Tempat dan waktu penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kesehatan Satwa Akuatik FKH IPB dan Stasiun Karantina Ikan Tanjung Priok bulan Januari sampai Februari 2007 dan Bagian Patologi FKH IPB bulan Maret sampai April 2007.
Bahan dan alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi : Ikan Kerapu Macan;
S. iniae (Isolat Sentani koleksi FKH UGM); Media untuk isolasi dan identifikasi mikroba (BHI Agar, Agar darah, bahan uji biokimia meliputi : NaCl untuk parameter toleransi tumbuh pada kadar garam; media O/F untuk uji oksidatif dan Uji fermentasi ; media katalase ; Aesculin untuk menguji kemampuan menghidrolisis Aesculin; media uji Voges Proskauer untuk menguji kemampuan bakteri menghasilkan asam dari fermentasi glukosa; Bahan pembuatan / pemeriksaan histopatologi, pakan ikan berupa udang / ikan beku dan air laut. Peralatan yang digunakan meliputi : Akuarium beserta peralatannya, cawan petri,
tabung erlenmayer, alat pembuatan preparat histopatologi (Autotechnic Tissue Processor, Parafin Embedding Console, Mikrotom, Inkubator), mikroskop, alat fotomikrografi serta alat dan bahan penguji kualitas air.
Metoda Penelitian
Metoda yang digunakan dalam penelitian ini adalah dengan menggunakan hewan coba (ikan) yang diberi perlakuan infeksi secara buatan. Penelitian dilakukan dalam 3 tahap, meliputi persiapan, penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan dimaksudkan untuk mengembalikan virulensi isolat bakteri yang akan digunakan dan mendapatkan data awal yang mendasari penelitian utama. Sedangkan penelitian utama dimaksudkan untuk melihat gejala klinis, patologi anatomi dan histopatologis ikan yang diinfeksi S. iniae.
Persiapan Ikan Uji
Ikan yang digunakan adalah ikan Kerapu Macan sehat berukuran 10 - 11 cm yang berasal dari pembudidaya ikan Kerapu Macan di Kepulauan Seribu. Kriteria ikan sehat dicirikan dari pergerakan yang aktif, aktifitas makan yang aktif, warna tubuh cerah, organ tubuh eksternal (sirip, sisik, operkulum ) normal.
Ikan yang akan digunakan diaklimatisasi terlebih dahulu selama 3 (tiga) hari dalam akuarium berukuran 80 cm x 40 cm x 40 cm dengan kepadatan 50 ekor per akuarium. Selama aklimatisasi wadah penampungan diberi sistem resirkulasi air yang cukup. Untuk mempertahankan kualitas air serta kelangsungan hidup ikan maka dilakukan pergantian air 50% volume setiap harinya dengan mempertahankan salinitas tetap sesuai kebutuhan kelangsungan hidup ikan.
Air yang digunakan sebagai media pemeliharaan adalah air laut dengan salinitas 32 – 35 ppm yang diperoleh dari instalasi pengolahan dan penyediaan air Sea World Ancol - Jakarta. Air yang akan digunakan terlebih dahulu dilakukan filtrasi dan resirkulasi beraerasi, uji parameter kualitas air dan status mikrobiologi untuk memastikan bebas Streptococcus ataupun bakteri patogen lainnya.
Pakan yang diberikan disesuaikan dengan kebiasaan pakan yang diberikan pada ikan tersebut sebelumnya yaitu berupa udang kecil / rebon atau ikan sisa / rucah. Untuk memastikan bahwa pakan yang diberikan bebas dari streptococcus iniae ataupun mikroorganisme patogen lainnya dilakukan sterilisasi bebas mikroorganisme dengan melakukan irradiasi dengan kekuatan 10 KGray di Pusat Aplikasi Isotop dan Radiasi Badan Tenaga Atom Nasional (BATAN) Jakarta. Ikan uji yang akan digunakan dibebaskan dari patogen khususnya S. iniae dengan melakukan pemeriksaan terlebih dahulu secara acak terhadap kesehatan secara klinis maupun status mikrobiologinya.
Bakteri
Isolat bakteri diperoleh dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gajah Mada. Koleksi isolat S. iniae berasal dari Ikan Nila (Oreochromis niloticus) yang menunjukan gejala klinis terinfeksi
Streptococcus, hasil survey Tim FKH UGM dan Balai Karantina Ikan Sentani Jayapura di wilayah Papua tahun 2005.
Penentuan karakteristik bakteri dilakukan dengan : Uji Morfologi meliputi : Pewarnaan Gram, karakteristik bentuk dan ukuran koloni; karakteristik sel dengan mengamati bentuk dan jumlah sel pada setiap rantai secara acak pada preparat hasil pewarnaan Gram dan uji motilitas; Uji Biokimia meliputi : toleransi pertumbuhan pada temperatur inkubasi 10˚ C dan 45˚ C selama 24 jam dan 6,5 % NaCl, Aktifitas haemolisis dalam media darah (Agar darah dengan eritrosit domba 10 %); uji oksidasi dan fermentasi (O/F); uji katalase; kemampuan menghidrolisis Aesculin agar; uji Voges Proskauer.
Sebelum digunakan bakteri terlebih dahulu dikenakan uji profisiensi dan identifikasi ulang di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (IPB) dan Laboratorium Stasiun Karantina Ikan Kelas I Tanjung Priok.
Isolat bakteri stok dalam slant agar kemudian dikultur dalam media agar darah, secara bertahap dan periodik dilakukan rekultur sampai diperkirakan cukup sehat agar dapat digunakan dalam penelitian. Propagasi bakteri yang akan digunakan dilakukan dalam Brain Heart Infusion Broth (BHI broth) dan diinkubasikan selama 18 jam, kemudian disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan 2000 rpm. Larutan supernatan dibuang dan pelet disuspensikan kembali dengan menambahkan PBS 0,84 %. Pembuatan dan pengukuran suspensi bakteri digunakan satuan sel/ml dilakukan dengan membandingkan tingkat kekeruhan suspensi bakteri sesuai standar Mc Farlan I (Faddin & Bergey 1980). Uji Pendahuluan
a. Uji pengembalian virulensi
Untuk mengembalikan virulensi bakteri uji, S. iniae yang akan digunakan diinjeksikan pada 10 ekor ikan Nila (Oreochromis niloticus) masing-masing sebanyak 0,1 ml secara intraperitoneal. Uji virulensi dilakukan selama 4 (empat) hari (Bromage et al. 1999; Russo et al. 2006) , selama masa uji dilakukan pengamatan gejala klinis dan patologis apabila ditemukan ikan yang
memperlihatkan gejala klinis terinfeksi streptococcosis dilakukan isolasi dari organ mata, otak, hati, limpa dan ginjal (Bromage et al. 1999).
Isolat yang diperoleh selanjutnya diinokulasikan pada agar BHI dan diidentifikasi dengan uji biokimia. Apabila isolat dinyatakan positif S. iniae
selanjutnya dipersiapkan dan diperbanyak pada media cair untuk tahap penelitian selanjutnya.
b. Uji LD 50
Untuk mengetahui dosis maksimum yang dapat menyebabkan kematian 50 % populasi ikan uji dilakukan pengujian LD50. Pengujian ini dilakukan dengan 4
perlakuan dosis suspensi bakteri dan 1 kontrol diinjeksi PBS, masing-masing 2 kali ulangan. Setiap perlakuan terdiri dari 10 ekor ikan. Perlakuan dibedakan atas kepadatan bakteri S. iniae (sel/ml) yang diinjeksikan pada ikan sebanyak 0,1 ml setiap ekor pada intra peritoneal.
Perlakuan A : Kontrol, digunakan suspensi PBS Steril Perlakuan B : S.iniae 10 6 sel/ml
Perlakuan C : S.iniae 10 8 sel/ml Perlakuan D : S.iniae 10 10 sel/ml Perlakuan E : S.iniae 10 12 sel/ml
Penentuan LD50 menggunakan metoda Dregsted Behrens (Hubert, 1980).
50 - % m = X1 + d ---
% x + 1 - % x1 m = Log LD50
X1 = Log dosis bakteri di bawah LD50
D = Selisih Log dosis dibawah LD 50 dan diatas LD50
% x + 1 = Persentase kematian kumulatif pada dosis di atas LD50
% x1 = Persentase kematian kumulatif pada dosis di bawah LD50
Uji Utama
Pada uji ini ikan dibagi ke dalam 2 kelompok perlakuan dan 1 kelompok kontrol, masing-masing 2 ulangan terdiri dari 7 ekor ikan . Perlakuan dosis infeksi didasarkan atas hasil uji LD50 sebagai dosis utama dan dosis pembanding
untuk mengetahui kemungkinan adanya gejala sub klinis. Wadah penampungan ikan uji digunakan akuarium berukuran 40 cm x 20 cm x 25 cm masing-masing berisi 7 ekor ikan per akuarium. Volume air dalam akuarium adalah 5 liter. Ikan disuntik secara intra peritoneal (ip).
Uji dilakukan selama 7 hari, setiap hari dilakukan pergantian air dengan menyipon sebanyak 50 % volume air dan dilakukan penggantian sebanyak volume air terbuang dengan stok air baru. Pengamatan yang dilakukan meliputi : a) Pengamatan gejala klinis sebelum diinfeksi.
b) Pengamatan gejala klinis, perubahan makroskopis (Patologi Anatomi - PA) dan perubahan mikroskopis (histopatologi – HP) setelah diinfeksi S. Iniae, yang dilakukan setiap hari dengan cara mengambil sejumlah 1 (satu) ekor ikan dari setiap kelompok .
Pengamatan klinis yaitu pemantauan perilaku meliputi gerak, aktifitas / nafsu makan, morfologi / kondisi fisik ( insang, sisik). Pengamatan nafsu makan dilakukan dengan melihat respon dan aktifitas makan terhadap pakan yang diberikan dibandingkan dengan respon dan aktifitas makan ikan kontrol. Dinyatakan memiliki respon normal jika ikan memberikan respon spontan dan melakukan aktifitas makan saat diberi pakan.
Pengamatan patologi anatomi (PA) meliputi : perubahan makroskopis organ tubuh ikan. Perubahan histopatologi organ internal meliputi : insang, mata, otak, hati, limpa, jantung dan ginjal.
Pengambilan ikan untuk pengamatan dilakukan secara acak dan diutamakan yang akan mati (sekarat) atau memperlihatkan gejala klinis sakit. Sesudah dinekropsi ikan dimasukkan dalam larutan Buffer Neutral Formalin (BNF) 10 %.
Setelah difiksasi dibuat preparat HP dan diwarnai dengan Hematoksilin Eosin dan Gram.
c) Pengamatan kualitas air meliputi parameter : Suhu, pH, Salinitas, Oksigen terlarut dan uji mikrobiologi.
Analisa data
Data diperoleh dengan membandingkan secara deskriptif morfologi kelainan organ tubuh ikan kelompok kontrol dan kelompok perlakuan infeksi pada pengamatan makroskopik (PA) dan mikroskopik (HP). Data ditampilkan dalam bentuk tabel dan gambar.