Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2008 sampai dengan Januari 2009. Lokasi yang dijadikan tempat melakukan penelitian ini adalah Laboratorium Zoologi dan Laboratorium Terpadu Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Materi Sampel Darah
Sampel darah kerbau yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 44 sampel yang dikumpulkan dari beberapa tempat di Indonesia, yaitu 10 sampel dari Jawa Tengah, 12 sampel dari Nusa Tenggara Barat, 10 sampel dari Sumatera Utara dan 12 sampel dari Banten. Sampel darah disimpan dalam alkohol 70% yang mengandung etilendiamintetraasetat (EDTA) 1%. Isolasi DNA dilakukan menggunakan Genomic DNA mini kit (Geneaid).
Ekstraksi DNA
Bahan - bahan yang digunakan untuk mengekstraksi DNA adalah 5 M NaCl, 0,001M EDTA, NaCl 0,2 µl dan 0,9 % proteinase K (5 mg/ml), 1 x STE (sodium tris EDTA), 10 dan 20% sodium dodesil sulfat (SDS), fenol, kloroform iso amil alkohol, 70% etanol, dan 80% buffer TE (tris EDTA).
Alat-alat yang digunakan antara lain tabung vaccutainer (penampung darah), tabung Eppendorf ukuran 0,5 dan 1,5 ml, pipet mikro Eppendorf ukuran 10 µl-1 ml, tips Eppendorf, vortex mixer, vacuum desicator, alat sentrifugasi makro dan mikro, refrigerator (4oC), freezer (-20oC), autoclave, sarung tangan plastik dan kertas tisu.
Primer
Primer adalah molekul oligonukleotida yang berukuran pendek (sekitar 18-24 basa) yang akan menempel pada DNA cetakan di tempat yang spesifik. Amplifikasi ruas daerah pengendali pada DNA mitokondria menggunakan pasangan primer AF22 (5’-GCG TAC GCA ATC TTA CGA TCA-3’) dan AF23 (3’-ATG CAG TTA AGT CCA GCT AC-5’) yang meliputi ruas bagian ujung 3’ gen cyt- b sampai ke bagian daerah pengendali atau d-loop.
Amplifikasi DNA dengan Teknik Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Lenght Polymorphment (PCR-RFLP)
Bahan-bahan yang digunakan adalah sampel DNA, air bebas ion steril, GoTaq®PCR Core System 1 (Promega) yang terdiri dari enzym taq polymerase (NEB) dan buffernya, MgCl2 (NEB) dan dNTP, pasangan primer (Forward Reverse), enzim restriksi (AluI, HaeIII, Hinf I dan MspI) dengan buffernya, dan air destilata.
Alat–alat yang digunakan antara lain tabung PCR, mesin Thermocycler (TaKaRa PCR Thermal Cycler MP4 – TaKaRa Biomedicals), alat sentrifugasi, pipet mikro Eppendorf 2 µl dengan tipsnya, vortex, deep freezer dan power supply 500VA.
Elektroforesis
Bahan – bahan yang digunakan untuk membuat satu lembar gel poliakrilamida 6% non denaturasi adalah sebagai berikut: air destilata steril 12 ml, akrilamida 30% (akrilamida:bis = 29:1), larutan 5xTBE 4ml, tetramethylendiamine (TEMED) 15µl dan 10% ammonium persulfat (APS) sebanyak 160 µl, loading dye, dan marker 100 pb (biorad).
Alat – alat yang digunakan antara lain dua lempeng kaca untuk cetakan gel, pipet Mohr, tabung reaksi, sisir khusus untuk sumur, pipet mikro 2µl dengan tipsnya, tangki elektroforesis vertikal dan power supply 500VA.
Pewarnaan Perak
Bahan – bahan yang digunakan adalah air destilata, Cetyl Trimetil Ammonium Bromide (CTAB) 0,2 g/200 ml DW, NH4OH 2,4 ml/200 ml DW, larutan yang terdiri dari AgNO3 0,32 g, 10 N NaOH 0,08 ml, NH4OH 0,8 ml dalam air destilata 200 ml, larutan Na2CO3 4 g dengan formaldehida 0,1 ml dan asam asetat glacial 1%. Alat- alat yang digunakan antar lain nampan, gelas ukur, labu Erlenmeyer, dan water-bath shaker.
Rancangan
Analisa data dilakukan dengan metode deskriptif berdasarkan parameter keragaman nukleotida dan keragaman haplotipe. Sedangkan untuk melihat hubungan kekerabatan dan perbedaan jarak genetik yang nyata antar populasi diilustrasikan dalam bentuk dendrogram.
< < <
+
=
j i i j j i j i ijn
n
n
S
2
Keragaman Haplotipe (h)Keragaman haplotipe merupakan variasi genetika yang menggambarkan variasi dari DNA. Perhitungan nilai h berdasarkan persamaan (Nei, 1987) :
Keterangan:
h = keragaman haplotipe n = jumlah sampel
Xi = frekuensi haplotipe sampel ke-i
Keragaman Nukleotida ( )
Keragaman nukleotida merupakan ukuran keragaman genetika berdasarkan ada atau tidaknya situs restriksi. Perhitungan nilai ini berdasarkan persamaan (Nei dan Kumar, 2000) :
; = (- ln S)/b
Keterangan :
= keragaman nukleotida
S = peluang jika setiap haplotipe memiliki situs yang sama b = jumlah nukleotida setiap enzim
nij = jumlah situs pada kedua haplotipe i dan j ni = jumlah situs pada haplotipe i
nj = jumlah situs pada haplotipe j
Jarak Genetik (D)
Jarak genetik merupakan ukuran perbedaan genetik antara populasi yang dihitung berdasarkan frekuensi haplotipe setiap populasi. Perhitungan nilai D berdasarkan persamaan :
I
Ln
D
=
−
(
−
)
−
=
1
21
X
in
n
h
(
)
5 , 0 1 1 2 1 2 = = = ÷ × = m i m i m i Piy Pix Piy Pix IKeterangan :
Pix = frekuensi alel ke-i dari populasi X Piy = frekuensi alel ke-i dari populasi Y D = jarak genetik
Prosedur Pengambilan Sampel Darah
Sampel darah kerbau diambil dengan menggunakan tabung vakum yang mengandung antikoagulan, kemudian ditambahkan alkohol 75% dan dikocok membentuk angka delapan dan disimpan dalam suhu ruang sampai dilakukan ekstraksi DNA.
Isolasi DNA dari Sampel Darah
Isolasi DNA dilakukan dari sampel darah yang disimpan dalam alkohol 70% menggunakan metode isolasi mengikuti petunjuk produsen Genomic DNA mini kit Geneaid (Lampiran 1).
Amplifikasi mtDNA dengan Teknik Polymerase Chain Reaction–Restriction Fragment Lenght Polymorphism (PCR-RFLP)
Proses amplifikasi DNA secara umum menggunakan metode sebagai berikut: sampel DNA 2 µl dimasukkan kedalam tabung PCR, kemudian ditambah larutan premix 23 µl yang terdiri dari primer 1 µl, air destilata 16,35 µl, 10 x buffer sebanyak 2,5 µl, MgCl2 2 µl, 2 mM dNTP 1 µl, dan enzim taq polymerase Promega 0,15 µl. Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan mesin TaKaRa Thermal Cycler dengan kondisi predenaturasi 940C selama 5 menit yang kemudian diikuti dengan denaturasi 940C selama 1 menit, penempelan (annealing) 580C selama 2 menit dan pemanjangan (elongation) 720C selama 2 menit yang diulang 30 kali.
ElektroforesisProduk PCR
Amplikon atau produk PCR dipisahkan dengan teknik elektroforesis gel polyakrilamida 6%. Gel dibuat dengan cara mencampurkan air destilata 12 ml, 5 x TBE 4 ml, akrilamida 30% sebanyak 4 ml, TEMED 15 µl, dan APS 10% sebanyak 160 µl. Produk PCR sebanyak 2 µl dilarutkan dalam loading dye. Elektroforesis dilakukan selama 60 menit pada tegangan konstan 180 V atau sampai pewarna
bromtimol blue mencapai bagian bawah gel. Setelah elektroforesis selesai, gel diambil untuk dilakukan pewarnaan perak.
Pewarnaan Perak
Pewarnaan perak (silver staining) dilakukan dengan langkah sebagai berikut: gel dimasukan kedalam larutan CTAB 0,2 g/200 ml air destilata selama 8 menit sambil digoyang, kemudian dicuci dengan air destilata selama 2 x 2 menit. Air tersebut dibuang dan ditambahkan larutan NH4OH selama 6 menit sambil digoyang. Kemudian dilanjutkan dengan larutan AgNO3 selama 10 menit sambil digoyang. Kemudian gel dicuci kembali dengan air destilata 2 x 2 menit. Pemunculan pita dilakukan dengan cara perendaman gel dalam larutan Na2CO3. Setelah pita muncul, ditambahkan larutan asam asetat.
Pemotongan dengan Enzim Restriksi
Metode Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) digunakan untuk mengetahui keragaman ruas target berdasarkan ada tidaknya situs restriksi. Enzim yang digunakan dalam penelitian ini adalah AluI (AG CT), HaeIII (GG CC), Hinf I (G AnTC), dan MspI (G CGG). Kondisi reaksi pemotongan pada setiap enzim restriksi mengikuti petunjuk teknis produsen, yaitu produk PCR sebanyak 3 µl ditambahkan enzim restriksi sebanyak 1 unit dengan menggunakan buffer (New England Biolabs) yang menyertai setiap enzim restriksi. Kemudian campuran tersebut diinkubasi dalam inkubator pada suhu 370C selama semalam.
Hasil pemotongan dielektroforesis pada gel poliakrilamid 6% (30% akrilamid) dalam buffer 1xTBE (Tris 0,5 M; Asam Borat 0,65 M; EDTA 0,02 M) pada tegangan 180 V selama 60 menit. Visualisasi hasil pemotongan oleh enzim restriksi dilakukan dengan pewarnaan perak. Pola pita hasil pemotongan tiap enzim restriksi digunakan untuk menentukan haplotipe mtDNA atau disebut sebagai genotiping. Penentuan genotip dilakukan dengan cara menentukan ukuran panjang potongan DNA berdasarkan jarak migrasi pada gel poliakrilamid yang diacukan pada DNA ladder 100 base pair (Biorad).
HASIL DAN PEMBAHASAN