BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di kandang pemeliharaan dan Laboratorium Struktur Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam mulai Desember 2011 sampai dengan Juli 2012
3.2 Materi Penelitian 3.2.1 Hewan Coba
Penelitian ini bersifat eksperimental dengan menggunakan hewan sebagai bahan uji. Hewan uji adalah jenis Mus musculus L. jantan strain DDW usia 8-12 minggu dengan berat badan rata-rata 25 gram sebanyak 24 ekor dan dibagi ke dalam 3 perlakuan. Delapan ekor pertama untuk P0 (kontrol), 8 ekor kedua untuk perlakuan pemaparan asap rokok elektrik rasa strawberry (P1), dan 8 ekor ketiga untuk pemaparan asap rokok elektrik rasa gudang garam (P2). Hewan coba dipelihara di kandang Laboratorium Struktur Hewan Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan alam, Universitas Sumatera Utara. Perlakuan terhadap hewan coba berpedoman pada prinsip-prinsip penelitian kesehatan yang menggunakan hewan secara etis, prosedur dan standar yang dibuktikan dengan Ethical Clearance dari Komite Etik Penelitian Hewan, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.
3.2.2 Rokok
Rokok yang digunakan dalam penelitian ini adalah jenis rokok elektrik/elektronik e-health cigarette dengan kandungan rasa strawberry dan gudang garam serta dilengkapi dengan 10 buah cartridge, 1 charger USB, 1 charger mobil, 1 charger rumah.
3.2.3 Alat dan Bahan Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kotak smoking ukuran 30x20x15 cm3, selang yg dihubungkan dengan three way untuk aliran asap, spuit ukuran 60 ml untuk memompa asap rokok, mikroskop video mikrometer, mikrotom, staining jar, kandang hewan coba dan perlengkapannya, dissecting set, penutup dan objek preparat.
Bahan penelitian yang digunakan yaitu Mus musculus L. jantan usia 8-12 minggu sebanyak 24 ekor, alkohol absolut, alkohol 96%, 80%, 70%, 50%, 40%, 30%, akuades, xylol, Hematoxilin, Eosin, canada balsam, larutan Bouin, rokok elektrik dengan label e-cegarette health dengan kandungan rasa gudang garam dan strawberry, parafin, NaCl 0,9%, dan kertas millimeter.
3.2.4 Metode Kerja
a. Persiapan Pakan dan Adaptasi Mencit dalam Kandang
Sebelum percobaan dilakukan, semua mencit diadaptasi selama satu minggu. Mencit dibagi menjadi tiga kandang. Kandang 1 untuk kontrol (P0), kandang 2 untuk pemaparan asap rokok rasa strawberry (P1), dan kandang 3 untuk pemaparan asap rokok gudang garam (P2). Pakan yang diberikan adalah campuran jagung halus dan pelet dengan perbandingan 1:3 dan diberikan secara ad libitum selama percobaan. Tempat minum menggunakan botol minuman suplemen (yang tutup botolnya dilubangi). Tempat minum diletakkan di bagian atas kandang dalam posisi terbalik (terdapat pengait dari kawat untuk menahan botol agar tidak jatuh). Minum diberikan secara ad libitum.
b. Pajanan Asap Rokok Elektronik pada Mencit
Pajanan asap rokok elektrik pada mencit dilakukan setiap hari selama 2 minggu berturut-turut. Satu batang rokok elektrik sejak awal harus dicharge hingga penuh agar pada saat pemaparan pada hewan uji dapat terjadi secara maksimal. Pemberian asap rokok elektrik dilakukan dengan dosis 20 kali hisapan hingga mencit yang berada di dalam smoking box menjadi lemas dan tidak aktif bergerak.
Tahapan pemajanan asap rokok dilakukan dengan terlebih dahulu mempersiapkan peralatan yang digunakan dalam pemajanan ini. Smoking box memiliki dua lubang penghubung di bagian depan, yang dihubungkan dengan selang dan three way. Lubang three way yang pertama untuk menghubungkan selang ke batang rokok, lubang three way kedua untuk menghubungkan selang ke spuit untuk memompa sehingga asap masuk ke dalam tabung spuit, dan lubang three way yang ketiga untuk menghubungkan dan mengalirkan asap ke smoking box. Pada saat pemaparan asap, smoking box ditutup rapat dengan plastik putih transparan.
Kedelapan mencit dimasukkan bersamaan dalam smoking box, kemudian ditutup kembali. Satu batang rokok elektrik dipasang pada ujung selang sebelah kiri, kemudian three way diputar sehingga yang terbuka hanya jalur selang pada rokok dan selang pada spuit, rokok lalu dipompa hingga asap yang keluar masuk ke dalam tabung spuit, kemudian three way diputar kembali sehingga yang terbuka hanya jalur selang pada spuit dan jalur selang untuk masuknya asap ke smoking box. Lalu asap pada tabung spuit dikeluarkan, sehingga asap rokok masuk ke dalam smoking box. Penghisapan dilakukan sampai mencit di dalam smoking box menjadi lemas.
P0 P1 P2 Minggu ke: 0 1 2
Gambar 3.2 Skema Pemaparan Asap Rokok Elektrik Selama 2 Minggu
c. Penimbangan Bobot Badan
Berat badan mencit ditimbang pada awal mulai penelitian dan kemudian ditimbang kembali pada akhir penelitian.
d. Pengambilan Organ
Mencit dibunuh secara dislokasi leher, kemudian dibedah bagian bawah abdomen hingga ke bagian toraks. Lalu diambil organ pulmo secara hati-hati dan dimasukkan ke dalam larutan garam fisiologis guna untuk membersihkan organ. Setelah itu, organ ditimbang beratnya lalu diletakkan di atas kertas millimeter untuk difoto.
e. Pembuatan Preparat Histologis
Organ paru-paru dipotong menjadi beberapa bagian untuk difiksir. Jaringan kemudian difiksasi dengan menggunakan larutan Bouin selama 1 atau 2 malam. Selanjutnya dilakukan proses pencucian (clearing), fiksatif dibuang dan dicuci dengan alkohol 70 % berulang kali hingga warna jaringan menjadi pucat atau warna Bouin pada jaringan memudar. Jaringan kemudian diinapkan lebih kurang selama 6 jam atau 1 malam dengan menggunakan alkohol 70%. Selanjutnya, dilanjutkan dengan proses dehidrasi, yaitu dilakukan dalam alkohol bertingkat dimulai dengan alkohol 30%, alkohol 40%,
Pemaparan asap rokok elektrik
strawberry
Pemaparan asap rokok elektrik gudang garam
alkohol 50%, alkohol 60 %, alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90 %, dan alkohol absolut masing-masing selama 1 jam.
Setelah dehidrasi, segera dilakukan proses penjernihan (clearing), dalam xylol murni ± 24 jam. Proses selanjutnya yaitu infiltrasi dilakukan di dalam oven dengan suhu 56o Celcius. Sampel dimasukkan secara berturut-turut ke dalam campuran xylol- parafin I dengan perbandingan 3 : 1 ± 60’, xylol-parafin II dengan perbandingan 1:1 selama 60’, dan ke dalam xylol-parafin III dengan perbandingan 1:3 selama 60’, lalu dimasukkan ke dalam parafin murni selama 60’.
Langkah selanjutnya adalah penanaman (embedding). Jaringan ditanam ke dalam blok parafin yang kemudian disimpan dalam refrigerator (4-6o C). Blok ditempel pada holder sampai melekat erat, kemudian dipasang pada mikrotom untuk proses pemotongan (sectioning). Pengirisan dilakukan dengan ketebalan 6µ. Kemudian pita parafin di potong menjadi 3 atau lebih potongan organ lalu dicelupkan di atas permukaan air biasa (tidak panas) lalu ke air hangat agar pita parafin tidak mengkerut dan ditempelkan potongan organ ke objek preparat.
Selanjutnya proses deparafinasi. Preparat dicelupkan ke dalam xylol sampai bebas dari parafin. Lalu dilanjutkan dengan dealkoholisasi, dengan memasukkannya ke dalam alkohol bertingkat secara berturut-turut yaitu dari alkohol absolut, 90%, 80%, 70%, 50%, 40%, 30%, lalu ke akuades 1. Setelah itu menuju perwarnaan (staining) dengan memasukkan preparat ke dalam larutan pewarna Erlich hematoxylin selama 3-7” lalu ke akuades 2, kemudian dicelupkan ke alkohol absolut bertingkat yaitu dari alkohol 30%, 50%, 70%. Kemudian, dicelupkan ke dalam larutan pewarna eosin 0,5 %, Kemudian dicelupkan atau dimasukkan ke dalam alkohol 70%, 80%, 90% dan alkohol absolut (100%). Selanjutnya preparat dimasukkan ke xylol selama lebih kurang 7”. Lalu dikeringkan dengan menggunakan kertas penghisap.
Proses selanjutnya yaitu penempelan (mounting). Preparat ditutup dengan meneteskan canada balsam, kemudian ditutup dengan cover glass. Sediaan yang telah selesai diwarnai diberi label lalu diamati di bawah mikroskop (Suntoro, 1983).
f. Parameter Pengamatan
Pada penelitian ini, parameter yang diamati yaitu struktur mikroanatomi jaringan paru-paru mencit yang dianalisis secara deskriptif kualitatif dan dibuat skor derajat kerusakan seperti tercantum dalam Tabel 1 (Marianti, 2009), parameter berikutnya adalah berat badan dan berat pulmo mencit.
Tabel 3.1 Skor Derajat Kerusakan Jaringan Paru-paru Mencit Akibat Paparan Asap Rokok antara Kelompok Kontrol, Perlakuan Rasa Gudang Garam, dan Rasa Strawberry
Gambaran histologis Skor 1 2 3 Membran alveolus Lumen alveolus Hubungan antar alveolus
membran alveolus utuh, berinti dan lengkap dengan sel-sel endotelium >75% membulat ukuran proporsional >75% rapat >75%
membran alveolus utuh, berinti dan lengkap dengan sel-sel endotelium 25-75% membulat ukuran proporsional 25-75% rapat 25-75% membran alveolus utuh, berinti dan lengkap dengan sel- sel endothelium <25% membulat ukuran proporsional <25% rapat <25% g. Analisis Statistik
Data yang didapat dari setiap parameter (variabel) pengamatan dicatat dan disusun ke dalam bentuk tabel. Data kuantitatif (variabel dependen) yang didapatkan, diuji kemaknaannya terhadap pengaruh kelompok perlakuan (variabel independen) dengan bantuan program statistik komputer yakni program SPSS release 17. Urutan uji untuk berat pulmo dan berat badan diawali dengan uji normalitas dan uji homogenitas. Apabila hasil uji sudah normal dan homogen (p>0,05) maka dilanjutkan ke uji One-way ANOVA. Jika nilai p<0,05, maka dilanjutkan ke uji Post Hoc- Bonferroni taraf 5%. Untuk data non parametrik dilakukan uji Kruskal-Wallis.
