III. METODE PENELITIAN
3.5 Uji Sub-Kronik
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh toksisitas nikel terhadap tingkat konsumsi oksigen, kondisi hematologi dan stres sekunder ikan uji. Uji sub-kronik ini dilakukan dengan 3 perlakuan dan 3 ulangan yaitu : perlakuan A (tanpa nikel) sebagai kontrol, perlakuan B (1% dari LC50-96 jam), perlakuan C (5% dari LC50-96 jam), perlakuan D (10% dari LC50-96 jam) dan perlakuan E (30% dari LC50
3.5.1 Tingkat Konsumsi Oksigen
-96 jam). Pada tahap ini, digunakan ikan uji sebanyak 180 ekor dengan masing-masing unit sebanyak 20 ekor. Percobaan dirancang mengikuti Rancangan Acak Lengkap (RAL). Uji sub-kronik dilakukan selama 32 hari. Variabel yang diamati, sebagai berikut :
Tingkat konsumsi oksigen diukur dengan menghitung rasio oksigen terlarut pada awal dan akhir penelitian persatuan waktu. Botol respirasi yang digunakan diisi air sampai penuh, selanjutnya diaerasi dengan kuat (bubling) selama 2 hari agar kandungan oksigenya bertambah. Setelah diaerasi air media dibiarkan selama setengah jam, kemudian dilakukan pengukuran oksigen terlarut. Oksigen terlarut diukur dengan menggunakan DO-meter terkalibrasi. Ikan ditimbang kemudian dimasukkan kedalam botol respirasi, diukur DO awal, kemudian ditutup selama 1 jam kemudian diukur DO akhir, maka akan didapatkan tingkat konsumsi oksigen menggunakan rumus dibawah ini (Liao dan Huang 1975) :
TKO = {(DOawal – Doakhir)/W x t} x V……….(4) Keterangan :
TKO = Tingkat Konsumsi oksigen (mg O2/ gr tubuh /jam) DOawal = Oksigen terlarut pada awal pengamatan (ppm) DOakhir = Oksigen terlarut pada akhir pengamatan (ppm) W = berat ikan uji (gr)
t = periode pengamatan (jam)
27 Pengukuran konsumsi oksigen dilakukan sebanyak 4 kali yaitu pada hari ke-0, 8, 16, 24, dan 32.
3.5.2 Kadar Hematokrit (Ht)
Pengukuran hematokrit menggunakan Microhematocrit method. Ujung mikrohematokrit/mikrokapiler berheparin (yang dapat mencegah pembekuan darah dalam tabung) ditempelkan pada tetesan darah dan dibiarkan mengalir sendiri memasuki ruangan sampai volume darah mencapai ¾ bagian tabung kemudian salah satu ujung tabung disumbat dengan crestaseal. Darah disentrifuge pada kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Setelah itu akan terbentuk lapisan-lapisan yang terdiri dari lapisan-lapisan plasma yang jernih di bagian atas, kemudian lapisan putih abu-abu (buffy coat) yang merupakan trombosit dan leukosit dan lapisan eritrosit yang berwarna merah. Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur persentase volume eritrosit dari darah dengan menggunakan alat baca mikrohematokrit dan dinyatakan dalam persentase (% Ht).
3.5.3 Kadar Hemoglobin (Hb)
Pengukuran kadar hemoglobin pada prinsipnya adalah mengkonversikan hemoglobin dalam darah ke dalam bentuk asam hematin oleh asam klorida. Mula-mula darah diisap menggunakan pipet sahli hingga skala 20 mm3
3.5.4 Eritrosit
. kemudian dipindahkan ke dalam tabung Hb yang berisi HCl 0.1 N sampai skala 10 (kuning). Didiamkan selama 3–5 menit agar Hb bereaksi dengan HCl membentuk asam hematin, kemudian diaduk dan ditambahkan aquadestila (sedikit demi sedikit) hingga warnanya sama dengan standar. Pembacaan skala dilakukan dengan melihat tinggi permukaan larutan yang dikocok dengan skala lajur g% yang menunjukkan banyaknya Hb dalam gram setiap 100 ml darah dan dinyatakan dalam persentase (% Hb).
Sampel darah diencerkan dengan larutan Hayem untuk menghancurkan sel darah putih agar jumlah sel darah merah dapat dihitung. Pengenceran dilakukan dengan menggunakan piper pencampur berskala maksimum 101 yang dilengkapi pengaduk. Darah diisap hingga skala 0.5 pada pipet, ujung pipet dibersihkan dengan tissue, kemudian larutan hayem diisap dengan cepat dan hati-hati hingga
28 skala 101 menggunakan pipet yang sama. Pipet dikocok selama 3 menit dengan hati-hati sehingga darah tercampur merata pada bagian yang bertanda 1–101. Larutan pada ujung pipet yang tidak tercampur dibuang dengan menggunakan tissue. Darah yang teraduk diteteskan ke dalam hemocytomer yang dilengkapi dengan gelas penutup hingga memenuhi seluruh permukaan yang berskala. Selanjutnya dilakukan penghitungan di bawah mikroskop.
Untuk menghitung jumlah eritrosit digunakan 5 kotak kecil yang terletak di bagian tengah kamar hitung yaitu empat kotak di sudut-sudutnya dan satu kotak ditengah-tengah. Satu kotak kecil luasnya adalah 0.2 x 0.2 mm = 0.04 mm2, sehingga 5 kotak itu luasnya 5 x 0.04 mm2 = 0.2 mm2. Kedalaman kamar hitung adalah 0.1 mm, sehingga volume cairan di dalam kamar hitung yang diamati adalah 0.2 mm2 x 0.1 mm = 0.02 mm3 atau 2/100 mm3. Dengan demikian jumlah eritrosit per mm3 darah dapat diketahui yaitu 100/2 = 50 a butir. Karena menggunakan pengencer 0.5:100 atau 1:200, maka jumlah eritrosit di dalam mm3 darah dapat diketahui yaitu 50 x 200 x a butir atau a x 104
3.5.5 Leukosit
butir eritrosit.
Sampel darah diencerkan dengan larutan Turks untuk menghanculkan sel darah merah agar jumlah sel darah putih dapat dihitung. Untuk mengencerkan leukosit digunakan pipet berskala maksimum 11 yang dilengkapi pengaduk. Mula-mula darah diisap dengan pipet hingga skala 1.0, ujung pipet dibersihkan dengan kertas tissue kemudian larutan Turks diisap dengan cepat dan hati-hati hingga skala 11 menggunakan pipet yang sama. Pencampuran dilakukan dengan menggoyang pipet selama 3 menit agar darah tercampur dengan homogen.
Setelah pencampuran selesai, larutan pada ujung pipet yang tidak tercampur dibuang dengan menggunakan tissue. Kemudian teteskan pada kamar hitung hemocytometer dengan cara menempelkan ujung pipet pada pertemuan antara dasar kamar hitung dan kaca penutup. Perhitungan dilakukan dengan cara yang sama pada perhitungan eritrosit. tetapi yang digunakan 16 kotak pada setiap sudut. Jika jumlah semua butir darah putih pada keempat kotak itu adalah a, maka per mm3 larutan mengandung a x 10/4. Faktor pengenceran 200 kali, maka jumlah leukosit per mm3 darah adalah 200 x 10/4 x a = a x 50 butir.
29
3.5.6 Rasio Netrofil-limfosit
Dari satu tetes darah kemudian dibuat preparat darah ulas tipis pada gelas objek, kemudian segera dikeringkan dengan cara mengibas-ngibaskan di udara. Setelah kering kemudian dilakukan fiksasi dalam larutan metanol selama 5 menit. Selanjutnya dilakukan perendaman dalam larutan gyemsa selama 15 menit. Kemudian dibilas dengan akuades dan dikeringkan selama satu hari. Setelah kering kemudian direndam dalam xylol selama 5 menit, dan ditutup dengan menggunakan bioleit. Sediaan diamati pada mikroskop dengan pembesaran 1000x dan dilakukan perhitungan masing-masing jenis leukosit hingga mencapai 100 sel leukosit (Aqualex, 2008).
3.6Kadar Glukosa Darah
Pemeriksaan kadar glukosa dalam darah ikan uji dilakukan sebagai indikator stres sekunder akibat toksisitas nikel. Pengukuran kadar glukosa dalam darah dilakukan pada awal dan akhir penelitian. Sebelum pengambilan darah, ikan dipuasakan selama 24 jam. Pengambilan sampel darah diupayakan dilakukan dalam waktu yang sama. Prosedur pengukuran glukosa dalam darah yaitu : plasma darah diambil dengan cara disentrifuge, selanjutnya 0,05 ml plasma darah, glukosa standar dan akuades dimasukan kedalam masing-masing tabung reaksi yang telah berisi 3,5 ml color reagent (perbandingan asam asetat dan ortotoluidine = 94 : 6). Setelah itu dipanaskan dalam water bath tertutup selama 10 menit pada suhu 100 0
……….(5)
C. Selanjutnya setelah didinginkan pada suhu kamar, lalu dibaca dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 635 nm. Selanjutnya dihitung dengan menggunakan rumus, sebagai berikut :
Keterangan : GD = glukusa darah (mg/100ml) Au = absorbansi sampel
Cs = konsentrasi standar As = absorbansi standar