Penelitian ini bertujuan untuk memberikan informasi tentang aktivitas antidepresan ekstrak etanol rimpang Curcuma heyneana terhadap mencit yang mengalami depresi. Metode penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental yaitu suatu percobaan yang dilakukan untuk mengetahui suatu gejala atau pengaruh yang timbul akibat adanya perlakuan tertentu. Metode penelitian ini meliputi pengumpulan dan pembuatan simplisia, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia simplisia, pembuatan ekstrak, skrining fitokimia ekstrak, karakterisasi ekstrak dan pengujian aktivitas antidepresan ekstrak etanol rimpang Curcuma heyneana. Variabel yang diukur dalam penelitian ini adalah aktivitas lokomotor mencit serta immobility time mencit yaitu jumlah waktu tidak bergerak (badan, kaki, tangan dalam keadaan diam).
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakologi dan Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara pada bulan Juni 2020- Desember 2020.
3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, aluminium foil, blender, box, cawan penguap, kamera digital, kandang mencit, kertas perkamen, kertas saring, kotak kaca, lemari pengering, mortar dan stamfer, neraca analitik (Mettler Toledo), neraca hewan (Presica
Jeniweigher GW-1500), penangas air, pipet kapiler, rotary evaporator, sonde oral, spuit 1 ml (terumo), stopwatch, dan tiang penggantung.
3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan yaitu ekstrak etanol rimpang Curcuma heyneana, etanol 96%, Natrium-Carboxymethyle Cellulose (CMC-Na), sertralin (PT.
Guardian Pharmatama), mencit jantan.
3.3 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu penentuan sampel dengan pertimbangan tertentu dimana pengambilan sampel dilakukan berdasarkan pertimbangan bahwa semua rimpang Curcuma heyneana mempunyai kandungan senyawa yang sama. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah rimpang Curcuma heyneana yang diperoleh di Kota Berastagi, Kabupaten Karo, Sumatera Utara yang dipanen bulan Mei 2020.
3.4 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Medanense Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara.
3.5 Pengolahan Sampel
Rimpang Curcuma heyneana dibersihkan dengan air mengalir untuk menghilangkan pengotor, kemudian ditiriskan dan ditimbang untuk memperoleh berat basah. Selanjutnya dipotong – potong dan dikeringkan di lemari pengering dengan suhu 40oC hingga kering dan rapuh, Kemudian simplisia dihaluskan dengan menggunakan blender dan ditimbang, selanjutnya disimpan di dalam wadah tertutup. Diperoleh 1109 gram serbuk simplisia (Depkes RI, 1985).
3.6 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia dan Ekstrak Etanol Rimpang Curcuma heyneana.
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan organoleptik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut dalam air, penetapan kadar sari larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, dan penetapan kadar abu tidak larut dalam asam. Pemeriksaan karakteristik ekstrak meliputi penetapan kadar air, penetapan kadar abu total, dan penetapan kadar abu tidak larut asam (Depkes RI, 2017).
3.6.1 Pemeriksaan Makroskopik dan Organoleptik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, dan permukaan simplisia rimpang Curcuma heyneana. Pemeriksaan organoleptik dilakukan dengan mengamati warna, bentuk, rasa, dan bau dari simplisia rimpang Curcuma heyneana.
3.6.2 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan menggunakan metode Azeotropi (destilasi toluen). Dimasukkan bahan ke dalam labu alas bulat yaitu 200 mL toluena dan 2 mL air suling, dan didestilasi selama 2 jam, kemudian toluen dibiarkan hingga dingin selama ± 30 menit kemudian dibaca volume air awal.
Dimasukkan 5 g sampel yang telah ditimbang secara seksama ke dalam labu yang berisikan toluene tersebut. Dipanaskan hati-hati selama 15 menit.
Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes per detik, sampai sebagian air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan hingga 4 tetes per detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan
dingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, dibaca volume air. Selisih kedua volume air dibaca dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen (Depkes RI, 2017).
3.6.3 Penetapan Kadar Sari Larut Dalam Air
Dilakukan maserasi 5 g serbuk simplisia selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform (2,5 ml air-kloroform dan air suling sampai 1 liter) dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105˚C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 2017).
3.6.4 Penatapan Kadar Sari Larut Dalam Etanol
Dilakukan maserasi 5 g serbuk simplisia selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96% dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam lalu disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat di uapkan hingga kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105˚C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96 persen dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 2017).
3.6.5 Penetapan Kadar Abu Total
Dimasukkan 2 g sampel dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus porselin bersama isinya dipijar perlahan-lahan sampai
arang habis, jika arang masih tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air panas, saring menggunakan kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa dan kertas saring dalam krus yang sama. Masukkan filtrat kedalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 2017).
3.6.6 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut Dalam Asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu didihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan disaring melalui kertas saring bebas abu, kemudian cuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijar, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 2017).
3.7 Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak Etanol Rimpang Curcuma heyneana
Skrining fitokimia serbuk simplisia dan ekstrak etanol rimpang Curcuma heyneana meliputi pemeriksaan senyawa golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, saponin, tanin, dan steroid/triterpenoid.
3.7.1 Pemeriksaan Alkaloid
Ditimbang sebanyak 0,5 g sampel kemudian ditambahkan 1 ml HCl 2N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, kemudian didinginkan dan disaring. Dimasukkan 0,5 ml filtrat, kedalam 3 tabung reaksi.
Pada masing-masing tabung reaksi :
1. Ditambahkan 2 tetes periaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning
2. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai kehitaman.
3. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendroff, akan terbentuk endapan berwarna coklat atau jingga kecoklatan.
Alkoloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua dari 3 percobaan diatas (Depkes RI, 1995).
3.7.2 Pemeriksaan Flavonoid
Ditimbang 10 g sampel dimasukkan kedalam tabung reaksi lalu ditambahkan 10 ml air panas, kemudian didihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Diambil 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok, dan dibiarkan hingga memisah. Positif flavonoid jika terjadi warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol (Farnsworth, 1966).
3.7.3 Pemeriksaan Glikosida
Ditimbang 3 g sampel, kemudian disari dengan 30 ml campuran etanol 96% dengan air (7:3) dan 10 ml HCl 2N, di refluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 20 ml air suling dan 20 ml timbal (II) aseatat 0,4 M, dikocok, dan didiamkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran kloforoform-isopropanol (3:2) sebanyak 3 kali pada kumpulan sari lapisan isopropanol diuapkan pada suhu tidak lebih dari 50˚C sisanya dilarutkan dengan 2 ml metanol untuk larutan percobaan. 0,1 ml larutan percobaan diuapkan diatas penangas air pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes Molish, kemudian ditambahkan hati-hati 2 ml hati-hati asam sulfat, terbentuk
cincin berwarna ungu pada batas cairan, menunjukkan adanya ikatan gula (Depkes RI, 1995).
3.7.4 Pemeriksaan Saponin
Ditimbang 0,5 g sampel dan dimasukkan kedalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 menit jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan buih tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2N menunjukkan adanya saponin (Depkes RI, 1995).
3.7.5 Pemeriksaan Tanin
Ditimbang 1 g sampel kemudian didihkan selama 3 menit dalam air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi (III) klorida 1% b/v. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin atau (Farnsworth, 1966).
3.7.6 Pemeriksaan Steroid/Triterpenoid
Dilakukan maserasi 1 g serbuk simplisia dengan n-heksan 20 ml selama 2 jam, dan disaring, lalu filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat (pereaksi Lieberman Bourchard), diteteskan pada saat akan mereaksikan sampel uji.
Apabila terbentuk warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroida sedangkan warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid (Harbone, 1996).
3.8 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak etanol dilakukan secara maserasi menggunakan pelarut etanol 96%. Dimasukkan 10 bagian simplisia ke dalam wadah berwarna gelap,
tuang 75 bagian cairan penyari, tutup, dan biarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, diserkai, peras, cuci ampas dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Pindahkan ke dalam bejana tertutup, biarkan di tempat sejuk, terlindung cahaya, selama 2 hari. Enap tuangkan atau saring. Maserat diuapkan dengan rotary evaporator pada temperatur ± 40oC sampai diperoleh ekstrak kental (Depkes RI, 1979).
3.9 Penetapan Kadar Kurkuminoid
Ekstrak dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml kemudian dilarutkan dengan anhidrida asam asetat dan diadkan sampai garis tanda. Larutan dipipet sebanyak 1 ml dimasukkan kedalam beker glass ditambahkan asam borat dan asam oksalat kemudian ditutup dan dipanaskan di penangas air selama 10 menit dan didinginkan. Dipindahkan ke labu ukur 10 ml dan diadkan dengan anhidrida asam asetat hingga garis tanda. Setelah itu dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum dan operating time (Rahayu dkk., 2010)
3.10 Uji Aktivitas Antidepresan
Pengujian efek antidepresan ini terdiri dari beberapa tahap, yaitu penyiapan hewan percobaan, penyiapan bahan uji, induksi stres kronis ringan dan pengujian efek antidepresan.
3.10.1 Penyiapan Hewan Uji
Hewan uji yang digunakan adalah mencit jantan, umur 2-3 bulan dengan berat 20-35 gram sebanyak 24 ekor yang dibagi dalam 6 kelompok perlakuan dimana setiap kelompok perlakuan terdiri dari 4 ekor mencit dalam kondisi sehat.
Hewan diaklimatisasi selama 1 minggu, hal ini bertujuan agar hewan coba dapat beradaptasi di lingkungan baru dengan cara menyeragamkan cara hidup dan
makanannya dengan kondisi yang serba sama. Penelitian ini telah mendapatkan persetujuan komite etik No. 00515/KEPH-FMIPA/2020.
3.10.2 Penyiapan Bahan Uji, Kontrol dan Obat Pembanding
Ekstrak etanol rimpang Curcuma heyneana dosis 50 mg/kg BB, 100 mg/kg BB, 200 mg/kg BB (bahan uji), sertralin (kontrol positif), suspensi Na-CMC 0,5% (kontrol negatif).
3.10.2.1 Pembuatan Suspensi Na-CMC 0,5%
Ditimbang 0,5 g Na-CMC kemudian ditaburkan kedalam lumpang yang berisikan air suling panas sebanyak 10 mL. Didiamkan selama 15 menit lalu digerus hingga diperoleh massa yang transparan, lalu digerus sampai homogen, diencerkan dengan sedikit air suling, dihomogenkan dan dimasukkan ke labu tentukur 100 mL, dicukupkan volumenya dengan air suling hingga 100 ml (Anief, 1999). Suspensi ini digunakan sebagai pembawa EERC dan sertralin.
3.10.2.2 Pembuatan Suspensi Ekstrak Etanol Rimpang Curcuma heyneana Ditimbang 0,1 gram ekstrak etanol rimpang Curcuma heyneana kemudian dimasukkan ke dalam lumpang, ditambahkan tween 80 secukupnya dan sedikit demi sedikit suspensi Na CMC 0,5%, kemudian digerus sampai homogen.
Dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL, dicukupkan sampai garis tanda.
3.10.2.3 Pembuatan Suspensi Sertralin
Digerus tablet sertralin di dalam lumpang, kemudian ditimbang sesuai dosis 6,5 mg/kg BB. Kemudian serbuk dimasukkan kedalam lumpang dan ditambahkan sedikit demi sedikit CMC-Na 0,5% digerus hingga homogen.
Dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL, dicukupkan sampai garis tanda.
3.10.3 Induksi Stres Kronis Ringan
Induksi stres dilakukan sesuai dengan metode yang dilakukan Pamilutsih (2017) dengan beberapa modifikasi. Setiap kelompok hewan uji diberikan paparan stres selama 14 hari dengan 1-2 macam stressor. Paparan stres sesuai Tabel 3.1.
Tabel 3.1 Rancangan paparan stres.
Perlakuan Stres Hari ke-
1 2 3 4 5 6 7