Seleksi dan ekspresi protein fusi rekombinan dari galur P. pastoris
transforman perlu dianalisis lebih lanjut untuk mengamati integritas dari protein fusi yang dihasilkan. Seleksi juga perlu dilakukan terhadap galur-galur transforman lain yang lebih banyak untuk mengetahui galur dengan tingkat ekspresi yang lebih baik. Selanjutnya perlu juga dilakukan pengujian terhadap fungsionalitas dan aktivitas protein fusi yang dihasilkan, seperti uji aktifitas ribonuclease dari HPR dan uji pengikatan afinitas terhadap molekul antigen target (EGFRvIII) dari fragmen antibody (scFv).
DAFTAR PUSTAKA
Ahmad ZA, Yeap SK, Ali AM, Ho WY, Alitheen NBM, Hamid M. 2012.Review Article : scFv Antibodi: Principles and Clinical Application. Clin & Develop ImmunolVolume 2012, doi:10.1155/2012/980250.
Ardelt W, Ardelt B, Darzynkiewicz Z. Ribonucleases as potential modalities in anticancer therapy. 2009.European J of Pharmacol625 181–189.
Atalay G, Cardoso F, Awada A, Piccart MJ. 2003. Novel therapeutic strategies targeting the epidermal growth factor receptor (EGFR) family and its downstream effectors in breast cancer.Ann Oncol, 14: 1346–1363.
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (editors). 2002. Short Protocol in Molecular Biology. 5th Edition. John
Wiley & Sons Inc.
Balamurugan V, Reddy GR, Suryanarayana VVS. 2007. Pichia pastoris: A
notable heterologous expression system for the production of foreign proteins—Vaccines.Indian J Biotechnol, 6: 175-186.
Bell P, Vandenberghe LH, Wu D, Johnston J, Limberis M, Wilson JM. 2007. A Comparative Analysis of Novel Fluorescent Proteins as Reporters for Gene Transfer Studies. J Histochem Cytochem. 55(9): 931–939. DOI:
10.1369/jhc.7A7180.2007.
Benito A, Ribó M, Vilanova M. 2005.On the track of antitumour ribonucleases. Mol Biosyst1(4): 294-302.doi:10.1039/B502847G.
Binyamin L, Borghaei H, Weiner LM. 2006. Cancer therapy with engineered
monoclonal antibodies.Update on cancer therapeutics1: 147–157.
Bobrowicz P, Davidson RC, Li H, Potgieter TI, Nett JH, Hamilton SR, Stadheim TA, Miele RG, Bobrowicz B, Mitchell T, Rausch S, Renfer E, Wildt S. 2004. Engineering of an artificial glycosylation pathway blocked in core oligosaccharideassembly in the yeast Pichia pastoris: production of
complex humanized glycoproteins with terminal galactose. Glycobiol
14(9): 757-766. doi:10.1093/glycob/cwh104.
Bornhorst JA, Falke JJ. 2000. Purification of Proteins Using Polyhistidine Affinity Tags.Methods Enzymol, 326 : 245–254.
Borriello M, Laccetti P, Terrazzano G, D’Alessio G, De Lorenzo C. 2011. A
novel fully human antitumour immunoRNase targeting ErbB2-positive tumours.Br J Cancer104, 1716–1723.
Bretthauer RK. 2003. Genetic engineering of Pichia pastoris to humanize N- glycosylation of proteins.TRENDS Biotechnol21 :11.
Casey JL, Coley AM, Tilley LM, Foey M. 2000. Gren Fluorescent antibodies : Novel in vitro tools.Prot Eng13 (6) : 445-452.
35
Castro J., M. Ribó, S. Navarro, M. V. Nogués, M. Vilanova, A. Benito. 2011. A human ribonuclease induces apoptosis associated with p21WAF1/CIP1 induction and JNK inactivation.BMC Cancer, 11:9.
Cereghino JL, Cregg JM. 2000. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeastPichia pastoris.FEMS Microbiol Rev24 ; 45-66.
Daly R, Hearn MTW. 2005. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and
production.J Mol Recognit18(2): 119–138. DOI: 10.1002/jmr.687.
Feilmeier BJ, Iseminger G, Schroeder D, Webber H, Phillips GJ. 2000. Green Fluorescent Protein Functions As A Reporter For Protein Localization In
Escherichia Coli.J Bacteriol182( 14): 4068–4076.
Frederick L, Wang XY, Eley G, James CD. 2000. Diversity and Frequency of Epidermal Growth Factor Receptor Mutations in Human Glioblastomas.
Cancer Res60, p1383–1387.
Garfin DE. 2003. Gel Electrophoresis of Protein. In : Davey J & Lord M, editor.
Essential Cell Biology, Volume 1: Cell Strructure, A practical Approach.
Oxford: Oxford University Press. Pp 179-268.
Gaur D, Swaminathan S, Batra JK. 2001. Interaction Of Human Pancreatic Ribonuclease With Human Ribonuclease Inhibitor: Generation Of Inhibitor-Resistant Cytotoxic Variants. JBC Papers in Press. DOI
10.1074/jbc.M102440200.
Gietz RD, Woods RA. 2001. Genetic Transformation of Yeast. Bio Tech 30:816-
831.
Gupta P, Han S-Y, Madruga MH, Mitra SS, Nitta GLiRT, Wong AJ. 2010. Development of an EGFRvIII specific recombinant Antibodi. BMC Biotechnol2010 10:72.
Hames BD, Higgins SJ. 1999. Protein Expression. The Practical Approach Series.
Oxford University Press. Oxford New York.
Hertati A. 2013. Introduksi dan ekspresi gen fragmen antibodi untai tunggal (scFv) anti-EGFRvIII pada Pichia pastoris. Thesis. Program
Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. 51p. http://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool.
Hornstein J. 2012. Competent Cell Transformation Efficiency Optimization. Life Technologies technical support. Thermo Fisher Scientific All Rights Reserved.
Huang D, Shusta EV. 2006. A Yeast Platform for the Production of Single-Chain Antibody–Green Fluorescent Protein Fusions. App and Environ Microbiol72(12): 7748–7759.
36
Huang A L, Chen X, Hoon MA, Chandrashekar J, Guo W, Tränkner D, Ryba NJ P, Zuker CS. 2006. The Cells and Logic for Mammalian Sour Taste detection.Nat442(7105): 934–938.
Invitrogen. 2010. EasySelect™ Pichia Expression Kit; For Expression of
Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZα inPichia pastoris. Cat.
no. K1740-01. MAN0000042. Carlsbad, CA.
Joosten V, Lokman C, vd Hondel CAMJJ, Punt PJ. 2003. The Production Of Antibodi Fragments And Antibodi Fusion Proteins By Yeasts And Filamentous Fungi.BioMed Central Ltd.
Kain SR. 1999. Green fluorescent protein (GFP): applications in cell based assays for drug discovery. DDT4: 7.
Kövér KE, Bruix M, Santoro J, Batta G, Laurents DV, Rico M. 2008. The Solution Structure and Dynamics of Human Pancreatic Ribonuclease Determined by NMR Spectroscopy Provide Insight into Its Remarkable Biological Activities and Inhibition.J Mol Biol379, 953–965.
Kreitman RJ. 2006. Immunotoxins for Targeted Cancer Therapy. The AAPS Journal63; 8 (3).
Kuan CT, Wikstrand CJ, Archer G, Beers R, Pastan I, Zalutsky MR, Bigner DD. 2000. Increased Binding Affinity Enhances Targeting Of Glioma Xenografts By EGFRVIII-Specific scFv.Int J Cancer:88,962–969.
Kuan C-T, Wikstrand CJ, Bigner DD. 2001. EGF Mutan Receptor vIII as a Molecular Target In Cancer Therapy.Endocr Relat Cancer8 83–96.
Leland PA, Staniszewski KE, Kim B-M, Raines RT. 2001. Endowing Human Pancreatic Ribonuclease with Toxicity for Cancer Cells. J Biol Chem
Vol. 276, No. 46, Issue of November 16, Pp. 43095–43102.
Li P, Anumanthan A, Gao X-G, Ilangovan K, Suzara VV, Düzgüneş N,
Renugopalakrishnan V. 2007 Expression of Recombinant Proteins in
Pichia Pastoris. Appl Biochem Biotechnol 142:105–124. doi :
10.1007/s12010-007-0003-x.
Lorenzo CD, Arciello A, Cozzolino R, Palmer DB, Laccetti P, Piccoli R,
D’AlessioG. 2004. A Fully Human Antitumor ImmunoRNase Selective
for ErbB-2-Positive Carcinomas.Cancer Res64, 4870–4874.
Maeng BH, Choi J, Sa YS, Shin JH, Kim YH. 2012. Functional Expression of Recombinant Anti-BNP scfv In Methylotrophic Yeast Pichia Pastoris
and Application as a Recognition Molecule in Electrochemical Sensors.
World J Microbiol Biotechnol, 28:1027–1034. DOI 10.1007/s11274-011-
0901-5.
Marty C, Scheidegger P, Hofer KB, Klemenz R, Schwendener RA. 2001 Production of Functionalized Single-Chain Fv Antibody Fragments Binding to the ED-B Domain of the B-isoform of Fibronectin in Pichia
37
pastoris. Protein Expression and Purification 21, 156–164.
doi:10.1006/prep.2000.1362.
Madhumathi J, Verma RS. 2012. Therapeutic targets and recent advances in protein immunotoxins. Curr Opin Microbiol, 15:300–309.
doi.org/10.1016/j.mib.2012.05.006.
Mamot C, Rochlitz C. 2006. Targeting the epidermal growth factor receptor (EGFR)– a new therapeutic option in oncology?. Swiss Med Wkly 136 :
4–12.
Mathew M, Verma RS. 2009. Humanized immunotoxins: A new generation of immunotoxins for targeted cancer therapy. Cancer Sci 100 (8): 1359–
1365. doi: 10.1111/j.1349-7006.2009.01192.x.
Moscatello DK, Madruga MH, Godwin AK, Ramirez G, Gunn G, Zoltick P W, Biegel J A, Hayes RL, Wong AJ. 1995. Frequent Expression of a Mutant Epidermal Growth Factor Receptor in Multiple Human Tumors. Cancer Res(55): 5536-5539.
Nicot C, Relat J, Woldegiorgis G, Haro D, Marrero PF. 2002. Pig Liver Carnitine Palmitoyltransferase Chimera Studies Show That Both The N- And C- Terminal Regions Of The Enzyme Are Important For The Unusual High Malonyl-Coa Sensitivity. J Biol Chem 277(12): 10044–10049, doi:
10.1074/jbc.M109976200.
Nordén K, Agemark M, Danielson JÅH, Alexandersson E, Kjellbom P, Johanson U. 2011. Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins inPichia pastoris.BMC Biotechnol, 11:47.
Pastan I, Hassan R, FitzGerald DJ, Kreitman RJ. 2007. Immunotoxins Treatment of Cancer. Annu Rev Med 58: 221-237. doi:
10.1146/annurev.med.58.070605.115320.
Patrick SM, Fazenda ML, McNeil B, Harvey LM. 2005. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. review, Yeast;
22: 249–270. doi: 10.1002/yea.1208.
Pedersen MW, Meltorn M, Damstrup L, Poulsen HS. 2001. The type III epidermal growth factor receptor mutation: Biological significance and potential target for anti-cancer therapy. Ann Oncol12: 745-760.
Pedersen MW, Pedersen N, Ottesen LH, Poulsen HS. 2005. Differential response to gefitinib of cells expressing normal EGFR and the mutant EGFRvIII.
Br J Cancer93, 915–923.
Peterson E, Owens SM, Henry RL. 2008. Monoclonal Antibody Form and Function: Manufacturing the Right Antibodies for Treating Drug Abuse. Di dalam: Rapaka RS & Sadée W, editor. Drug Addiction From Basic Research to Therapy. Chapter 5. New York : American Association of
38
Peterson E, Owens SM, Henry RL. 2006. Monoclonal Antibodi Form and Function: Manufacturing the Right Antibodies for Treating Drug Abuse. The AAPS Journal2006; 8 (2) Article 43.
Petrausch U, Dernedde J, Coelho Vˆn, Panjideh H, Frey D, Fuchs H, Thiel E,
Deckert PM. 2007. A33 scfv–Green Fluorescent Protein, a Recombinant
single-chain Fusion Protein for Tumor Targeting. Prot Eng, Design & Selection, 20 (12) : 583–590.
Powers DB, Amersdorfer P, Poul M-A, Nielsen UB, Shalaby MR, Adams GP, Weiner LM, Marks JD. 2001. Expression of single-chain Fv-Fc fusions inPichia pastoris.J Immunol Methods, 251: 123–135.
Rath A, Glibowicka M, Nadeau VG, Chen G, Deber CM. 2009. Detergent binding explains anomalous SDS-PAGE migration of membrane proteins. PNAS
106 (6): 1760–1765, doi 10.1073 pnas.0813167106.
Riccio G, D’Avino C, Raines RT, De Lorenzo C. 2012. A novel fully human
antitumor ImmunoRNase resistant to the RNase inhibitor. Protein Engineering, Design & Selection 26(3): 243–248. DOI
10.1093/protein/gzs101.
Rybak SM, Saxenat S K, Ackermant EJ, Youle RJ. 1991. Cytotoxic Potential of Ribonuclease and Ribonuclease Hybrid Proteins. J Biol Chem 266 (31):
21202-21207.
Rybak SM, Newton DL. 1999. Immune Enzymes, in Antibody Fusion Proteins (Chamow, S. M. and Ashkenazi, A., eds.). Wiley, New York, pp. 53–
110. 13.
Sun C, Wirsching P, Janda KD. 2003.Enabling scFvs as Multi-Drug Carriers: A Dendritic Approach.Bioorg & Med Chem,11 : 1761–1768.
Tavaré J M, Fletcher LM, Welsh GI. 2001. Using green fluorescent protein to study intracellular signalling.J Endocrinol, 170, 297–306.
Trung NP, Fitches E, Gatehouse JA. 2006. A fusion protein containing a lepidopteran-specific toxin from the South Indian red scorpion (Mesobuthus tamulus) and snowdrop lectin shows oral toxicity to target
insects.BMC Biotechnology6:18, doi:10.1186/1472-6750-6-18.
Tsien RY. 1998. The Green Fluorescent Protein.Annu. Rev. Biochem. 67:509–44.
UICC-International Union Against Cancer. 2010. http://www.uicc.org/general- news/experts-call-end-global-inequalities-access-ain-edication-cancer- sufferers.
Valero F. 2013. Bioprocess Engineering of Pichia pastoris, an Exciting Host
Eukaryotic Cell Expression System. Di dalam Ogawa T, editor. Protein Engineering - Technology and Application. ISBN 978-953-51-1138-2.
39
Weber R, Feng X, Foord O, Green L, Gudas JM, Keyt B, Liu Y, Rathanaswami P, Raya R, Yang XD, Corvalan J, Foltz I, Jia XC, Kang JS, King CT, Klakamp SL, Su QJ. 2009. Antibodies directed to deletion mutants of epidermal growth factorreceptor and uses thereof. US Patent Application Publication No. US2009/0240038 A1.
Yang Te-T, Cheng L, Kain SR. 1996. Optimized codon usage and chromophore mutations provide enhanced sensitivity with the green fluorescent protein.Nucleic Acids Res24(22): 4592–4593.
Zewe M, Rybak SM, Dübel S, Coy JF, Welschof M, Newton DL, Little M. 1997. Cloning and cytotoxicity of a human pancreatic RNase immunofusion.
Immunotechnol3(2):127-36.
Zhu D, Saul AJ, Miles AP. 2005. A quantitative slot blot assay for host cell protein impurities in recombinant proteins expressed in E. coli. J Immunol Methods, 306 :40-50.
Zupan AL, Trobec S, Porekar VG, Menart V. 2004. High expression of green fluorescent protein in Pichia pastoris leads to formation of fluorescent
Lampiran 1 Kromatogr
Lampiran 2 Kromatogr
togram sekuen gen scFv-EGFRvIII primer Forw
togram sekuen gen scFv-EGFRvIII primer Reve orward
38
Lampiran 3 Komposisi Media
Komposisi Media Kloning gen keE. coli
Media Low Salt LB (Luria-Bertani) atau LS-LB
Kondisi media Low Salt LB dibutuhkan untuk antibiotik zeocin. 1% Tripton
0,5% Ekstrak yeast 0,5% NaCl
Cara pembuatan :
Untuk membuat 1 L media, 10 gram tripton, 5 gram ekstrak yeast, dan 5 gram NaCl dilarutkan dalam 950 ml akuades. pH larutan diatur sampai 7,5 dengan NaOH sampai volumenya 1 L. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210 C selama 15 menit. Media dibiarkan dingin sampai suhunya ~55°C setelah itu ditambahkan antibiotik (zeocin). Simpan media pada suhu ruang atau suhu 4°C.
Media LS-LB Agar 1% Tripton 0,5% Ekstrak yeast 0,5% NaCl 1,5% Agar Cara pembuatan :
Cara pembuatan media LS-LB agar sama seperti media LS-LB dan ditambahkan 15 gram agar sebelum di autoklaf.
Komposisi Media Transformasi dan Ekspresi padaPichia pastoris
Media YPD (+zeocin)
1% ekstrak yeast 2% pepton
2% dekstrosa (glukosa) ±2% agar (YPD agar) ±100µg/ml zeocin (YPD + zeocin) Cara pembuatan :
Untuk membuat 1 L media, 10 gram ekstrak yeast, 20 gram pepton, dan 20 gram agar dilarutkan dalam 900 ml akuades. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Media dibiarkan dingin sampai suhunya ~60°C setelah itu ditambahkan 100 ml 10×D dan 1ml 100mg/ml zeocin.
Media cair tanpa antibiotik zeocin dapat disimpan pada suhu ruang. Media yang mengandung zeocin harus disimpan pada suhu 4°C dan pada keadaan gelap. Media YPD agar atau YPD agar miring disimpan pada suhu 4°C dan dalam keadaan gelap. Waktu simpan media yang mengandung zeocin yaitu satu sampai dua mingu.
39
Media YPDS (+zeocin) Agar Medium
1% ekstrak yeast 2% pepton
2% dekstrosa (glukosa) 1M sorbitol
±2% agar (YPD agar) ±100µg/ml zeocin (YPD + zeocin) Cara pembuatan :
Untuk membuat 1 L media, 10 gram ekstrak yeast, 20 gram pepton, 182,2 gram sorbitol dilarutkan dalam 900 ml akuades. Untuk membuat media agar tambahkan 20 gram agar. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Media dibiarkan dingin sampai suhunya ~60°C setelah itu ditambahkan 100 ml 10×D dan 1ml 100mg/ml zeocin. Media YPDS agar atau YPDS agar miring disimpan pada suhu 4°C dan dalam keadaan gelap. Waktu simpan media yang mengandung zeocin yaitu satu sampai dua mingu.
Media Buffered Minimal Glycerol-complex (BMGY) dan Buffered Minimal Methanol-complex (BMMY) 1% ekstrak yeast 2% pepton 100mM potasium fosfat, pH 6,0 1,34% YNB 4x10-5% biotin
1% gliserol atau 0,5% metanol
Cara Pembuatan:
Untuk membuat 1 L media, 10 gram ekstrak yeast, 20 gram pepton, dilarutkan dalam 700 ml akuades disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Media dibiarkan dingin pada suhu ruang setelah itu ditambahkan 100 ml 1M potasium fosfat (pH 6,0), 100 ml 10×YNB, 2 ml 500×B dan 100 ml 10× GY.
40
Lampiran 4 Komposisi Larutan Stok dan Dapar
Larutan Stok Kloning gen padaE.coli
Miniprep (alkaline lysis)
solution 1: 50 mM glucose 10 mM EDTA 25 mM Tris pH 8.0 solution 2: 0.2 N NaOH 1% SDS solution 3: 60 ml 5M KOAc 11.5 ml 96% acetic acid 28.5 ml H2O TE: 10x TE: 0.1 M Tris pH 8. TAE 50 × 242 g Tris Base (MW=121.1) 57.1 ml Asam asetat glasial 10 ml 0.5 M EDTA
Untuk membuat 1 L larutan, larutkan 242 g Tris dalam 600 akuades. Kemudian tambahkan 10 ml 0.5 M EDTA dan 57.1 ml asam asetat glasial selanjutnya pH diatur sampai 8,0 dan aquades ditambahkan sampai volumenya 1L. Larutan disimpan pada suhu ruang.
Larutan Stok Ekspresi Protein padaP. pastoris
10× YNB (13,4% Yeast Nitrogen Base dengan Amonium sulfat tanpa asam amino)
Untuk membuat 1 L stok larutan, 134 gram YNB dengan amonium sulfat dan tanpa asam amino dilarutkan dalam 1000 ml akuades dan disterilkan dengan cara difilter. Panaskan larutkan untuk melarutkan YNB sepenuhnya dalam air. Simpan pada suhu 4°C. Dapat juga membuat larutan dari 34 gram YNB tanpa amonium sulfat dan asam amino dan 100 gram amonium sulfat. Waktu simpan larutan sekitar satu tahun.
500× B (0.02% Biotin)
Untuk membuat 100 ml larutan larutkan 20 mg biotin dan distrerilisasi dengan filter. Larutan disimpan pada suhu 4°C. Waktu simpan larutan sekitar satu tahun.
41
100× H (0,4% Histidine)
Untuk membuat 100 ml larutan larutkan 400 mg L-histidin dalam 100 ml akuades. Larutan dipanaskan jika perlu dengan suhu tidak lebih dari 50°C untuk melarutkan. Kemudian larutan distrerilisasi dengan filter. Larutan disimpan pada suhu 4°C. Waktu simpan larutan sekitar satu tahun.
10× D (20% Dextrose)
Untuk membuat 1 L stok larutan, 200 gram D-glucose dilarutkan dalam 1000 ml akuades. Larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit atau dengan cara distrerilisasi dengan filter. Waktu simpan larutan sekitar satu tahun.
10× M (5% Methanol)
Untuk membuat 100 ml larutan campurkan 5 ml methanol dengan 95 ml akuades. Kemudian larutan distrerilisasi dengan filter dan disimpan pada suhu 4°C.Filter sterilize and store at 4°C. Waktu simpan larutan sekitar dua bulan.
10× GY (10% Glycerol)
Untuk membuat 1L larutan, 100 ml glycerol ditambahkan ke dalam 900 ml akuades. Larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit atau dengan cara distrerilisasi dengan filter. Larutan disimpan pada suhu ruang. Waktu simpan larutan paling lama sekitar satu tahun.
1 M dapar potassium fosfat, pH 6.0:
Untuk membuat 1L larutan, campurkan 132 ml 1 M K2HPO4, 868 ml 1 M
KH2PO4 dan pH diukur sampai 6.0 ± 0.1 (jika pH perlu disesuaikan, gunakan
asam fosfat atau KOH). Larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C
selama 15 menit atau dengan cara distrerilisasi dengan filter kemudian disimpan pada suhu ruang. Waktu simpan larutan paling lama sekitar satu tahun.
Komposisi Reagen Purifikasi Protein 0,5 M dapar fosfat, pH 7,4
Untuk membuat 1L larutan, campurkan 405 ml 0,5 M Na2HPO4, 95 ml 0,5
M NaH2PO4dan pH diukur sampai 7,4 ± 0,1 (jika pH perlu disesuaikan, gunakan
asam fosfat atau KOH). Larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit atau dengan cara distrerilisasi dengan filter kemudian disimpan pada suhu ruang. Waktu simpan larutan paling lama sekitar satu tahun.
0,5 M dapar fosfat, pH 8.0
Untuk membuat 1L larutan, campurkan 473,5 ml 0,5 M Na2HPO4, 26,5 ml
0,5 M NaH2PO4 dan pH diukur sampai 8,0 ± 0,1 (jika pH perlu disesuaikan,
42
121°C selama 15 menit atau dengan cara distrerilisasi dengan filter kemudian disimpan pada suhu ruang. Waktu simpan larutan paling lama sekitar satu tahun.
Dapar Pengikat (Binding buffer) 50 ml (50 mM fosfat buffer + 250 mM NaCl)
Untuk membuat 50 ml larutan, campurkan 5 ml 0,5 M dapar fosfat, 12,5 ml 1 M NaCl, dan aquades ditambahkan sampai volumenya 50 ml. Larutan disimpan pada suhu ruang. Waktu simpan larutan paling lama sekitar satu tahun.
Dapar pencuci (Washing buffer) 50 ml
Untuk membuat 50 ml larutan, campurkan 5 ml 0,5 M dapar fosfat, 12,5 ml 1 M NaCl, 250 µl 2 M imidazole, dan aquades ditambahkan sampai volumenya 50 ml. Larutan disimpan pada suhu ruang. Waktu simpan larutan paling lama sekitar satu tahun.
Dapar Elusi 50 ml
Untuk membuat 50 ml larutan, campurkan 5 ml 0,5 M dapar fosfat, 12,5 ml 1 M NaCl, 2,5 ml 2 M imidazole, dan aquades ditambahkan sampai volumenya 50 ml. Larutan disimpan pada suhu ruang. Waktu simpan larutan paling lama sekitar satu tahun.
Komposisi Reagen Sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) dan Western Blot (Garfin DE, 2003)
Gel Akrilamid 12%
Separating Gel
Larutan stok volume
akuadeion 4970 1,5 M Tris pH 8.8 1875 40% Acrylamide 3000 10% SDS 100 10% Ammonium persulfate 50 TEMED 5 Stacking Gel
Larutan stok Volume
akuadeion 2760 0,5 M Tris pH 6.8 500 40% Acrylamide 670 10% SDS 50 10% Ammonium persulfate 25 TEMED 5
43
10× Dapar Elektrofosesis running
30 gram Tris Base 145 gram Glisin 10 gram SDS
Tambahkan akuadeion sampai 1 L
Dapar Elektroforesis Transfer
25mM Tris 192mM Glisin 20% Metanol Sesuaikan pH sampai 8,3
Untuk membuat 1L larutan, campurkan 3,0 gram Tris dan 14,4 gram glisin pada 800 ml akuadeion kemudian tambahkan 200 ml metanol.
Tris-buffered saline (TBS)
0,02 M Tris-Cl 0,5 M NaCl Sesuaikan pH sampai 7,5
Sesuaikan pH sampai 8,3
Untuk membuat 1L larutan, campurkan 2,4 gram Tris dan 29,2 gram NaCl pada 800 ml akuadeion. PH larutan diatur sampai 7,5 menggunakan HCL kemudian tambahkan akuadeion sampai volumenya 1000 ml.
TBS-0,05% Tween 20
Untuk membuat 1L larutan, campurkan 0,5 ml Tween 20 ke dalam 1 liter TBS.
44
Lampiran 5 Kromatogram sekuen gen fusi gen scFv::HPR Primer Reverse
45
46
47
48
Lampiran 10 Perhitungan berat molekul protein scFv-GFP-HPR
Tabel 3 Penentuan kurva standar berdasarkan berat molekul marka protein BM Marka Protein
(kD)
Jarak migrasi Marka
protein (cm) Rf Log BM 116 0,46 0.092 2.06 66.2 0,99 0.197 1.82 45 1,85 0.368 1.65 35 2,40 0.478 1.54 25 3,25 0.647 1.39 18.4 4,1 0.816 1.26 14.4 4,5 0.896 1.16
Jarak migrasi larutan = 5,02 cm Nilai Relatifitas (Rf) =
y = -1.042x + 2.073
Jarak pita fraksi elusi hasil purifikasi protein = 1,6 cm x = Nilai Rf Rf pita protein = 0,32 y = -1.042x + 2.073 R² = 0.977 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Lo g M W Nilai Rf
Jarak migrasi protein Jarak migrasi larutan
49
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 17 Juli 1979 anak dari pasangan Raden Adiredja dan E.Sofiah. Penulis merupakan putri ketiga dari tiga bersaudara. Tahun 1997 penulis lulus dari SMA Negeri 3 Bogor, pada tahun yang sama penulis diterima di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI. Penulis menyelesaikan studi S1 pada tahun 2002. Pada tahun 2008, penulis bekerja sebagai staf peneliti di Pusat Penelitian Bioteknologi – LIPI dan pada tahun 2010 penulis melanjutkan
studi pada Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana IPB. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Kementerian Negara Riset dan Teknologi Republik Indonesia.