3. METODOLOGI
3.3 Metode Kerja
Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap, yaitu analisis proksimat kerang darah, ekstraksi senyawa aktif dari kerang darah, uji aktivitas antibakteri dari ekstrak yang dihasilkan, mengamati zona hambat yang dihasilkan pada penyimpanan suhu 10oC dan 30oC selama tujuh hari dan analisis fitokimia.
Analisis proksimat kerang darah meliputi uji kadar air, kadar abu, kadar lemak, kadar protein dan kadar karbohidrat. Ekstraksi senyawa bioaktif dari kerang darah dilakukan secara bertingkat dengan tiga pelarut yang berbeda tingkat kepolarannya, yaitu heksana (non polar), etil asetat (semi polar) dan metanol (polar). Ekstrak yang telah diperoleh kemudian diuji aktivitasnya sebagai senyawa antibakteri terhadap bakteri E. coli dan S. aureus. Ekstrak dengan kemampuan penghambatan paling baik kemudian diamati zona hambatnya selama tujuh hari pada suhu 10oC dan 30oC dan dianalisis fitokimia untuk mengetahui komponen-komponen yang terdapat dalam ekstrak.
3.3.1. Analisis proksimat
a. Analisis kadar air (AOAC 1995)
Cawan kosong yang digunakan dikeringkan dalam oven selama 15 menit atau sampai diperoleh berat tetap, kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang. Sampel kira-kira sebanyak 5 gram ditimbang dan diletakkan dalam cawan kemudian dipanaskan dalam oven selama 24 jam pada suhu 105oC. Cawan kemudian didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang kembali. Persentase kadar air dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: % 100 B B2 - B1 air Kadar % = ×
Keterangan : B = Berat sampel (gram)
B1 = Berat (sampel + cawan) sebelum dikeringkan B2 = Berat (sampel + cawan) setelah dikeringkan b. Analisis kadar abu (AOAC 1995)
Pengukuran kadar abu ditentukan dengan alat tanur. Cawan porselin dipanaskan dalam desikator dan ditimbang. Sebanyak 5 gram sampel dimasukkan dalam cawan porselin kemudian dibakar sampai tidak berasap lagi, lalu diabukan dalam tanur suhu 600oC sampai berwarna putih (semua sampel menjadi abu) dan berat konstan. Setelah itu didinginkan dalam
desikator dan ditimbang. Rumus perhitungan kadar abu adalah sebagai berikut: % 100 (g) sampel Berat (g) abu Berat abu Kadar % = ×
c. Analisis kadar protein (AOAC 1995)
Sampel ditimbang sebanyak 1-2 gram lalu dimasukkan ke dalam labu kjeldahl. Setelah itu ditambahkan 10 ml H2SO4 dan pelet kjeldahl kemudian sampel didihkan dalam ruang asam sampai larutan berwarna hijau kebiruan jernih. Larutan jernih ini lalu dipindahkan ke dalam labu ukur 100 ml. Labu kjeldahl dibilas dengan aquades (1-2 ml) kemudian air bilasan dimasukkan ke dalam labu ukur, selanjutnya diencerkan dengan aquades hingga 100 ml.
Sampel yang telah diencerkan dengan aquades dipipet sebanyak 10 ml dan dimasukkan dalam alat destilasi, kemudian ditambahkan sedikit demi sedikit NaOH 40% sebanyak 10 ml. Ujung tabung kondensor alat destilasi harus terendam dalam erlenmeyer yang berisi larutan asam borat (H3BO3) 4%. Dilakukan pemanasan alat destilasi hingga larutan asam borat yang semula berwarna merah muda menjadi berwarna hijau kebiruan. Selang kondensor kemudian dibilas dengan sejumlah aquades untuk menghindari kemungkinan adanya nitrogen yang menempel pada selang. Setelah itu erlenmeyer yang telah menangkap nitrogen dari sampel dititrasi dengan HCl 0,1 N hingga terjadi perubahan warna menjadi merah muda. Titrasi juga dilakukan terhadap larutan blanko. % 100 sampel Berat 14,007 HCl N blanko) HCl ml - sampel (ml N % = × × × 6,25 N % Protein % = ×
d. Analisis kadar lemak (AOAC 1995)
Metode yang digunakan dalam analisis lemak adalah metode ekstraksi soxhlet. Sampel sebanyak 5 gram dibungkus dengan kertas saring, setelah itu kertas saring yang berisi contoh tersebut dimasukkan dalam labu soxhlet. Alat
kondensor diletakkan di bagian atas dan labu lemak diletakkan di bagian bawah. Pelarut heksana dimasukkan ke dalam labu lemak secukupnya. Selanjutnya dilakukan refluks selama minimal 5 jam sampai pelarut yang turun kembali ke dalam labu lemak berwarna jernih.
Pelarut yang ada dalam labu lemak didestilasi, dan pelarut ditampung kembali. Labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi kemudian dipanaskan di dalam oven pada suhu 105oC hingga mencapai berat tetap dan setelah itu didinginkan dalam desikator. Selanjutnya labu beserta lemak didalamnya ditimbang dan berat lemak dapat diketahui.
% 100 (g) sampel Berat (g) lemak Berat lemak Kadar % = ×
e. Perhitungan kadar karbohidrat (AOAC 1995)
Perhitungan kadar karbohidrat dilakukan secara by different, yaitu dengan menggunakan rumus: K.abu - K.air - K.protein - K.lemak - 100% t karbohidra Kadar =
3.3.2. Ekstraksi senyawa bioaktif (Darusman et al. 1994)
Metode yang digunakan dalam ekstraksi senyawa aktif dari kerang darah adalah metode ekstraksi bertingkat menurut Darusman et al. (1994) dengan tiga pelarut yang berbeda tingkat kepolarannya, yaitu heksana (non polar), etil asetat (semi polar) dan metanol (polar). Tahapan proses ekstraksi kerang darah meliputi penghancuran sampel, maserasi, penyaringan dan evaporasi. Tahap pertama kerang dipisahkan dari cangkangnya, dicuci dan dicacah. Sampel yang telah dihancurkan kemudian ditimbang sebanyak 200 gram dan dimasukkan dalam erlenmeyer kemudian dimaserasi dalam 400 ml pelarut (perbandingan 1:2). Heksana dipilih sebagai pelarut pertama dikarenakan sifat heksana yang melarutkan lilin, lemak dan minyak dari suatu bahan (Harborne 1987), sehingga diharapkan dengan mengekstrak bahan dalam pelarut heksana terlebih dahulu akan menghilangkan lemak yang akan mempermudah pengeluaran senyawa aktif dari bahan dengan pelarut-pelarut selanjutnya, yaitu etil asetat dan metanol.
Sampel dimaserasi dengan heksana selama 24 jam pada suhu ruang. Setelah 24 jam, sampel disaring menggunakan nyilon mesh sebagai saringan kasar, selanjutnya penyaringan dengan corong kaca dan kertas saring whatman
untuk memisahkan filtrat dengan ampas I. Ampas I kemudian dimaserasi dengan pelarut etil asetat selama 24 jam, disaring sehingga diperoleh filtrat etil asetat dan ampas II. Ampas II selanjutnya dimaserasi dengan pelarut metanol selama 24 jam, disaring sehingga diperoleh filtrat metanol dan residu III.
Filtrat heksana, filtrat etil asetat dan filtrat metanol yang diperoleh selanjutnya dievaporasi dengan menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 40oC, sehingga diperoleh ekstrak kasar dari pelarut heksana, etil asetat dan metanol. Ekstrak yang diperoleh dimasukkan dalam botol steril untuk mencegah kontaminasi kemudian disimpan dalam freezer. Tahapan proses ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 9.
3.3.3. Uji aktivitas antibakteri dari ekstrak kasar kerang darah (Anadara granosa) (Noer dan Nurhayati 2006)
Uji aktivitas antibakteri dilakukan terhadap ekstrak kerang darah (A. granosa). Uji ini meliputi persiapan media padat TSA, persiapann media cair
NB, persiapan suspensi bakteri, persiapan media padat MHA, prosedur uji pendahuluan aktivitas antibakteri, prosedur uji aktivitas antibakteri dengan berbagai konsentrasi dan pengukuran zona hambat. Bakteri uji yang digunakan adalah E. coli dan S. aureus. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan paper disc.
a) Persiapan media padat TSA
Penyegaran bakteri uji, yaitu E. Coli dan S. aureus dilakukan pada media TSA (Trypticase Soy Agar). Media TSA dibuat dengan melarutkan sebanyak 8 gram media TSA bubuk dalam aquades hingga volume 200 ml, lalu dipanaskan sambil diaduk hingga mendidih. TSA dipipet sebanyak 9 ml dalam tabung reaksi dan masing-masing tabung ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Media lalu disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Setelah itu media dimiringkan sekitar 45 derajat dan dibiarkan hingga membeku. Setelah membeku media selanjutnya disimpan dalam refrigerator.
Gambar 9 Tahapan proses ekstraksi (Darusman et al. 1994). Keterangan: Produk
Proses
Pemisahan daging dari cangkang
Penimbangan Pencacahan Pencucian
Maserasi dengan heksana (24 jam) Penyaringan
Evaporasi
Evaporasi
Penyaringan
Evaporasi Maserasi dengan etil asetat (24 jam)
Maserasi dengan metanol (24 jam) Kerang darah (Anadara granosa)
Ekstrak kasar heksana
Ekstrak kasar etil asetat
Ekstrak kasarmetanol
Residu III Ampas II
Ampas I
Penyaringan Filtrat heksana
Filtrat etil asetat
b) Persiapan media cair NB
Media NB (Nutrient Broth) dibuat dari 2,6 gram media NB bubuk yang dilarutkan dalam aquades hingga volume 200 ml, selanjutnya dipanaskan sambil diaduk hingga mendidih. NB dipipet sebanyak 9 ml kedalam tabung reaksi dan masing-masing tabung ditutup menggunakan kapas dan alumunium foil. Sebelum digunakan, media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Setelah itu media didinginkan di tempat yang steril pada suhu ruang.
c) Persiapan suspensi bakteri
Sebanyak 1 ose bakteri uji digoreskan pada media TSA dengan pola zig zag secara aseptik, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Setelah itu 1-2 ose bakteri uji dari media TSA dimasukkan ke dalam media NB yang telah dingin secara aseptik. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam.
d) Persiapan media padat MHA
Media padat yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri adalah media Mueller Hinton Agar (MHA). MHA dibuat dengan melarutkan 7,6 gram media MHA bubuk dalam aquades hingga volume 200 ml, kemudian dipanaskan sambil diaduk hingga mendidih. Larutan dipipet 15 ml, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan masing-masing tabung ditutup dengan kapas dan alumunium foil. Sebelum digunakan, media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Media didinginkan pada suhu ruang sampai agar membeku. Setelah membeku, media disimpan dalam refrigerator.
e) Uji pendahuluan aktivitas antibakteri (modifikasi Noer dan Nurhayati 2006) Media MHA cair sebanyak 15 ml ditambah dengan 20 μl bakteri uji yang telah diukur OD-nya (Optical Density) antara 0,6-0,8 (Lalitha 2004) pada panjang gelombang 600 nm, masing-masing 0,788 (E. coli) dan 0,723 (S. aureus). Media yang telah ditambah dengan bakteri uji dihomogenkan dengan vorteks, kemudian segera dituangkan ke dalam cawan petri steril dan digoyangkan membentuk angka delapan agar lebih menyebar secara merata.
Media agar tersebut didiamkan pada suhu ruang selama 15 menit atau sampai agar membeku.
Ekstrak kerang darah yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri adalah ekstrak kerang darah dengan pelarut etil asetat dan ekstrak kerang darah dengan pelarut metanol karena ekstrak kerang darah dengan pelarut heksana yang diperoleh sangat sedikit. Dalam uji aktivitas antibakteri, setiap
paper disc diberi ekstrak sebanyak 20 μl dengan konsentrasi 2% (20 mg ekstrak yang dilarutkan dalam 1 ml metanol). Konsentrasi kloramfenikol yang digunakan sebagai antibakteri kontrol juga sama dengan konsentrasi ekstrak yang digunakan, yaitu 2%. Setelah seluruh pelarut ekstrak pada paper disc
menguap, masing-masing paper disc diletakkan dalam cawan petri yang telah berisi agar dan bakteri, kemudian cawan petri dilapisi dengan plastik wrapping
untuk menghindari kontaminasi dan disimpan dalam inkubator dengan posisi terbalik pada suhu 37oC selama 18-20 jam. Aktivitas antibakteri dapat dilihat dengan mengamati zona hambat yang terbentuk disekitar paper disc. Diagram alir uji pendahuluan aktivitas antibakteri dapat dilihat pada Gambar 10.
f) Prosedur uji aktivitas antibakteri pada berbagai konsentrasi ekstrak (modifikasi Darusman et al. 1994)
Media MHA sebanyak 15 ml dalam keadaan cair ditambahkan dengan 20 μl bakteri uji yang telah diukur OD-nya (Optical Density) antara 0,6-0,8 (Lalitha 2004) pada panjang gelombang 600 nm, masing-masing 0,797 (E. coli) dan 0,750 (S. aureus), kemudian divorteks agar homogen dan segera dituangkan ke dalam cawan petri steril dan digoyangkan membentuk angka delapan agar menyebar secara merata. Media tersebut didiamkan pada suhu ruang selama beberapa saat agar membeku.
Ekstrak kerang darah yang digunakan adalah ekstrak kerang darah dengan pelarut etil asetat dan ekstrak kerang darah dengan pelarut metanol, dengan konsentrasi masing-masing paper disc adalah 2%, 3,5%, 5% dan 6,5% (modifikasi Darusman et al. 1994) sebanyak 20 μl. Konsentrasi kloramfenikol yang digunakan sebagai antibakteri kontrol juga sama dengan konsentrasi ekstrak yang digunakan, yaitu 2%, 3,5%, 5% dan 6,5%. Paper disc dibiarkan sampai pelarutnya menguap, kemudian masing-masing paper disc diletakkan
dalam cawan petri berisi MHA dan bakteri yang telah membeku, kemudian cawan petri dilapisi dengan plastik wrapping untuk mencegah kontaminasi dan selanjutnya diinkubasi dengan posisi terbalik selama 18-20 jam pada suhu 37oC. Diagram alir uji aktivitas antibakteri pada berbagai konsentrasi ekstrak dapat dilihat pada Gambar 11. Setelah diinkubasi selama 18-20 jam, selanjutnya dilakukan pengamatan zona bening selama tujuh hari pada ekstrak dengan kemampuan penghambatan paling baik dengan penyimpanan pada suhu 10oC dan pada suhu 30oC untuk mengetahui kemampuan ekstrak dalam menghambat pertumbuhan bakteri (modifikasi Darusman et al. 1994).
Gambar 10 Tahapan uji pendahuluan aktivitas antibakteri (modifikasi Noer dan Nurhayati 2006). Keterangan: Produk
Proses
Penghomogenan dengan vorteks
Penuangan agar ke dalam cawan petri steril
Pendinginan selama 15 menit atau sampai agar membeku
Pemberian 20 μl ekstrak pada paper disc dengan konsentrasi 2%
Peletakkan paper disc ke dalam cawan yang telah berisi bakteri uji
Inkubasi pada suhu 37oC selama 18-20 jam dalam posisi terbalik Penginokulasian bakteri 20 μl dalam 15 ml media MHA
g) Pengukuran zona hambat
Aktivitas antibakteri dinyatakan positif apabila terbentuk zona hambat berupa zona bening disekeliling paper disc dan aktivitas antibakteri dinyatakan negatif apabila tidak terbentuk zona bening. Diameter zona hambat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
B - A hambat Zona = Keterangan :
A = Diameter zona hambat yang terbentuk (mm) B = Diameter kertas cakram (mm)
Gambar 11 Tahapan uji aktivitas antibakteri pada berbagai konsentrasi ekstrak (modifikasi Darusman et al. 1994).
Keterangan: Produk Proses
Penghomogenan dengan vorteks
Penuangan agar ke dalam cawan petri steril
Pendinginan selama 15 menit atau sampai agar membeku
Pemberian paper disc ekstrak 20 μl dengan konsentrasi 2%, 3,5%, 5% dan 6,5%
Peletakkan paper disc ke dalam cawan yang telah berisi bakteri uji
Inkubasi pada suhu 37oC selama 18-20 jam dalam posisi terbalik Penginokulasian bakteri (20 μl) dalam 15 ml media MHA
3.3.4. Analisis fitokimia
Identifikasi komponen aktif yang berperan sebagai antibakteri dalam kerang darah (A. granosa) dilakukan terhadap senyawa alkaloid, flavonoid dan steroid (Darusman et al. 1994) dengan metode sebagai berikut (Harborne 1987): a) Alkaloid (Harborne 1987)
Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2N kemudian diuji dengan tiga pereaksi Alkaloid, yaitu pereaksi Dragendorff, Meyer dan Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan cokelat dengan pereaksi Wagner dan endapan merah sampai jingga dengan pereaksi Dragendorff.
b) Steroid (Harborne 1987)
Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering. Ke dalamnya ditambahkan 10 tetes anhidrida asetat dan 3 tetes H2SO4 pekat. Terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau menunjukkan reaksi positif.
c) Flavonoid (Harborne 1987)
Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.