Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, Pasca Panen dan Balai Besar Industri Agro (BBIA), Bogor. Penelitian ini berlangsung selama 8 bulan dari bulan Januari sampai Agustus 2009.
Materi
Bahan-bahan utama untuk pembuatan kultur starter yang digunakan dalam penelitian ini adalah susu skim steril, kultur starter bakteri yang terdiri atas S. thermophilus (St RM-01), L. bulgaricus (Lb RM-01), L. acidophilus (La RM-01)dan B. longum (Bl RM-01) koleksi Bagian Teknologi Hasil Ternak. Bahan-bahan yang digunakan untuk pengujian kualitas mikrobiologi meliputi media deMan’s Rogosa Sharpe broth (MRSB), deMan’s Rogosa Sharpe agar (MRSA), violet red bile agar (VRBA) Lactose, buffer peptone water (BPW), inulin, laktosa, sodium starch glikolat (SSG), maltodekstrin, alginat, sukrosa bahan pengemas yang digunakan adalah alumunium foil yang berlapis (Low Density Polyethylene) LDPE. Alat yang digunakan yaitu separator krim, labu erlenmeyer, tabung reaksi, inkubator, eksikator, oven, neraca analitik, baker glass, spektrofotometer, pipet, autoklaf, gelas ukur, ayakan 12 dan 20 mesh, titrasi, cawan petri, viskometer pemanas dan pengaduk.
Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian tahap I dan tahap II adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola searah dengan tiga kali ulangan yaitu pada penelitian tahap I meliputi a) pembuatan kultur starter yogurt kering, b) enkapsulasi dan pengeringan sinbiotik terenkapsulasi, c) evaluasi karakteristik mikrobiologis masing-masing formula granul (L21S1, L20S2 dan L19S3) dan penelitian tahap II yaitu pada a) aplikasi kultur starter yogurt sinbiotik dalam bentuk granul dan kultur starter yogurt cair. Adapun model rancangan matematikanya menurut Mattjik dan Sumertajaya (2000) sebagai berikut :
Keterangan :
Penelitian Tahap I : Pembuatan dan Evaluasi Kultur Starter Yogurt dengan Sinbiotik Terenkapsulasi dalam Bentuk Granul
a) Pembuatan kultur starter yogurt kering
Yij = Hasil pengamatan (parameter) pada perlakuan taraf ke-i dan ulangan taraf ke-J
μ = Nilai rataan jumlah bakteri asam laktat
i = Pengaruh perlakuan pengeringan kultur starter yogurt
ij = Pengaruh acak pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j i = Kultur kerja sebelum spray dry dan setelah spray dry j = ulangan (1, 2 dan 3)
b) Enkapsulasi dan pengeringan sinbiotik
Yij = Hasil pengamatan (parameter) pada perlakuan taraf ke-i dan ulangan taraf ke-J
μ = Nilai rataan jumlah bakteri asam laktat
i = Pengaruh perlakuan pengeringan enkapsulasi sinbiotik
ij = Pengaruh acak pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
i = Enkapsulasi sinbiotik sebelum freeze dry dan setelah freeze dry j = ulangan (1, 2 dan 3)
c) Evaluasi karakteristik mikrobiologis masing-masing formula granul
Yij = Hasil pengamatan (parameter) pada perlakuan taraf ke-i dan ulangan taraf ke-J
μ = Nilai rataan umum
i = Pengaruh perlakuan formula yang berbeda
ij = Pengaruh acak pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j i = FormulaL21S1, formula L20S2 dan formula L19S3
Peubah
Peubah mikrobiologis yang diamati meliputi jumlah bakteri asam laktat, total plate count (TPC) dan total bakteri koliform.
Penelitian Tahap II : Aplikasi Pembuatan Yogurt Menggunakan Kultur Starter Yogurt Sinbiotik dalam Bentuk Granul
a) Aplikasi kultur starter yogurt sinbiotik dalam bentuk granul dan yogurt kontrol
Yij = Hasil pengamatan (parameter) pada perlakuan taraf ke-i dan ulangan taraf ke-J
μ = Nilai rataan umum
i = Pengaruh perlakuan pada penggunaan kultur starter yang berbeda
ij = Pengaruh acak pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
i = Kultur starter yogurt kering (L21S1, L20S2, dan L19S3) dengan kultur starter yogurt sinbiotik cair
j = ulangan (1, 2 dan 3)
Peubah
Peubah mikrobiologis yang diamati meliputi jumlah bakteri asam laktat serta nilai pH dan nilai TAT.
Analisis Data
Data yang diperoleh dilakukan uji asumsi, jika data memenuhi asumsi maka data dianalisis dengan iji parametrik (ANOVA), jika data tidak memenuhi uji asumsi maka data dianalisis menggunakan uji non parametrik (Kruskal Wallis). Jika perlakuan menunjukkan pengaruh nyata maka dilanjutkan dengan uji Tukey (parametrik) dan uji beda rataan ranking (non parametrik).
Prosedur
Penelitian Tahap I : Pembuatan dan Evaluasi Kultur Starter Yogurt dengan Sinbiotik Terenkapsulasi dalam Bentuk Granul
Penelitian Tahap I bertujuan untuk mengetahui proses pembuatan dan evaluasi kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi dalam bentuk granul.
Penelitian tahap I meliputi tahapan a) persiapan kultur starter yogurt dan probiotik yaitu dilakukan pengamatan morfologi masing-masing bakteri, uji pewarnaan Gram dan uji katalase; b) penentuan waktu pemanenan bakteri asam laktat sebagai kultur starter yogurt dan probiotik dengan mengikuti kurva pertumbuhan pada masing-masing bakteri asam laktat St RM-01, Lb RM-01, La RM-01 dan Bl RM-01; c) pembuatan kultur starter yogurt dan enkapsulasi sinbiotik kering, d) formulasi, granulasi dan evaluasi kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi dan e) pengemasan.
a) Persiapan Kultur Starter Yogurt dan Probiotik
Pemeriksaan kemurnian kultur starter Streptococcus thermophilus (St RM-01), Lactobacillus bulgaricus (Lb RM-01), Lactobacillus acidophilus (La RM-01), Bifidobacterium longum (Bl RM-01) dilakukan melalui pemeriksaan morfologi secara mikroskopik terhadap starter St RM-01, Lb RM-01, La RM-01, Bl RM-01 dengan bantuan metode pewarnaan Gram dan uji katalase.
Metode pewarnaan mengacu pada Fardiaz (1989)yaitu preparat bakteri yang telah dioleskan pada gelas objek, ditetesi dengan kristal violet dan dibilas dengan aquades. Preparat dikeringudarakan kemudian ditetesi dengan larutan lugol iodin dan kembali dibilas dengan aquades. Preparat kemudian dikering udarakan, selanjutnya ditetesi dengan alkohol 95% sebagai bahan pemucat. Pewarnaan terakhir menggunakan safranin, pembilasan dilakukan dengan aquades, preparat dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x dengan bantuan immersion oil. Bakteri dikelompokkan menjadi Gram positif, bila hasil pengamatan menunjukkan dapat mempertahankan zat warna ungu kristal sehingga tampak ungu tua. Kelompok bakteri Gram negatif akan terlihat berwarna merah, karena pada saat dicuci dengan alkohol tidak dapat mempertahankan warna ungu sehingga sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin bakteri menyerap warna tersebut dan tampak berwarna merah.
Pengujian katalase dilakukan dengan cara mengambil preparat bakteri dengan jarum ose dan dioleskan pada gelas objek, kemudian ditetesi dengan satu tetes H2O2. Apabila dihasilkan gelembung-gelembung gas, maka bakteri yang diperiksa termasuk kelompok bakteri katalase positif, sebaliknya apabila tidak menghasilkan gelembung gas maka termasuk kelompok bakteri katalase negatif.
b) Penentuan Waktu Pemanenan Bakteri Asam Laktat sebagai Kultur Starter Yogurt dan Probiotik (Tamime, 2005)
Kultur kerja bakteri asam laktat yogurt (St RM-01 dan Lb RM-01) dan probiotik (La RM-01 dan Bl RM-01) sebanyak 5% (v/v) diinokulasikan ke dalam media MRS broth (250 ml) lalu diinkubasikan pada suhu 37 ± 1oC dan pertumbuhannya diikuti selama 24 jam. Pengamatan dilakukan setiap 1 jam diukur nilai Optical Density untuk kemudian dikorelasikan jumlah populasi bakteri berdasarkan kurva standar yang telah disiapkan sebelumnya.
c) Pembuatan Kultur Starter Yogurt dan Enkapsulasi Sinbiotik dalam Bentuk Kering
c.1. Pembuatan Kultur Starter Yogurt Kering. Pembuatan kultur starter yogurt kering diawali dengan inokulasi masing-masing kultur starter yogurt sebanyak 5% (v/v) ke dalam susu skim cair untuk menghasilkan kultur kerja. Diagram alir pembuatan kultur kering yogurt dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Diagram Alir Pembuatan Bubuk Starter Yogurt Kering
Inkubasi dilakukan untuk masing-masing isolat pada suhu 37 ± 1oC selama 10 jam, yaitu untuk mencapai fase logaritmik sesuai dengan hasil penelitian pendahuluan. Kultur kerja yang diperoleh ditambah dengan maltodekstrin 4% sebagai pengisi dan senyawa kriogenik laktosa 6% (Hartaji, 2000; Pratiwi, 2005).
Susu Skim Cair + 5% (v/v) St RM-01
Susu Skim Cair + 5% (v/v) Lb RM-01
Inkubasi suhu 37oC selama 10 jam Spray Dry Inlet 180oC ; outlet 80oC Bubuk St RM-01 St RM-01 + 6% (b/v) laktosa + 4% (b/v) Maltodekstrin Lb RM-01 + 6% (b/v) laktosa + 4% (b/v) Maltodekstrin
Inkubasi suhu 37oC selama
10 jam
Spray Dry Inlet 180oC ; outlet 80oC
Semua bahan tersebut dicampur hingga homogen dengan cara diaduk, selanjutnya dilakukan proses pengeringan dengan metode spray dry (suhu inlet 180oC dan outlet 80oC) untuk menghasilkan bubuk kultur starter yogurt (Sari, 2001).
c.2. Enkapsulasi dan Pengeringan Sinbiotik (Reyed, 2007 yang dimodifikasi) Metode yang digunakan dalam proses enkapsulasi sinbiotik adalah metode hibrid Reyed (2007) yang dimodifikasi dengan penambahan substrat prebiotik berupa inulin 2% ke dalam bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan enkapsulasi sinbiotik. Tahap awal dalam pembuatan sinbiotik terenkapsulasi yaitu dimulai dengan menumbuhkan La RM-01 dan Bl RM-01 secara terpisah, masing-masing sebanyak 5% (v/v) dalam MRSB (deMan Ragosa Sharp Broth) dan diinokulasi pada suhu 37 ± 1oC dan dipanen pada fase logaritmik (yaitu selama 15 jam hasil dari penelitian tahap I). Sel bakteri dipanen dengan cara disentrifus (4o C) selama 20 menit pada 10.000 rpm. Sel bakteri yang diperoleh dilarutkan pada 100 ml campuran yang terdiri atas susu skim 10% (b/v), gliserol 5% (v/v), inulin 2% (b/v) dan CaCO3
0,1% (b/v), diperangkap selama 45 menit di dalam 100 ml larutan alginat steril dengan konsentrasi 3% (b/v). Campuran tersebut disemprotkan pada CaCl2 (0,1 M). Setelah satu jam, gel yang terbentuk dipindahkan dalam larutan fisiologis (0,85%) untuk mendapatkan struktur gel yang kompak. Butiran-butiran gel yang terbentuk dipindahkan ke air destilasi dan dilakukan pemutaran secara perlahan selama 1 jam untuk menghilangkan residu CaCO3 dan mendapatkan butiran yang lebih keras. Butiran bakteri probiotik terenkapsulasi yang telah diperangkap di CaCO3 siap untuk dikeringkan. Pengeringan biokapsul menggunakan metode freeze dry. Suhu pengeringan beku freeze dry yang digunakan pada suhu -50oC (Sari, 2001). Diagram alir enkapsulasi sinbiotik dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Diagram Alir Enkapsuplasi Sinbiotik (Reyed, 2007) Inokulasi La RM-01 5% (v/v) pada
MRSB pH 7
Inokulasi Bl RM-01 5% (v/v) pada MRSB pH 7
Inkubasi pada suhu 37oC selama 16 jam
Inkubasi pada suhu 37oC selama 16 jam
Sentifugasi (4oC) selama 20 menit pada 10.000 rpm
Sentifugasi (4oC) selama 20 menit pada 10.000 rpm
Pelarutan sel bakteri dalam media mikroenkapsulasi larutan : 100 ml aquades + 10%(b/v) susu skim+5%
(v/v) gliserol +inulin 2%(b/b) + 0,1% (b/v)CaCO3
Pelarutan sel bakteri dalam media mikroenkapsulasi larutan : 100 ml
aquades + 10%(b/v) susu skim+5%(b/v) gliserol +inulin
2%(b/b)+ 0,1%(b/b) CaCO3
Campuran diperangkap (45 menit) dalam larutan alginat steril (3%
b/v) Campuran diperangkap (45 menit)
dalam larutan alginat steril (3% b/v)
Campuran diteteskan pada CaCl2 0,1 M dibiarkan selama 1 jam
Campuran diteteskan pada CaCl2 0,1 M dibiarkan selama 1 jam
Penguatan struktur Gel yang dalam larutan fisiologis (0,85%)
Penguatan struktur Gel yang dalam larutan fisiologis (0,85%) Pencucaian Gel yang terbentuk
dipindahkan ke air distilasi
Pencucaian Gel yang terbentuk dipindahkan ke air distilasi
Mikroenkapsulasi La RM-01 siap untuk dikeringkan (Freeze dry)
Mikroenkapsulasi Bl RM-01 siap untuk dikeringkan (Freeze dry)
d) Formulasi, Granulasi dan Evaluasi Kultur Starter Yogurt dengan Sinbiotik Terenkapsulasi
d.1 Formulasi Kultur Starter Yogurt dengan Sinbiotik Terenkapsulasi
Formulasi kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi dalam bentuk granul terdiri atas 3 formulasi yaitu formulasi L21S1, L20S2 dan L19S3. Formulasi ketiga granul tersebut berbeda pada persentase bahan laktosa dan sodium strach glikolat (SSG). Formulasi L21S1 dengan komposisi laktosa sebesar 21% (b/b) dan SSG 1% (b/b), formulasi L20S2 dengan komposisi laktosa sebesar 20% (b/b) dan SSG 2% (b/b) dan formulasi L19S3 dengan komposisi laktosa sebesar 19% (b/b) dan SSG 3% (b/b). Formulasi kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Formulasi Kultur Starter Yogurt Sinbiotik dalam Bentuk Granul
Bahan Granul Formulasi
L21S1 L20S2 L19S3
---%(b/b) ---
Kultur starter yogurt
Bubuk St RM-01 25 25 25
Bubuk Lb RM-01 25 25 25
Bioenkapsul Probiotik kering
La RM-01 1 1 1
Bl RM-01 1 1 1
Laktosa 21 20 19
Susu skim 26 26 26
Sodium starch glikolat (SSG) 1 2 3
Total 100 100 100
d.2. Granulasi Kultur Starter Yogurt dengan Sinbiotik Terenkapsulasi
Granulasi pada kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi melalui metode granulasi basah. Bahan-bahan yang digunakan dalam granulasi kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi terdiri atas kultur starter yogurt kering dalam bentuk bubuk, sinbiotik terenkapsulasi kering dalam bentuk crumble, laktosa,
sukrosa 60% (b/v), sodium starch glikolat (SSG) dan susu skim. Adapun tahapan dalam granulasi basah pada kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi adalah sebagai berikut: 1) penimbangan bahan-bahan yang akan digunakan; 2) pencampuran bahan-bahan; 3) penambahan larutan sukrosa dan 4) pengayakan tahap pertama (12 mesh), 5) hasil ayakan dikeringkan dengan oven pada suhu 40±1oC selama 2 jam kemudian 6) setelah kering dilakukan pengayakan tahap kedua (20 mesh). Diagram alir proses pembuatan granul kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Diagram Alir Proses Pembuatan Kultur Starter Yogurt Sinbiotik dalam Bentuk Granul dengan Metode Granulasi Basah
d. 3. Evaluasi Karakteristik Mikrobiologis Granul Kultur Starter Yogurt
Evaluasi karakteristik mikrobiologis granul kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi dilakukan pada masing-masing formula (L21S1, L20S2 dan L19S3). Karakteristik mikrobiologis meliputi jumlah bakteri asam laktat, total plate
Penimbangan bahan baku granul Mixing I Shifting I Drying 40±1oC, 2 jam Shifting II Granul Pengemasan Penambahan Biokapsul Kering
count dan jumlah bakteri koliform. Berikut adalah prosedur pengujian terhadap karakteristik mikrobiologis :
Jumlah Bakteri Asam Laktat (DSN, 1992). Media tumbuh untuk bakteri asam laktat yang digunakan adalah deMan Ragosa Sharpe agar (MRSA). Sampel granul atau yogurt sinbiotik ditimbang sebanyak 1 ml atau 1 g dimasukkan dalam 9 ml buffer pepton water (BPW) untuk mendapatkan pengenceran sepersepuluh (P-1). Pengenceran dilanjutkan dengan cara yang sama untuk mendapatkan pengenceran seperseratus (P-2) hingga diperoleh P-8. Sebanyak 1 ml dari pengenceran yang dikehendaki (P-5sampai P-8) dipipet ke dalam cawan Petri steril, kemudian ditambahkan media MRSA sebanyak ± 12 ml pada masing-masing cawan. Homogenisasi dilakukan dengan menggerakkan cawan Petri membentuk angka delapan. Setelah agar dalam cawan membeku, cawan diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 37±1oC selama 24-48 jam.
Total Plate Count (DSN, 1992). Pemupukan dilakukan dengan menggunakan media plate count agar (PCA) dengan cara sampel granul atau yogurt sinbiotik ditimbang sebanyak 1 ml atau 1 g dimasukkan dalam 9 ml buffer pepton water (BPW) untuk mendapatkan pengenceran sepersepuluh (P-1). Pengenceran dilanjutkan dengan cara yang sama untuk mendapatkan pengenceran seperseratus (P-2) hingga diperoleh P-8. Sebanyak 1 ml dari pengenceran yang dikehendaki (P-5sampai P-8) dipipet ke dalam cawan Petri steril, kemudian ditambahkan media PCA yang telah dingin (kira-kira 37 ±1o C) dituangkan ke dalam cawan petri steril tersebut sebanyak 12-15 ml. Campuran tersebut dihomogenkan dengan cara cawan Petri digerakkan dengan arah membentuk angka delapan. Setelah agar mengeras, cawan Petri diinkubasikan dengan posisi terbalik pada suhu 37 ±1oC selama 24-48 jam. Jumlah bakteri ditentukan dengan metode hitungan cawan dan untuk melaporkan hasil analisis digunakan standard plate count (SPC).
Jumlah Bakteri Koliform (DSN, 1992). Sampel ditimbang sebanyak 1 g granul atau yogurt dimasukkan ke dalam 9 ml buffer pepton water (BPW) sebagai pengenceran sepersepuluh (P-1). Pengenceran ini dilakukan hingga P-3. Penentuan dari pengenceran P-1 sampai P-3 dipipet ke dalam cawan Petri steril dan dipupukan sebanyak 12 ml violet red bile agar (VRBA). Selanjutnya dihomogenkan dengan cara
cawan Petri digerakkan dengan arah membentuk angka delapan. Bila sudah membeku, pada permukaanya dilapisi (over lay) dengan medium yang sama tetapi lebih tipis (± 3 ml), lalu dibiarkan lagi sampai agar membeku. cawan Petri diinkubasi pada posisi terbalik pada suhu 37±1oC selama 24-48 jam.
e) Pengemasan. Kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi dalam bentuk granul dikemas secara vakum dan aseptik menggunakan alumunium foil berlapis Low Density Polyethylene (LDPE) pada bagian dalamnya dan tiap kemasan berisi 10 g. Produk granul kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi disimpan pada suhu refrigerator (5±1 oC).
Penelitian Tahap II : Aplikasi Pembuatan Yogurt Menggunakan Kultur Starter Yogurt Sinbiotik dalam Bentuk Granul
Penelitian tahap II bertujuan mengaplikasikan granul kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi untuk menghasilkan yogurt sinbiotik. Kultur starter yogurt sinbiotik dalam bentuk cair digunakan juga untuk menghasilkan yogurt sinbiotik kontrol. Parameter yang digunakan dalam pengujian kualitas mikrobiologis pada aplikasi kultur starter yogurt sinbiotik dalam bentuk granul dan kultur starter yogurt sinbiotik cair adalah jumlah bakteri asam laktat.
a. 1. Aplikasi Kultur Starter Yogurt Sinbiotik dalam Bentuk Granul. Susu skim (TS 16%) dipanaskan pada suhu 80-85oC selama 30 menit, kemudian didinginkan hingga ± 40oC. Granul kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi sebanyak 10 g ditambahkan dan dilakukan pengadukan hingga kultur starter larut keseluruhannya. Inkubasi dilakukan pada suhu 37±1oC selama 16 jam. a. 2. Aplikasi Kultur Starter Yogurt Sinbiotik Cair. Susu skim (TS 16%) dipanaskan pada suhu 80-85oC selama 30 menit, kemudian didinginkan hingga ± 40oC. Granul kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi sebanyak 5% (v/v) ditambahkan dan dilakukan pengadukan hingga kultur starter larut keseluruhannya. Inkubasi pada suhu 37±1oC selama 16 jam.
Kualitas yogurt dengan sinbiotik terenkapsulsi dan kontrol ditentukan melalui evaluasi nilai pH dan total asam tertritasi (TAT). Prosedur pengujian pH dan TAT sebagai berikut:
Nilai pH SNI 01-2891-1992 (DSN, 1992). Pengukuran pH menggunakan pH meter yang distandardisasi dengan larutan buffer pH 4 dan 7 sebelum digunakan. Sampel sebanyak 10 ml yogurt sinbiotik diambil, kemudian elektroda yang telah dibilas dengan air aquades dicelupkan ke dalam sampel. Nilai yang dibaca adalah nilai saat pH meter telah stabil.
Total Asam Tertitrasi (Apriyanto et al., 1989)
Pengukuran total asam tertitrasi menggunakan prinsip asam basa. Sampel sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer kemudian ditambahkan 2-3 tetes indikator fenolftalein 1%. Sampel dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N. Sampel kemudian dititrasi sampai terbentuk warna merah muda dan tidak hilang dalam waktu 30 detik.
Total Asam Tertitrasi (%) = 100%
100 Vsampel 90 NaOH N NaOH V × × × × Keterangan :
VNaOH = volume NaOH yang digunakan (ml) NNaOH = molaritas NaOH (0,1 N)