Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari hubungan genetik antara tiga tipe sitoplasma sistem CMS Wild Abortive (WA), Gambiaca, dan Kalinga. Material genetik yang digunakan adalah 9 hibrida yang merupakan turunan dari 3 galur elite restorer (PK 90, PK 12, dan BP 11) dan 3 GMJ introduksi IRRI (IR 58025A- WA, IR 80154A-Gambiaca, dan IR 80156A-Kalinga). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pada populasi F1, hibrida yang merupakan persilangan A x R
dengan kombinasi persilangan menunjukkan tingkat fertilitas serbuk sari dan spikelet yang mirip. Hal ini mengindikasikan bahwa terdapat kesamaan proses biologi yang mempengaruhi ketiga sistem sitoplasma ini. Pola segregasi pada populasi F2 untuk karakter fertilitas serbuk sari pada GMJ tipe WA dan Gambiaca
mengindikasikan keterlibatan dua gen pemulih kesuburan yang dominan, sedangkan tipe Kalinga diduga dikendalikan oleh gen dominan tunggal. Galur restorer PK 12 mampu memulihkan ketiga GMJ dengan ketiga sitoplasma lebih baik dibanding galur restorer PK 90 dan BP11. Primer RM490 dan RM258 potensial digunakan sebagai penanda gen Rf3 dan Rf4 pada pemulihan kesuburan tipe Wild Abortive.
Abstract
The genetic relationship among three cytoplasmic male sterility (CMS) systems, consisting of Wild Abortive (WA), Gambiaca, and Kalinga was studied. The results showed that the F1 plants derived from crosses involving A and R lines
of the respective cytoplasm and their cross-combination showed similar pollen and spikelet fertility values, indicating that similar biological processes governing fertility restoration in these three CMS systems. The results from an inheritance of fertility restoration was studied in crosses involving three elite restorer lines of rice viz. PK 90, PK 12, and BP 11 and three male sterile line IR 58025A (WA sources of cytoplasmic male sterility), IR 80154A (Gambiaca), and IR 80156A (Kalinga). The results from the inheritance study showed that the pollen fertility restoration in WA and Gambiaca CMS systems was governed by two independent and dominant genes with classical duplicate gene action, while in Kalinga system it was controlled by one single dominant gene. The restorer line PK 12 have restoring ability stronger than PK 90 and BP 11. The SSR primers RM490 and RM258 revealed potential to be markers of Rf3 and Rf4 genes in restoring fertility of WA system.
Keywords: CMS, fertility restorer gene, hybrid rice, Wild Abortive (WA), Gambiaca, Kalinga
Pendahuluan
Sistem mandul jantan sitoplasma atau cytoplasmic male sterility (CMS) bersama dengan pemulihan kesuburan merupakan mekanisme penting dalam perakitan padi hibrida sistem tiga galur (Virmani & Wan 1988). CMS secara maternal diturunkan melalui ketidakmampuan tanaman untuk memproduksi serbuk sari yang berhubungan dengan ketidaknormalan open reading frames (ORFs) yang ditemukan pada genom mitokondrida. Galur mandul jantan dapat dipulihkan dengan gen fertility restorer (Rf) yang terletak di dalam inti (Chase & Babay-Laughnan 2004; Hanson & Bentolila 2004). Oleh karena itu, sistem CMS- Rf merupakan mekanisme tepat untuk mempelajari interaksi genetik dan fungsi kooperatif gen dalam mitokondria dan inti (Wang et al. 2006).
Perakitan padi hibrida di Indonesia menggunakan sistem tiga galur. Galur mandul jantan (GMJ) merupakan tetua yang tidak mampu memproduksi serbuk sari. Galur pelestari atau maintainer merupakan galur yang secara genetik sama dengan GMJ, memiliki sitoplasma fertil, dan mampu memproduksi serbuk sari normal. Galur pemulih kesuburan atau restorer merupakan galur yang mampu memulihkan kesuburan GMJ karena memiliki gen dominan (bentuk dominan homozigot-RfRf) sehingga hibrida F1 yang dihasilkan memiliki sitoplasma normal
atau fertil (Virmani 2003).
Sampai saat ini, lebih dari 20 sumber sitoplasma CMS telah diidentifikasi pada padi (Fujii et al. 2010). Sistem CMS/Rf tersebut antara lain: sistem Wild Abortive (WA), Dissi, Gambiaca, Boro Type II (BT), Kalinga (Ka), dan Honglian (HL) (Lin & Yuan 1980; Yuan & Virmani 1988; Li & Zhu 1988; Pradhan et al. 1992). Sistem sitoplasma WA (Indica - Oryza rufipogon Griff.)), Dissi (Indica, varietas DS 97A, dari Senegal), dan Gambiaca (Indica dari Afrika) termasuk sistem mandul jantan sporofitik dengan ciri khas terjadinya pengguguran pada serbuk sari. Butir serbuk sari dari GMJ turunan sistem sporofitik akan teraborsi pada tahap uninukleat; sehingga, tipe ini lebih stabil dibanding GMJ turunan tipe gametofitik yang serbuk sarinya gugur pada tahap binukleat dan trinukleat (Chaudhary et al. 1981; Lin & Yuan 1980). Di antara tipe-tipe sitoplasma, sistem GMJ-WA, merupakan sumber CMS yang paling banyak digunakan untuk produksi benih padi hibrida terhitung > 90% areal produksi hibrida di China menggunakan sistem ini (Xie et al. 2010; Huang et al. 2014)
Penelitian pewarisan sifat pemulihan kesuburan pada sistem CMS-WA telah banyak dilakukan. Mayoritas studi melaporkan pewarisan pemulihan kesuburan GMJ tipe WA bersifat digenik dengan dua gen pemulih yaitu Rf3 dan Rf4 (Bharaj et al. 1991; Shah et al. 2012). Yao et al. (1997) mengidentikasi dua lokus pada kromosom no 1 (Rf3) dan kromosom no 10 (Rf4) serta memperlihatkan bahwa pengaruh gen Rf3 lebih besar dibanding Rf4 terhadap pemulihan kesuburan serbuk sari GMJ tipe WA. Namun demikian, beberapa peneliti menunjukkan mekanisme pengendalian pemulihan kesuburan yang beragam pada tipe WA antara lain: monogenik (Tan et al. 2008), digenik (Nematzadeh & Kiani 2010), dan trigenik (Hossian et al. 2010).
Galur mandul jantan tipe Gambiaca dikendalikan terutama oleh gen Rf3, sehingga galur-galur pemulih kesuburan tipe WA yang aksi gen Rf3 nya lebih kuat dibanding Rf4 dapat memulihkan kesuburan dengan baik GMJ tipe ini (Sattari et al. 2008). Galur mandul jantan tipe Kalinga masih belum teridentifikasi
gen Rf yang memulihkannya, namun beberapa penelitian menunjukkan bahwa ada kemiripan tingkat pemulihan kesuburan antara tipe WA dengan Kalinga (Khera et al. 2012; Das et al. 2013). Sahu et al. (2014) melaporkan beberapa galur restorer dapat memulihkan kesuburan serbuk sari dan spikelet dengan baik pada GMJ baik tipe WA maupun Kalinga.
Di Indonesia, sebagian besar hibrida yang dikembangkan merupakan turunan GMJ tipe WA. Penggunaan satu tipe sitoplasma dalam jangka waktu lama dan areal produksi luas dapat menyebabkan terjadinya kerapuhan genetik pada sitoplasma WA baik karena cekaman biotik maupun abiotik seperti yang terjadi pada jagung (Ullstrup 1972) dan millet (Kumar et al. 1983). Karenanya, penting untuk menggunakan GMJ dengan tipe sitoplasma berbeda. Namun demikian, keunikan, secara genetik, dan lokasi gen Rf untuk sistem CMS Kalinga dan Gambiaca belum banyak diketahui. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk (1) mengevaluasi hubungan genetik di antara WA, Kalinga, dan Gambiaca, (2) mengidentifikasi jumlah gen yang mengendalikan pemulihan kesuburan tiap sitoplasma, (3) memverifikasi primer-primer SSR terkait dengan gen yang mengendalikan pemulihan kesuburan tiga sistem CMS, dan (4) mempelajari pengaruh gen Rf pada pemulihan kesuburan tanaman individu dalam populasi F2
populasi.
Bahan dan Metode
Penelitian ini terbagi atas tiga sub kegiatan yaitu (1) Persiapan materi pertanaman dan generasi persilangan, (2) Evaluasi fertilitas serbuk sari dan spikelet pada pertanaman F1 dan F2, serta (3) Verifikasi gen pemulih kesuburan
melalui marka SSR.
Persiapan Materi Pertanaman dan Generasi Persilangan
Pembentukan populasi F1 dilakukan pada bulan November 2014 – Februari
2015, sedangkan pembentukan populasi F2 dilakukan pada Maret – Juli 2015.
Kedua kegiatan persiapan materi pertanaman ini dilaksanakan di rumah kaca dan lapangan KP Sukamandi BB Padi, Subang, Jawa Barat. Pembentukan populasi F1
dilakukan dengan melakukan handcrossing antara GMJ dengan galur R. Kombinasi F1 hibrida yang digunakan adalah kombinasi hibrida dengan potensi
hasil tinggi berdasarkan hasil kegiatan III. Teridentifikasi pada penelitian sebelumnya bahwa PK 90 mampu memulihkan kesuburan dengan baik IR 58025A (GMJ-WA), PK 12 memulihkan IR 80154A (GMJ-Gambiaca), dan BP 11 memulihkan dengan baik IR 80156A (GMJ-Kalinga). Materi genetik ini merupakan turunan 3 tipe GMJ IRRI yaitu IR 58025A (GMJ-WA), IR 80154A (GMJ-Gambiaca), dan IR 80156A (GMJ-Kalinga) dengan galur R antara lain: PK 90, PK 12, dan BP 11, sehingga populasi F1 dan F2 yang diuji sebagaimana pada
Tabel 30.
Pada saat fase bunting, sebanyak 2-3 malai dari tanaman F1 ditutup dengan
kantong kertas. Bagging atau penyungkupan ini dilakukan sebelum antesis untuk menghindari penyerbukan dari serbuk sari tanaman lain. Panen dilakukan terhadap malai yang disungkup. Malai tersebut dipanen dan selanjutnya di tanam sebagai populasi F2.
Sebanyak 100 tanaman pada populasi F2 di tanam dengan satu bibit per
lubang tanam. Jarak tanam yang digunakan adalah 20 cm x 20 cm. Pada umur 30 HSS, setiap tanaman diambil sampel daun untuk ekstraksi DNA. Pemeliharaan dilakukan secara optimal sesuai rekomendasi tanam. Pada fase pembungaan, setiap tanaman di ambil spikelet yang masih menutup pada posisi atas, tengah, dan bawah malai untuk keperluan pengamatan fertilitas serbuk sari. Selanjutnya pada fase panen, sampel malai di ambil setiap tanaman untuk diamati fertilitas spikeletnya.
Tabel 30 Materi genetik padi hibrida untuk verifikasi gen pemulih kesuburan
No Hibrida Sumber sitoplasma pada GMJ
1 IR 58025A/PK 90 Wild Abortive
2 IR 58025A/PK 12 Wild Abortive
3 IR 58025A/BP 11 Wild Abortive
4 IR 80154A/PK 90 Gambiaca 5 IR 80154A/PK 12 Gambiaca 6 IR 80154A/BP 11 Gambiaca 7 IR 80156A/PK 90 Kalinga 8 IR 80156A/PK 12 Kalinga 9 IR 80156A/BP 11 Kalinga
Evaluasi Fertilitas Serbuk Sari dan Spikelet pada Populasi F1 dan F2
Kegiatan ini dilakukan pada November 2014 – Februari 2015 (pertanaman F1) dan Maret – Juli 2015 (pertanaman F2) di lapangan KP Sukamandi, Balai
Besar Penelitian Tanaman Padi, Subang, Jawa Barat. Evaluasi fertilitas serbuk sari dan fertilitas spikelet pada pertanaman F1 dan F2 dilakukan terhadap seluruh
kombinasi AxR (9 kombinasi persilangan).
Pengamatan fertilitas serbuk sari. Saat tahap pembungaan sebelum antesis, sekitar 15 spikelet per tanaman diambil secara random dan dimasukkan ke dalam botol berisi larutan alkohol 70%. Serbuk sari diambil secara random dari 5 spikelet bagian bawah, tengah, dan atas malai utama. Butir serbuk sari diwarnai dengan larutan iodine potassium iodide (I2-KI) 1% pada gelas slide dan dihitung
di bawah mikroskop perbesaran 40X. Menurut Chaudhary et al. (1981), butir serbuk sari diklasifikasikan fertil bila bentuknya bulat dan sepenuhnya terwarnai I2-KI dan steril bila tidak terwarnai atau terwarnai tapi pucat (Gambar 7).
Penghitungan jumlah butir serbuk sari berdasar tiga bidang pandang mikroskop. Persen fertilitas serbuk sari ditentukan dengan membagi serbuk sari yang steril atau fertil dengan total butir serbuk sari yang diamati. Menurut Govinda Raj dan Virmani (1988) tingkat fertilitas serbuk sari diklasifikasikan ke dalam empat group yaitu: fertil sempurna (FF = 61 -100 % fertil), fertil sebagian (PF = 31 - 60% fertil), steril sebagian (PS = 1-30% fertil) dan steril sempurna (FS = 0% fertil). Untuk analisis dengan Chi-Kuadrat (χ2), data pengamatan fertilitas serbuk
sari pada populasi F2 kemudian dibagi menjadi dua kelas yaitu kelas fertil (FF +
PF + PS) dan kelas steril (Seesang et al. 2014). Gambar 8 menunjukkan serbuk sari tunggal dari tiap tipe sitoplasma.
Gambar 7 Klasifikasi sterilitas serbuk sari pada padi
Gambar 8 Butir serbuk sari GMJ padi dengan tipe sitoplasma berbeda Pengamatan fertilitas spikelet. Selain analisis fertilitas serbuk sari, data jumlah gabah isi per malai pada individu tanaman F2 juga digunakan untuk
konfirmasi pewarisan pemulihan kesuburan. Fertilitas spikelet ditentukan dengan menghitung jumlah gabah isi dan hampa dari 15 malai utama yang disungkup sebelum antesis dan dipanen 25-30 hari setelah pembungaan. Persen gabah fertil dihitung dengan membagi jumlah gabah isi dengan gabah total per malai. Govinda Raj dan Virmani (1988) mengklasifikasikan fertilitas spikelet ke dalam empat group yaitu: fertil sempurna (FF = 81 -100 % fertil), fertil sebagian (PF = 31 - 80% fertil), steril sebagian (PS = 1-30% fertil) dan steril sempurna (FS = 0% fertil). Menurut Seesang et al. (2014), berdasarkan pengisian gabah per malai atau fertilitas spikelet analisis Chi-Kuadrat (χ2) dilakukan dengan membagi data
pengamatan menjadi dua kelas yaitu fertil (fertilitas spikelet >> 2%) dan steril (fertilitas spikelet < 2%).
Verifikasi Gen Pemulih Kesuburan Melalui Marka SSR
Kegiatan ini dilakukan pada Agustus – Desember 2015 di rumah kaca dan laboratorium BB Biogen, Bogor Jawa Barat. Bahan yang digunakan untuk isolasi DNA padi meliputi daun muda tanaman padi yang berumur ± 4 minggu setelah sebar dari populasi F2 dan tetua hibridanya.
Skrining primer. Pada kegiatan ini 15 marka SSR untuk menandai gen Rf3 dan Rf4 diidentifikasi polimorfisnya terhadap populasi F2 yang digunakan (Tabel
31).
Tabel 31 Kode dan sekuen dari pasangan primer SSR
Isolasi DNA. Sampel daun dengan ukuran ± 4 cm dimasukkan ke dalam microtube boil proof flat cap 2.0 mL, dan diberi carbide beads (gotri) lalu ditambahkan 0.25 N NaOH sebanyak 100 µL. Sampel dihaluskan menggunakan 33 Tissue Lyser System (Qiagen, Tokyo, Jepang) selama 2 menit pada kecepatan 25 goyangan/detik sebanyak dua kali. Setelah itu sampel dalam microtube yang telah hancur ditambahkan 0.1 M Tris HCl sebanyak 400 µL lalu disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 15 menit. Cairan sampel diambil sebanyak 200 µL, dimasukkan ke dalam microtube boil proof flat cap 2.0 ml. Untuk pengenceran DNA 20x dilakukan dengan menambahkan 95 µL nano pure water dengan 5 µL DNA di dalam microtube boil proof flat cap 0.6 mL. Hasil ekstraksi selanjutnya disiapkan untuk analisis PCR.
Analisis PCR. Hasil isolasi DNA di atas selanjutnya diamplifikasi dengan mesin PCR. Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan volume 10 µL terdiri atas 5 µlL master mix PCR KAPA 2G Fast Ready Mix with Dye (larutan penyangga, dNTP, enzim Taq polymerase), 2 µL primer 10 µM (forward dan reverse), 2 µL DNA dan 2 µL nano pure water. Sebelum dilakukan PCR ditambahkan ± 5 µL mineral oil.
Kemudian cocktail DNA diamplifikasi dengan mesin PCR pada kondisi denaturasi awal 94 0C selama 3 menit, denaturasi 94 0C selama 1 menit, penempelan marka 55 0C selama 1 menit, perpanjangan primer 72 0C selama 2 menit, dan perpanjangan primer akhir 72 0C selama 2 menit. Tahap denaturasi, penempelan dan perpanjangan primer diulang sebanyak 35 kali, kemudian diikuti dengan proses ekstensi primer akhir selama 5 menit pada suhu 72 0C. Tahap terakhir adalah inkubasi pada suhu 10 0C selama 30 menit (Utami et al. 2011).
Elektroforesis DNA. Produk PCR selanjutnya dilihat dengan elekroforesis. Sebanyak 10 μL produk PCR ditambahkan dengan loading dye 2 μL dan dicampur sempurna, lalu diambil 3 μL dan dimasukkan ke dalam sumur gel poliakrilamid 4% dalam buffer Tris-Boric acid-EDTA (TBE) 1x. Marka 1 kb ladder disertakan untuk melihat ukuran DNA. Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus dengan tegangan listrik 80 volt selama 100 menit. Gel poliakrilamid diwarnai dengan larutan etidium bromida 0.5 µg/ml selama 10 menit, kemudian dihilangkan pewarnaannya dengan air selama 5 menit. Gel poliakrilamid selanjutnya divisualisasi dengan chemidoc gelsystem.
Hasil molekuler SSR dianalisis menggunakan uji test Chi-Kuadrat (χ2) untuk mengetahui kesesuaian proporsi data Mendelian fenotipe dan genotipe marka pada populasi F2 dengan membandingkan distribusi frekuensi pengamatan
dengan frekuensi teoritis berdasar nilai harapannya. Analisis Chi-Kuadrat digunakan untuk melihat proporsi dari primer molekuler dalam populasi yang dianalisis apakah mengikuti hukum Mendel atau mirip dengan uji fenotipenya. Verifikasi primer menggunakan data fenotipe dan genotipe dari populasi yang sama.
Hasil dan Pembahasan
Analisis Fertilitas Serbuk Sari dan Spikelet pada Populasi Pertanaman F1
Tabel 32 dan Tabel 33 menunjukkan fertilitas serbuk sari berkisar 71.7% (IR 80156A/PK 90) – 80.9% (IR 58025A/PK 90), sedangkan fertilitas spikelet hibrida yang diuji bervariasi antara 63.7% (IR 80154A/PK 90) – 79.9% (IR 80156A/PK 12). Seluruh kombinasi persilangan menunjukkan tingkat serbuk sari fertil sempurna (61 – 100%) sedangkan tingkat spikelet bersifat fertil sebagian (31 – 80%). Tanaman memperlihatkan fertilitas spikelet lebih rendah dibanding fertilitas serbuk sari dimungkinkan karena faktor lingkungan atau interaksi intra- dan inter-alelik pada padi (Ikehashi 1991). Pada populasi pertanaman F1 yang
merupakan turunan dari persilangan IR 58025A/PK 12, IR 58025A/BP 11, dan IR 80154A/BP 11 menunjukkan nilai fertilitas serbuk sari dan spikelet yang setara (Tabel 32 dan Tabel 33). Hal ini mengindikasikan adanya kesamaan proses biologi yang mempengaruhi pemulihan kesuburan pada GMJ sistem sitoplasma WA, Kalinga, dan Gambiaca untuk galur restorer PK 12 dan BP 11. Hasil yang sama dijelaskan oleh Li dan Zhu (1988), yang melaporkan bahwa GMJ Gambiaca memiliki hubungan maintainer-restorer sama dengan sistem GMJ WA, begitu pula dengan GMJ Kalinga (Khera et al. 2012).
Kondisi di antara tiga galur restorer, galur PK 12 memperlihatkan tingkat pemulihan kesuburan yang paling kuat dibanding PK 90 dan BP 11. Hal ini ditunjukkan dengan nilai rata-rata fertilitas serbuk sari dan spikelet hibrida yang
diturunkan dari galur PK 12 lebih tinggi yaitu masing-masing 78.3 dan 76.6% (Tabel 32 dan Tabel 33). Analisis fertilitas serbuk sari mengelompokkan semua kombinasi hibrida ke dalam kelas fertil sempurna (61 – 100%), sedangkan berdasarkan fertilitas spikelet, semua hibrida berada pada kelas fertil sebagian (31 – 80%). Pemulihan fertilitas serbuk sari antara IR 58025A/PK 12 dan IR 58025A/BP 11, IR 80154A/PK 90 dan IR 80154A/BP 11, serta IR 80156A/PK 90 dan IR 80156A/PK 12 mengindikasikan bahwa gen pemulih kesuburan pada PK 90 (WA), PK 12 (Gambiaca), dan BP 11 (Kalinga) kemungkinan bersifat alelik dan dapat berfungsi menggantikan satu sama untuk memulihkan tingkat kesuburan serbuk sari yang setara. Kemungkinan lain adalah gen Rf tidak alelik dan masing-masing galur restorer membawa gen Rf yang berbeda untuk tiap sumber sitoplasma. Suatu galur restorer sama dapat memulihkan GMJ berbeda tipe sitoplasma ini telah dilaporkan oleh Sahu et al. (2014) dengan galur restorer Baghdidan dapat memulihkan kesuburan GMJ IR 58025A (WA) dan CRMS32A (Kalinga). Adapun Sattari et al. (2008) melaporkan bahwa galur restorer R34686R dapat memulihkan kesuburan GMJ IR 58025A (WA) dan IR75601A (Gambiaca). Tabel 32 Fertilitas serbuk sari pada tanaman F1 hibrida padi turunan AxR
kombinasi GMJ sistem WA, Kalinga, dan Gambiaca dengan 3 galur R Tetua
Fertilitas serbuk sari (%) F1 hibrida:
PK 90 PK 12 BP 11 Rata-rata
(WA) (Gambiaca) (Kalinga)
IR 58025A (WA) 80.9±0.7 78.7±1.6 78.6±1.8 79.4
IR 80154A (Gambiaca) 75.7±0.8 75.9±1.8 75.5±1.9 75.7 IR 80156A (Kalinga ) 71.7±2.3 80.2±1.5 79.0±1.3 77.0
Rata-rata 76.1 78.3 77.7
* Rata-rata±standar error.
Tabel 33 Fertilitas spikelet pada tanaman F1 hibrida padi turunan AxR kombinasi
GMJ sistem WA, Kalinga, dan Gambiaca dengan 3 galur R Tetua
Fertilitas spikelet (%) F1 hibrida:
PK 90 PK 12 BP 11 Rata-rata
(WA) (Gambiaca) (Kalinga)
IR 58025A (WA) 76.9±1.2 77.6±2.4 71.3±1.7 75.3
IR 80154A (Gambiaca) 63.7±2.9 72.2±1.7 71.9±1.4 69.3 IR 80156A (Kalinga ) 66.8±1.8 79.9±1.9 77.8±2.5 74.8
Rata-rata 69.1 76.6 73.7
* Rata-rata ±standar error.
Terlihat adanya perbedaan besarnya tingkat fertilitas serbuk sari dan spikelet antar hibrida. Menurut Das et al. (2013), tingkat pemulihan kesuburan setiap genotipe F1 hibrida dapat beragam sesuai dengan latar belakang sitoplasma dan
kemampuan pemulihan kesuburannya. Secara genetik, keragaman tingkat pemulihan kesuburan dapat disebabkan pengaruh genotipe tetua betina dan/atau perbedaan penetrasi gen pemulih kesuburan pada galur GMJ yang berbeda (Jayasudha & Sharma 2010) atau adanya sterilitas intervarietal hibrida (Govinda Raj & Virmani 1988). Gen-gen tertentu dapat bertanggung jawab untuk perbedaan tingkat fertilitas. Dilaporkan bahwa beberapa galur restorer yang digunakan untuk sistem WA seperti IR 24, IR 36, dan IR 5 menunjukkan tingkat pemulihan kesuburan yang tidak sama dengan galur GMJ seperti IR17492A yang juga memiliki sitoplasma WA (IRRI 1986). Selain itu, faktor lingkungan seperti cekaman kekeringan, suhu tinggi dan sebagainya dapat berpengaruh pada abnormalitas gen inti dan perkembangan serbuk sari yang mempengaruhi tingkat fertilitas spikelet (Joshi et al. 2007). Pada penelitian ini faktor cekaman kekeringan pada saat pembungaan berpengaruh pada rendahnya fertilitas spikelet dibanding fertilitas serbuk sari.
Analisis Fertilitas Serbuk Sari pada Populasi Pertanaman F2
Analisis fertilitas serbuk sari dapat digunakan untuk membedakan antar genotipe yang berbeda, mengidentifikasi hasil persilangan hibrida interspesies, mengidentifikasi galur restorer dan maintainer, studi genetik gen pemulih kesuburan, mempelajari interaksi antara inti dan sitoplasma, serta mengetahui hubungan antar tetua hibrida (Ikehashi & Araki 1984). Adapun tingkat fertilitas spikelet dipengaruhi oleh beberapa faktor fisiologis dan lingkungan, sehingga tidak digunakan untuk studi pewarisan gen pemulih kesuburan. Oleh karena itu, untuk mengetahui aksi dan jumlah gen yang mengendalikan pemulihan kesuburan digunakan nilai fertilitas serbuk sari pada populasi F2. Tabel 34 menunjukkan
hasil analisis Chi-Kuadrat dari masing-masing kombinasi hibrida.
Fertilitas serbuk sari pada populasi F2 turunan dari IR 58025A/PK 90 (GMJ
tipe WA) berkisar antara 0 – 93.3%. Data pengamatan menunjukkan Di antara 100 tanaman F2, 9 individu menunjukkan steril sempurna, sedangkan 91 individu
fertil lainnya merupakan gabungan kelas fertil sempurna, fertil sebagian, dan steril sebagian. Rasio pengamatan untuk individu fertil dengan steril adalah 91:9 yang tidak berbeda nyata secara signifikan dengan rasio harapan 15 fertil : 1 steril (χ2 = 1.29, P ≥ 0.05). Hal ini mengindikasikan adanya pola pewarisan digenik dengan aksi gen epistasis dominan ganda yang mengendalikan pemulihan kesuburan pada sistem CMS-WA. Aksi epistasis dominan ganda menjelaskan adanya dua gen yang saling mensubstitusi peran masing-masing dalam menghasilkan suatu protein atau enzim, apabila salah satu gen dominan akan menekan atau menutupi sifat gen yang lain (Sobir & Syukur 2015).
Analisis fertilitas serbuk sari pada populasi F2 turunan IR 80154A/PK 12
(GMJ tipe Gambiaca) menunjukkan segregasi pengamatan 96 fertil : 10 steril yang tidak berbeda nyata dengan nisbah harapan 15 : 1 (χ2 = 2.40, P ≥ 0.05) yang mengindikasikan adanya keterlibatan dua gen dominan yang berinteraksi secara epistasis dominan. Salah satu gen memiliki alel dominan sehingga menutupi (epistasis) kerja gen yang satunya. Pengaruh salah satu dari dua gen dalam memulihkan kesuburan lebih kuat dari gen yang lain. Hal ini memperkuat hipotesis satu gen dominan dapat mengendalikan karakter pemulihan kesuburan. Hasil di atas sesuai dengan penelitian sebelumnya yang melaporkan adanya aksi gen pemulih kesuburan yang bersifat epistasis dominan ganda pada pewarisan
pemulihan kesuburan GMJ tipe WA dan tipe Gambiaca (Kumari et al. 1997; Pradhan & Jachuck 1992; Sattari et al. 2008).
Pada turunan kombinasi hibrida IR 80156A/PK 90 dan IR 80156A/PK 12 yang merupakan turunan GMJ tipe Kalinga, fertilitas serbuk sarinya berbeda nyata dengan rasio 15:1 (Tabel 34). Hal ini berarti kedua populasi tersebut tidak mengikuti nisbah untuk aksi gen epistasis dominan ganda (Pradhan & Jachuck 1992).
Tabel 34 Analisis Chi-Kuadrat karakter fertilitas serbuk sari pada tanaman populasi F2 padi turunan GMJ tipe WA, Kalinga, dan Gambiaca
Hibrida
Fertilitas serbuk
sari
Jumlah tanaman:
Nilai χ2 Rasio genetik Observasi Harapan IR 58025A/PK 90 Fertil 91 94 1.29tn 15 : 1 Steril 9 6 IR 80154A/PK 90 Fertil 97 94 1.80tn 15 : 1 Steril 3 6 IR 80156A/PK 90 Fertil 85 94 13.07* - Steril 15 6 IR 58025A/PK 12 Fertil 90 94 2.40tn 15 : 1 Steril 10 6 IR 80154A/PK 12 Fertil 90 94 2,40tn 15 : 1 Steril 10 6 IR 80156A/PK 12 Fertil 88 94 5.64* - Steril 12 6 IR 58025A/BP 11 Fertil 86 75 3.41* 3 : 1 Steril 17 25 IR 80154A/BP 11 Fertil 82 75 2.61tn 3 : 1 Steril 18 25 IR 80156A/BP 11 Fertil 80 75 1.33tn 3 : 1 Steril 20 25
Keterangan: tn: tidak berbeda nyata pada α=0.05; *: berbeda nyata pada α=0.05.
Selanjutnya, populasi F2 yang melibatkan persilangan IR 80156A/BP 11
menunjukkan segregasi pengamatan 80 fertil : 20 steril yang tidak berbeda nyata dengan nisbah harapan 3 : 1 (χ2 = 1.33, P ≥ 0.05). Hal ini mengindikasikan adanya dugaan galur pemulih kesuburan untuk tipe GMJ Kalinga dikendalikan oleh gen tunggal yang bersifat dominan sempurna (monogenik). Begitu pula pada