METODE PENELITIAN
F. Teknik Pengumpulan Data
F.2. Langkah Uji Eksperimen
Adapun langkah-langkah uji eksperimen untuk menemukan Biomarker
Metallothionein dapat dikemukakan sebagai berikut :
• Penentuan sampel ikan
Sebelum penentuan sampel penelitian, diambil 5 ekor ikan mas dan ikan nila dari BBI Ungaran, dianalisis dengan HPLC dan Flame AAS untuk memastikan bahwa sampel tidak mengakumulasikan logam berat Cd, Pb dan Hg. Setelah sampel dipastikan tidak mengandung Cd, Pb dan Hg selanjutnya diambil sampel ikan mas (Cyprinus carpio L.) dan ikan nila (Oreochromis nilotucus L.), masing-masing sebanyak 100 ekor. Keseluruhan benih sampel diambil dari kolam di Balai Benih Ikan Ungaran Kabupaten Semarang. Umur benih sampel yang diambil di awal penelitian adalah 2,5 bulan, panjang tubuh 8 cm dan berat tubuh 19 gram. Ikan mas dan nila masing-masing diambil 200 ekor, selanjutnya dengan secara random dibagi dalam 2 kelompok, yaitu kelompok kontrol dan kelompok perlakuan, masing-masing 100 ekor. Sampel ikan kelompok kontrol dipelihara dengan KJA di kolam Balai Benih Ikan Ungaran Kabupaten Semarang. Sedangkan sampel ikan kelompok perlakuan dipelihara di KJA di bagian hilir sungai Kaligarang (Kaligarang segmen 6). Uji kadar logam berat pada sampel air dilakukan untuk mengetahui keberadaan polutan logam berat di air pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan, terutama kadar Cd, Pb dan Hg.
• Pengambilan sampel ikan dari KJA
Sampel ikan mas dan nila kelompok kontrol diambil dari KJA pada kolam di Balai Benih Ikan Ungaran, sedangkan sampel kelompok perlakuan adalah ikan mas dan nila yang diambil dari KJA di bagian hilir sungai Kaligarang. Pengambilan sampel
kedua kelompok dilakukan setelah satu setengah bulan ikan berada dalam kondisi perlakuan, sehingga umur ikan genap 4 bulan. Hal tersebut dimaksudkan agar jika terdapat pajanan logam berat sudah dapat diserap oleh tubuh ikan untuk menginduksi munculnya metallothionein. Pada uji pendahuluan ikan dengan usia 4 bulan yang hidup pada perairan terpajan logam berat sudah muncul MT-Cd.
• Pembedahan ikan mas dan nila untuk dilakukan isolasi metallothionein
Pembedahan sampel ikan dilakukan untuk mengambil organ hati dan gonade dengan langkah seperti yang terdapat pada lampiran 12. Selanjutnya dilakukan prosedur isolasi metallothionein yang diadopsi dari penelitian (Chassaigne dan Lobinski. 1999). Langkah pertama, 5 gram sampel hati ikan dilunakkan dengan teknik
thawing pada suhu 4oC. Setelah lunak, sampel hati dipotong-potong,dihaluskan
menggunakan mortal dan dihomogenisasi dengan larutan Tris-HCl pH 8,1 dengan perbandingan 2:1 (10 ml Tris-HCl : 5 gram sampel hati). Sentrifugasi dilakukan pada sampel hati dengan kecepatan 10.000 g selama 30 menit pada suhu 40C. Supernatan
diambil dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 110.000 g selama 60 menit pada suhu 4oC. Hasil isolasi berupa sampel yang mengandung metallothionein.
• Analisis ekspresi metallothionein
Hasil isolasi metallothionein selanjutnya dianalisis menggunakan alat High- Performance Liquid Cromatography (HPLC) untuk melihat adanya ekspresi
metallothionein pada hati ikan akibat efek toksik logam berat Cd, Pb dan Hg yang mencemari air sungai. Proses analisis larutan sampel hati ikan kelompok kontrol dan perlakuan serta analisis larutan standar Cd, Pb dan Hg dilakukan dengan menggunakan EZ Chrom Elite Jasco HPLC System (UV2070-PU2080-LCnet II/ADC), dengan panjang gelombang 254 nm; fase diam (kolom symetryshield RP 18, biasa disebut C-18) diameter 3,5 mikrometer dengan panjang kolom 4,5 kali
150 mm; dan fase gerak asetonitril: tris buffer HCl pH 8,1 = 40: 60 (v/v). Langkah analisis secara rinci ada pada lampiran 12.
• Analisis EROD, dan penentuan LSI, GSI serta BCF
- Prosedur Pemeriksaan Aktifitas EROD (Klotz, Stegeman and Walsh, 1984)
Prosedur pemeriksaan aktivitasEROD dilakukan dengan langkah sebagai berikut. Ikan dibedah, kemudian liver ikan diambil, lalu ditimbang, selanjutnya liver dimasukkan dalam microtube dan dihancurkan. Setelah liver benar-benar hancur kemudian ditambahkan 1 ml larutan buffer EROD, dicampur dan didiamkan sampai liver mengendap. Selanjutnya larutan dalam microtube tersebut diambil dan dimasukkan dalam kuvet spektrofotometer. Larutan dibaca pada panjang gelombang 572 nm, suhu 30oC untuk mengetahui aktivitas EROD pada
sampel, dengan cara membaca serapan yang tertera pada spektrofotometer (angka yang muncul menunjukkan besarnya nilai aktivitas EROD dalam satuan pmol/min/mg protein). Adapun larutan Buffer EROD terdiri dari 100 mM buffer NaH2PO4 pH 7.6, 1.15% KCl, 2 µM 7-ethoxyresorufin, dan 0.5 mM
Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (NADPH). Adapun langkah pemeriksaan EROD secara rinci terdapat dalam lampiran 12.
- Prosedur Pengukuran Liver Somatic Index (LSI)
Langkah yang dilakukan dalam pengukuran LSI adalah sebagai berikut . Pertama kali sampel ikan ditimbang berat tubuhnya, maupun berat liver/ hati. Kemudian dilakukan penghitungan LSI, dengan rumus sebagai berikut:
Berat hati ikan
LSI = --- x 100 Berat tubuh ikan
- Prosedur Pengukuran Gonad Somatic Index (GSI)
Pengukuran GSI dilakukan dengan langkah-langkah sebagai berikut :
Langkah yang dilakukan dalam pengukuran GSI adalah sebagai berikut . Pertama kali sampel ikan ditimbang berat tubuh, maupun berat gonade. Kemudian dilakukan penghitungan nilai GSI, dengan rumus sebagai berikut :
Berat gonade ikan
GSI = --- x 100 Berat tubuh ikan
Adapun langkah penentuan GSI secara rinci terdapat pada lampiran 12.
- Prosedur Pengukuran Bioconcentration Factor (BCF) (*)
Langkah-langkah yang dilakukan dalam pengukuran BCF adalah sebagai berikut. Hati ikan mas dan ikan nila dianalisis menggunakan HPLC untuk mengetahui kadar Cd, Pb dan Hg di hati yang menyebabkan munculnya MT-Cd, MT-Pb dan MT-Hg. Selanjutnya dilakukan penghitungan nilai BCF yaitu perbandingan antara konsentrasi/kadar Cd, Pb dan Hg pada organ hati dengan konsentrasi Cd, Pb dan Hg pada perairan dengan rumus :
Konsentrasi logam di hati BCF = --- Konsentrasi logam di perairan
Adapun langkah penentuan BCF secara rinci teradapat pada lampiran 12.
Keterangan(*) : BCF diukur hanya pada saat awal penelitian sehingga belum mencapai jenuh (steady state).
Adapun langkah-langkah penelitian biomarker pada ikan sebagai alat monitoring pencemaran logam berat di perairan tadi secara ringkas dapat dilihat pada bagan alir halaman berikut ini.