ABSTRAK
Tiga spesies bakteri (Salipiger sp. PR55-4, Bacillus altitudinis, dan Ochrobactrum anthropi) yang diisolasi dari limbah minyak berat dapat mendegradasi senyawa PAH. Terhadap ke-3 spesies bakteri tersebut diuji kemampuan kinerja spesies bakteri baik dalam bentuk tunggal maupun dalam bentuk konsorsium (campuran). Kemampuan dari spesies tunggal dan campuran dalam mendegradasi senyawa hidrokarbon dipantau melalui parameter %TPH pada fasa padat dan pada fasa cair, populasi bakteri, pH, dan COD selama proses biodegradasi. Analisa TPH dilakukan dengan metoda gravimetri, populasi bakteri (TPC) dengan metode cawan tuang, pH dengan kertas pH, serta COD dengan metode refluk. Dari hasil penelitian diketahui spesies tunggal Salipiger sp. PR55-4, Bacillus altitudinis, dan Ochrobactrum anthropi memiliki % degradasi sebesar 51.65% ; 54.26% ; dan 46.76%. Spesies campuran Salipiger sp. PR55-4 dan Bacillus altitudinis memiliki persen degradasi sebesar 60.13%, untuk campuran bakteri Salipiger sp. PR55-4 dan Ochrobactrum anthropi memiliki persen degradasi sebesar 57.00%, dan untuk campuran bakteri Bacillus altitudinis dan Ochrobactrum anthropi memiliki persen degradasi sebesar 62.47%. Spesies campuran bakteri Salipiger sp. PR55-4, Bacillus altitudinis, dan Ochrobactrum anthropi memiliki persen degradasi sebesar 81.52%. Dibandingkan dengan spesies tunggal dan spesies campuran 2 jenis bakteri, spesies campuran dengan 3 jenis bakteri memiliki % degradasi terbesar sehingga kombinasi terbaik untuk mendegradasi limbah minyak berat adalah campuran bakteri Salipiger sp. PR55-4, Bacillus altitudinis, dan Ochrobactrum anthropi.
139
PENDAHULUAN
Kemampuan bakteri dalam mendegradasi senyawa hidrokarbon berbeda-beda sesuai dengan aktifitas enzim yang dihasilkan dan kondisi lingkungan yang mendukung seperti temperatur, pH, nutrisi dan oksigen. Beberapa penelitian menunjukkan kemampuan spesies bakteri dalam mendegradasi senyawa hidrokarbon. Anggraeni (2003) melaporkan tiga jenis spesies tunggal, yaitu Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas aeruginosa dan Enterobacter agglomerans memiliki kemampuan mendegradasi minyak diesel. Menurut Lee et al. (2002), Enterobacter agglomerans yang merupakan spesies pendegradasi toluena, benzena, dan etilbenzena memiliki kemampuan untuk mendegradasi campuran benzena, etilbenzena dan xilena (BTX). Menurut Citroreksoko (1996), kemampuan biodegradasi mikroba terhadap beberapa senyawa berbeda-beda. Beberapa kecenderungan yang terjadi pada degradasi hidrokarbon, yaitu hidrokarbon alifatik pada umumnya mudah didegradasi dibandingkan dengan senyawa aromatik, hidrokarbon alifatik rantai lurus pada umumnya lebih mudah terdegradasi daripada hidrokarbon rantai bercabang, hidrokarbon jenuh lebih mudah terdegradasi daripada hidrokarbon tak jenuh dan hidrokarbon rantai panjang lebih mudah terdegradasi daripada rantai pendek. Hidrokarbon dengan panjang rantai kurang dari sembilan karbon sukar didegradasi karena senyawa ini bersifat toksik bagi mikroba.
Limbah minyak berat yang digunakan adalah limbah minyak bumi yang berasal dari industri perminyakan yang berada di Duri dengan komposisi hidrokarbon sebagai berikut: paraffin dan naftenik 37%, aromatik 12% dan aspaltena 10%. Senyawa hidrokarbon aromatik dan aspaltena lebih sulit didegradasi oleh bakteri dibandingkan dengan senyawa hidrokarbon paraffin dan naftenik.
Pengujian kemampuan degradasi spesies tunggal terhadap limbah minyak berat perlu dilakukan. Akan tetapi, kombinasi spesies bakteri lebih mampu mendegradasi suatu hidrokarbon dari minyak bumi dibandingkan spesies tunggal. Secara umum dipercaya bahwa konsorsium akan memiliki kemampuan degradasi
yang lebih baik karena gabungan mikroba memiliki profil enzimatik yang lebih luas untuk degradasi. Konsorsium mikroba asli (indigen) yang diperoleh memiliki kemampuan degradasi paling baik diantara semua kombinasi, campuran dua atau tiga spesies memiliki kemampuan degradasi lebih baik dibanding spesies tunggal (Kanaly et al. 2002). Oleh karena itu, kombinasi beberapa spesies tunggal perlu diuji untuk mendapatkan kombinasi terbaik dalam mendegradasi hidrokarbon dari limbah minyak berat yang terdapat pada lahan tambang minyak bumi.
METODOLOGI PENELITIAN
Bahan dan AlatBahan-bahan yang akan digunakan adalah spesies yang telah diisolasi dari tanah tercemar yang telah diberi kotoran sapi dan kuda, limbah minyak berat (LMB) diperoleh dari indu stri minyak di Riau, solar, air laut, marine broth (Lampiran 5.1), linier alkilbenzena sulfonat (LAS), heksana, spirtus, Na2SO4 anhidrat, silika gel, NaCl, larutan baku ferroammonium sulfat (FAS), indikator feroin, H2SO4 pekat, Ag2SO4, K2Cr2O7, indikator universal, akuades, alumunium foil, dan kertas saring. Alat-alat yang digunakan adalah Erlenmeyer, desikator, neraca analitik, penggiling, sarung tangan, masker, gelas ukur, labu bulat, refluks, sumbat kapas, buret, pipet volumetrik, pipet mohr, pipet mikro,tip, pemanas, radas uap putar, shaker inkubator, autoklaf, cawan petri, labu takar, inkubator, tabung COD, dan kondensor tegak.
Peremajaan Spesies Bakteri (Hadioetomo 1998)
Bakteri yang digunakan sebanyak 3 spesies yang telah diisolasi dari tanah tercemar dan diketahui memiliki kemampuan dalam mendegradasi senyawa hidrokarbon tertentu. Peremajaan masing-masing spesies dilakukan pada media miring marine agar (Lampiran 4.1). Sebanyak 100 ml marine agar disiapkan di dalam erlenmeyer kemudian sebanyak 5 ml marine agar dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung biakan atau tabung reaksi. Tabung tersebut disumbat kapas dan disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit. Setelah disterilisasi, tabung diletakkan pada papan miring dan dibiarkan menjadi dingin
141
dan padat. Secara aseptis masing-masing bakteri diinokulasikan pada agar miring tersebut dan inkubasi pada suhu 30 °C selama 24 jam. Bakteri tersebut masing-masing ditumbuhkan dalam agar miring sebagai stok.
Preparasi Inokulum pada Media Kaya dan Media Minimal
Sebelum diaplikasikan pada limbah minyak berat, masing-masing spesies ditumbuhkan terlebih dahulu pada media kaya dan media minimal. Media kaya dibuat dalam erlenmeyer 250 ml dan diberi sumbat kapas dengan komposisi pada Tabel 5.1 dan disterilisasi pada suhu 121 °C selama 15 menit, kemudian secara aseptis bakteri diinokulasikan dengan ose pada media kaya tersebut dan diinkubasi goyang pada suhu kamar dengan kecepatan pengadukan 200 rpm selama 3 hari.
Tabel 5.1 Komposisi media kaya dan media minimal
Bahan Komposisi (dalam 100 ml air laut) Media kaya (g) Media minimal (g)
Yeast ekstrak 1,5 0,5
Pepton 0,3 0,1
Setelah ditumbuhkan selama 3 hari pada media kaya, kemudian bakteri sebanyak 1 mL dipindahkan ke dalam media minimal yang telah disterilisasi. Sebanyak 5 ml solar yang telah disterilisasi dengan sinar UV selama 15 menit ditambahkan pada media minimal. Media minimal lalu diinkubasi goyang dengan kecepatan 200 rpm pada suhu kamar selama 7 hari. Penumbuhan bakteri pada media minimal dilakukan sebanyak 3 kali. Setelah ditumbuhkan pada media minimal, bakteri siap digunakan untuk diaplikasikan pada tanah tercemar.
Pengujian Spesies Bakteri
Pengujian spesies tunggal dilakukan untuk mengetahui kemampuan spesies untuk tumbuh pada beberapa substrat minyak bumi seperti minyak goreng, pertamak, limbah minyak berat (LMB), oli, minyak tanah, solar, dan ekstrak limbah minyak berat. Pengujian dilakukan pada cawan petri yang telah ditumbuhkan spesies tunggal dengan media marine agar. Ke dalam cawan petri
tersebut ditempatkan bulatan kertas saring yang telah dicelupkan. pada beberapa substrat minyak bumi seperti minyak goreng, pertamak, limbah minyak berat (LMB), oli, minyak tanah, solar, dan ekstrak limbah minyak berat. Kemudian diamati munculnya zona bening disekitar substrat minyak bumi tersebut. Aplikasi pada Tanah Tercemar dengan Penggunaan Spesies Tunggal
Limbah tanah tercemar yang digunakan yaitu limbah minyak berat (LMB). LMB yang telah digiling kemudian ditimbang sebanyak 25 gram dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml yang diberi sumbat kapas. LMB tersebut kemudian disterilisasi pada suhu 121 °C selama 15 menit. Media minimal baru tanpa solar yang telah disterilisasi, secara aseptis dimasukkan dan spesies tunggal bakteri hasil pemindahan pada media minimal sebanyak 3 kali diinokulasikan sebanyak 200 μl pada LMB tersebut. Campuran tersebut kemudian diinkubasi goyang dengan kecepatan 200 rpm pada suhu kamar selama 21 hari. Setiap hari ke-0, 3, 7, 14, dan 21, aplikasi tersebut secara rutin dianalisis TPH fasa padat , TPH fasa cair, TPC, COD, dan pH.
Aplikasi pada Tanah Tercemar dengan Penggunaan Kombinasi Spesies Bakteri
Sebanyak 3 spesies bakteri (Salipiger sp PR55-4, Bacillus altitudinis, dan Ochrobactrum anthropi) dengan kinerja degradasi hidrokarbon terbaik kemudian dikombinasikan untuk mengetahui kemampuannya dalam berinteraksi dengan kombinasinya yaitu Salipiger sp. PR55-4 + Bacillus altitudinis, Salipiger sp. PR55-4 + Ochrobactrum anthropi, Bacillus altitudinis + Ochrobactrum anthropi dan Salipiger sp PR55-4, Bacillus altitudinis, dan Ochrobactrum anthropi. Tiga spesies tersebut merupakan 3 spesies dengan daya degradasi terbaik dari 11 spesies yang telah di uji kemampuannya. Langkah pembuatan slurry sama seperti aplikasi spesies tunggal. Setiap hari ke-0, 3, 7, 14, dan 21, aplikasi tersebut secara rutin dianalisis TPH fasa cair dan padat, TPC, COD, dan pH.
Pengukuran pH
143
Pengukuran TPH Fasa Cair (EPA 1999)
Sebanyak 50 ml sampel yang telah dicampur dengan limbah minyak disaring kemudian diekstrak dengan corong pisah menggunakan 25 ml heksana sebanyak dua kali. Kandungan air pada ekstrak dihilangkan dengan menambahkan Na2SO4
% TPH (g/ml) =
anhidrat, kemudian disaring. Pelarut diuapkan setelah itu dipanaskan dalam oven selama 45 menit pada suhu 70°C. Sampel hasil pengeringan dilarutkan kembali dengan heksana dan ditambahkan silika gel untuk menghilangkan senyawa-senyawa polar dan disaring. Pelarut diuapkan kembali dan dipanaskan dalam oven. Bobot yang terukur merupakan residu minyak (nilai TPH). Nilai TPH dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Bobot Minyak
x 100% Volume sampel
Pengukuran TPH Fasa Padat (EPA 1998)
Nilai TPH diukur menggunakan metode gravimetri dan dilakukan setiap minggu selama ± 2 bulan. Sebanyak 5 gram sampel ditimbang kemudian dibungkus dengan kertas saring dan dibuat timbel. Timbel yang telah dibuat tersebut dimasukan dalam Soxhletdan diekstrak dengan pelarut n-heksana 125 ml selama ± 4 jam. Ekstrak yang diperoleh dihilangkan airnya dengan Na2SO4
Kadar TPH (%) =
anhidrat dan disaring, kemudian dihilangkan hidrokarbon berantai panjang dan bergugus fungsi (grease) dengan silika gel 60 dan disaring. Ekstrak yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam labu bundar dan dipekatkan dengan penguap putar (rotary evaporator) hingga pekat atau sudah terpisah dengan pelarutnya. Kemudian labu bundar yang berisi sampel uang sudah terekstrak dipanaskan dalam oven pada suhu 70 ºC selama 10 menit kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Kadar TPH dihitung sebagai:
m x 100 % 1 m2 dengan m1 m = Bobot ekstrak (g) 2 = Bobot sampel awal (g)
Pengukuran Populasi Bakteri (Hadioetomo 1998)
Larutan fisiologis NaCl 0,85% dipipet ke dalam tabung ulir (dengan label 10-1 sampai 10-8) sebanyak 9 ml. Selanjutnya tabung ulir berisi larutan fisiologis disterilisasi beserta cawan petri, marine agar yang telah disiapkan dan tip untuk mikropipet pada suhu 121°C selama 15 menit. Setelah sterilisasi, tabung ulir didinginkan. Sebanyak 1 gram sampel dimasukkan kedalam tabung ulir dengan label 10-1, lalu tabung ulir tersebut dikocok hingga homogen. Sebanyak 1 ml dari tabung ulir berlabel 10-1 dimasukkan ke dalam tabung ulir yang berlabel 10-2. Tabung ulir berlabel 10-2 tersebut dikocok lalu 1 ml dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung ulir yang berlabel 10-3. Pemipetan dan pengocokan ini dilakukan pada setiap tabung ulir sampai pengenceran/tabung ulir berlabel 10-8. Dari semua tabung ulir (10-1 – 10-8), masing-masing dipipet sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri steril terpisah yang telah dilabeli 10-1 – 10-8
Pengukuran Kadar COD (Clesceri et al. 2005)
, kemudian larutan marine agar (MA) dituang. Setelah agar padat cawan diinkubasi terbalik pada suhu 30°C selama 24-48 jam. Jumlah koloni yang tumbuh pada cawan petri tersebut dihitung. Jumlah koloni yang dapat diterima antara 30-300.
Sampel diambil sebanyak 10 ml dan dimasukkan ke dalam tabung COD, kemudian ditambahkan larutan campuran kalium dikromat-merkuri sulfat ke dalam sampel. 10 ml larutan campuran asam sulfat-perak sulfat dan campuran diaduk dimasukkan kedalam tabung COD kemudian ditutup. Tahap di atas diulangi pada air suling sebagai blanko. Setelah masing-masing unit pengamat pada tutup dipasang, tabung dimasukkan ke dalam oven pada suhu 150 °C. Setelah 2 jam, tabung COD dikeluarkan dari oven dan dibiarkan dingin. Campuran dari tabung COD dipindahkan ke dalam erlenmeyer 100 ml dan dibilas dengan air suling. Sebanyak 2 ml asam sulfat pekat dan 3 tetes larutan indikator feroin ditambahkan secara berturut-turut ke dalam campuran. Campuran dititrasi dengan larutan baku fero amonium sulfat 0,05 N yang telah distandardisasi sampai terjadi perubahan warna dari hijau menjadi merah coklat lalu dicatat volume pemakaian larutan baku fero amonium sulfat.
145
COD = (Vb-Vs) x N x 8000 Vs
x fp
Keterangan: Vb = volume blanko Vs = volume sampel
N = kosentrasi Ferroammonium sulfat Fp = faktor pengenceran