.
Gambar 6 Elektroforegram hasil PCR untuk seleksi plasmid rekombinan pPICZ-
scFv-HPR pada E. coli transforman. A. Analisis PCR koloni untuk
seleksi genHPRmenggunakan primer HPR-F dan HPR-R. 1= penanda
DNA; 2= kontrol negatif; 3-13= klon E. colitransforman. Klon positif
ditunjukkan dengan adanya pita DNA berukuran 400 pb. B. Analisis PCR koloni untuk seleksi fusi gen scFv::HPR menggunakan primer
AOX-F dan AOX-R. M= penanda DNA; 1= kontrol negatif; 2-12= E. coli transforman. Klon positif ditunjukkan dengan adanya pita DNA
20
Sampel yang positif menghasilkan produk PCR sekitar 400 pb (Gambar 6A). Hasil dari PCR koloni didapatkan 90 dari 100 koloni positif tersisip gen
HPR. PCR koloni juga dilakukan untuk konfirmasi bahwa fusi gen scFv::HPR
telah terbentuk dengan menggunakan pasangan primer AOX1-F dan AOX1-R. Koloni yang diuji sebanyak 90 klon hasil PCR koloni sebelumnya. Klon yang positif menghasilkan produk PCR sekitar 1650 pb (Gambar 6B). Hasil analisis menunjukkan bahwa73 dari 90 koloni positif mengandung fusi genscFv::HPR.
Orientasi genHPRdalam plasmid diperiksa dengan teknik PCR dan analisis
restriksi. Analisis PCR menggunakan pasangan primer HPR-F dan AOX1-R terhadap 73 klon yang diduga telah terinsersi gen HPR. Klon yang mengandung
gen sisipan dengan orientasi yang benar menghasilkan pita berukuran sekitar 650pb (Gambar 7A). Dari hasil analisis diperoleh 42 koloni yang positif. Analisis restriksi menggunakan enzim XbaI menghasilkan 8 klon positif yang terpotong
(Gambar 7B).Selanjutnya tiga dari delapan klon tersebut dianalisis lebih lanjut terhadap urutan nukleotidanya. Satu klon dengan urutan nukleotida yang benar telah diperoleh, yaitu klon scFv-HPR44 (Lampiran5). Riccio et al. (2012),
melaporkan menggunakan teknik yang sama untuk mengkonstruksi fusi RNase dan fragmen antibodi dengan ErbB2 receptor sebagai molekul targetnya yaitu
ERB–HP-DDADD-RNase. Konstruk tersebut di subklon ke dalam vektor
pET22b+ dan diekspresikan pada E. coli BL21(DE3). Molekul imunoRnase ini
dilaporkan mampu menunjukkan aktivitas biologis baik pada domain antibodi maupun domain RNasenya.
Gambar 7 Elektroforegram hasil PCR koloni (A) dan digesti plasmid (B) untuk seleksi plasmid rekombinan mengandung fusi gen scFv::HPR. A.
Analisis PCR koloni untuk konfirmasi orientasi gen HPR
menggunakan primer HPR-F dan AOX-R. M= penanda DNA; 1= kontrol negatif; 2-12= E. coli transforman. Klon positif ditunjukkan
dengan adanya pita DNA berukuran 650 pb. B. Analisis restriksi plasmid rekombinan menggunakan enzim XbaI.; 1= kontrol negatif;
2= penanda DNA; 3-10: plasmid rekombinan. Klon yang positif ditunjukkan dengan adanya potongan DNA berukuran 400 pb.
Gen HPR telah berhasil difusikan pada ujung-C dari scFv pada plasmid
pPICZα-scFv. Gambar 8 menunjukkan peta konstruksi fusi genscFv::HPRdalam
21
sekresi faktor- (factor-). Sebuah linker (L) atau peptida penghubung
ditempatkan diantara fragmen antibodi dan gen HPR yang dimaksudkan untuk
memberikan ruang yang cukup bebas dan meminimalkan kendala hambatan sterik diantara kedua domain tersebut. Fragmen scFv ditempatkan pada ujung-N dari HPR agar lebih mudah dijangkau daripada posisi diujung-C. Posisi relatif fragmen antibodi dan HPR ini sama dengan penelitian yang dilakukan oleh Lorenzo et al.
(2004) yang memfusi fragmen anti-ErbB2 scFv dengan HPR dan penelitian
Riccio et al. (2012) yang membuat protein khimera anti-ErbB2 scFv Erbicindan
HPR.
Gambar 8 Peta konstruksi fusi gen scFv::HPR dalam plasmid pPICZα-scFv.
5’AOX1= promoter alkohol oksidase; α-faktor = sinyal sekresi; scFv=
fragmen antibodi; L= linker, GGGSIDSRGGGGS; HPR= human pancreatic ribonuclease; c-myc= penanda myc; 6×His= polihistidin tag; STOP= kodon stop; AOX1TT= sekuen terminator alkohol
oksidase.
4.1.3 Transformasi dan seleksiP.pastoris
Plasmid pPICZα-scFv-HPR rekombinan dengan sekuen yang telah
dikonfirmasi dilinierisasi dengan enzim SacIkemudian ditransformasi ke dalam P. pastoris SMD1168H. Protein rekombinan yang diekspresikan merupakan
preprotein dari fusi protein yang mengandung sinyal sekresi faktor-αdan sekuen
penanda myc epitope dan 6×His tag pada ujung-C. Dari hasil transformasi
diperoleh 27 koloni independen P. Pastoris transforman dengan efisiensi
transformasi sebesar 0,54 x 102 cfu/µg DNA.Perhitungan efisiensi transformasi dapat dilihat pada Lampiran 6. Efisiensi transformasi tersebut termasuk sangat rendah dibandingkan dengan tingkat efisiensi yang disebutkan dalam referensi bisa mencapai 103 sampai 104cfu/µg DNA (Invitrogen 2010). Faktor-faktor yang
menyebabkan rendahnya tingkat efisiensi transformasi diantaranya yaitu jumlah DNAyang rendah, banyaknya pengotor dalam DNA, volume DNA yang berlebih, penghambatan transformasi dari proses ligasi, sel kompeten yang kurang baik, bahan kimia yang digunakan untuk sel kompeten yang kurang baik, teknik elektroporasi yang tidak sesuai, sel yang digunakan untuk kompeten sel yang kurang baik pertumbuhannya dan atau pertumbuhannya terlalu tinggi (Hornstein 2012). Pada eksperimen transformasi ini jumlah DNA yang digunakan hanya 500 ng. Jauh lebih sedikit dari jumlah DNA yang disarankan, yaitu antara 1 sampai 5g (Invitrogen 2010).
Analisis kestabilan genetik dilakukan dengan menumbuhkan koloni transforman yang tumbuh pada medium seleksi YPDSzeo pada media YPDA baru yang mengandung zeocin 100 µg/µl. Sebagai kontrol digunakan media YPDA yang tidak mengandung zeocin. Dari uji ini didapatkan fakta bahwa semua koloni transforman yang diperoleh dari medium seleksi awal dapat tumbuh pada medium seleksi selanjutnya.Hal ini menunjukkan bahwa koloni transforman tersebut stabil secara genetik.
22
Gambar 9 Uji kestabilan genetik dan seleksi insersi gen ganda pada koloni yeast transforman pada media YPDAzeo, dengan konsentrasi zeocin bertingkat: 0 µg/ml (A), 100 µg/ml (B), 200 µg/ml (C), 500 µg/ml (D), dan 1000 µg/ml (E).
Analisis multikopi gen dilakukan dengan menumbuhkan koloni transforman tunggal pada media YPDAzeo yang mengandung zeocin 100, 200, 500, dan 1000µg/ml (Gambar 9). Sebagai kontrol digunakan media YPDA tanpa zeocin. Klon-klon transforman yang dihasilkan memiliki kemungkinan beragam dalam jumlah salinan gen atau plasmid yang terintegrasi ke dalam DNA genom. Untuk menguji klon-klon yang mengandung jumlah salinan gen beragam, klon transforman tersebut diidentifikasi dengan menumbuhkan transforman tersebut pada medium yang mengandung antibiotik zeocin secara bertingkat. Semua koloni transforman tumbuh baik pada media kontrol dan media dengan zeocin 100 µg/µl. Pada konsentrasi zeocin 200 dan 500 µg/ml beberapa koloni mulai terlihat terhambat pertumbuhannya danhanya sekitar 93% dari jumlah klon tersebut yang tumbuh dengan baik.Sedangkan pada konsentrasi zeocin 1000 µg/ml, hanya sekitar 70% dari klon transforman tersebut yang dapat tumbuh dengan baik.Dalam penentuan jumlah salinan gen, Nordén et al. (2011) mengemukakan bahwa
terdapat variasi dalam toleransi terhadap antibiotik. Hal tersebut dikarenakan adanya perbedaan dalam jumlah gen rekombinan diantara klon transforman Dengan asumsi bahwa gen Sh ble yang tergabung pada rasio yang sama dengan
fragmen gen target, diperkirakan 1 salinan gen Sh ble (gen resistensi zeocin)
merupakan syarat minimum untuk dapat tumbuh pada konsentrasi zeocin 100 µg/ml, 4 salinan gen untuk tumbuh pada konsentrasi 500 µg/ml dan 9 salinan gen untuk tumbuh pada konsentrasi 1000 µg/ml. Klon dengan salinan gen Sh ble
sebanyak 17 salinan juga dilaporkan pada klon tarnsforman yang mampu tumbuh pada konsentrasi zeocin sebesar 2000 µg/ml (Nordénet al. 2011).
Plasmid pPICZα yang mengandung fusi gen scFv::HPR telah berhasil
diintegrasikan ke dalam genom P. pastoris. Analisis terhadap genom DNA
transforman dilakukan dengan metode PCR koloni terhadap 10 klon P. pastoris
transforman. Dua pasang primer digunakan untuk konfirmasi integrasi gen HPR
dan scFv dalam genom P. pastoris, yaitu pasangan primer HPR-F / HPR-R dan
VH101-F / VH101-R. Hasil PCR koloni dari 10 transformanP. pastoristersebut
menunjukkan bahwa semua klon yang dianalisis memberikan pita DNA berukuran 400 pb (Gambar 10A) dan 750 pb (Gambar 10B). Pita berukuran 400 pb adalah genHPR, sedangkan pita berukuran 750 pb adalah gen scFv. Dari hasil PCR ini
disimpulkan bahwa semua klon transforman yang dianalisis tersebut positif mengandung kedua gen tersebut (HPRdanscFv).
23
Gambar 10 Elektroforegram hasil PCR koloni untuk konfirmasi insersi fusi gen
scFv::HPR dalam genom P. pastoris transforman. A. PCR koloni
menggunakan pasangan primer HPR-F dan HPR-R. M= penanda DNA; 1-10= galur P. pastoris transforman. Galur transforman yang
positif mengandung gen HPRmemberikan pita DNA berukuran 400
pb. B. PCR koloni menggunakan pasangan primer VH101-F dan VL101-R. M= penanda DNA; 1= kontrol positif; 2-11= galur P. pastoris transforman. Galur transforman yang positif mengandung
genscFvmemberikan pita DNA berukuran 750 pb.
4.2 Konstruksi Protein Fusi anti-EGFRvIIIscFv-GFP dengan HPRmut