Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari 2015 sampai dengan selesai.
Tahap persiapan dilaksanakan pada awal bulan Januari 2015 bertempat di Laboratorium Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan.
Selanjutnya tahap pelaksanaan penelitian dilakukan selama lima minggu di kandang percobaan Laboratorium Biologi Ternak Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara Medan dan Laboratorium Parasitologi Balai Veteriner Medan.
Bahan dan Alat Penelitian Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian antara lain ayam pedaging umur 1 hari (DOC) Strain Cobb 500 sebanyak 80 ekor yang berasal dari PT. Charoen Pokphand Jaya Farm, pakan selama penelitian, Rodalon, Formalin, Etanol, Methanol, Kalium Bikromat 2-2,5%, Larutan garam jenuh, Larutan gula jenuh, Vaksin ND Strain Hitchner B1 dan vaksin IBD (Gumboro), Jahe Merah (Zingiber officinale var Rubra), Isolat Eimeria tenella, Koksidiostat, Larutan CMC (Carboxyl Methyl Cellulosa), Oil Emersi, Larutan Giemsa 10-20%, Air kran bersih / Aquades, dan gula merah.
Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain gunting seksi, scalpel, sarung tangan (gloves), termos es, lumpang porselin (mortar), penapis / saringan, nampan besar dan kecil, pisau, timbangan analitik (digital), kantong
plastik, gelas ukur, pipet pasteur, mesin penggiling, oven, sentrifuge, tabung sentrifuge, alat suntik (spuit), obyek glass, cover glass, cawan petridis, pot salep, mikroskop, lemari es, alat hitung, kamar hitung (Mc Master), kertas label, spidol, tissu, labu dan tabung evaporator, rotaryvacum evaporator, termometer untuk mengetahui suhu kandang, terpal plastik, sekam, kandang percobaan dengan ukuran 1m x 1m x 1m sebanyak 20 buah, tempat pakan dan minum ayam sebanyak 20 buah, dan bola lampu pijar (60 Watt) sebanyak 20 buah sebagai penerang dan pemanas.
Metode Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang terdiri dari 5 perlakuan dan 4 ulangan. Perlakuan yang diteliti adalah:
KP : Ayam yang diinfeksi E.tenella dengan dosis 104 ookista/ekor, tapi tidak diberi koksidiostat dan jahe merah
KO : Ayam yang diinfeksi E.tenella dengan dosis 104 ookista/ekor, dan hanya diberi koksidiostat
K1 : Ayam yang diinfeksi E.tenella dengan dosis 104 ookista/ekor dan larutan Jahe merah (serbuk) dengan konsentrasi 1%
K2 : Ayam yang diinfeksi E.tenella dengan dosis 104 ookista/ekor dan larutan Jahe merah (diekstraksi menggunakan ethanol) dengan konsentrasi 1%
K3 : Ayam yang diinfeksi E.tenella dengan dosis 104 ookista/ekor dan larutan Jahe merah (diekstraksi menggunakan air) dengan konsentrasi 1%
Tabel 7. Kombinasi perlakuan adalah sebagai berikut :
Dengan menggunakan 80 ekor ayam, maka masing-masing kombinasi perlakuan terdiri dari 4 ekor ayam. Adapun metode linear yang digunakan menurut Hanafiah (2000) adalah:
Dimana:
Yij = hasil pengamatan dari perlakuan tingkat ke-i dan pada ulangan ke-j I = perlakuan
J = ulangan
= nilai rata-rata (mean) harapan
i = pengaruh perlakuan ke-i
ij = pengaruh galat (experimental error) perlakuan ke-i dan ulangan ke-j Parameter Penelitian
Jumlah ookista Eimeria tenella pada feces ayam
Penghitungan ookista dilakukan dengan menggunakan kamar hitung Mc Master dengan rumus sebagai berikut :
OPG (N) = Ookista hasil pengamatan x 100 2
Keterangan : OPG = Ookista Per Gram
Yij = + i+ ij
Jumlah lesi yang disebabkan Eimeria tenella pada sekum ayam (SLS)
Skor Lesi Sekum (SLS) ditentukan berdasarkan perubahan patologi-anatomi berupa derajat kerusakan dari sekum ayam yang terinfeksi menurut metoda Johson and Reid (1970) yaitu dengan pemberian scoring 0 sampai dengan +4 seperti berikut ini :
0 = Tidak didapatkan luka dalam dinding usus
+1 = Pada dinding usus didapatkan beberapa ptechie, tebal dinding usus dan isi usus (feses) normal
+2 = Didapatkan banyak luka (ptechie) pada dinding usus, isi usus bercampur dengan darah, dan dinding usus, sedikit menebal
+3 = Banyak darah yang telah membeku atau setengah membeku didalam, dinding usus sangat menebal, feses sedikit atau sama sekali tidak didapatkan
+4 = Usus sangat membesar, isi usus terdiri dari darah yang telah membeku atau telah mulai proses perkapuran, sedangkan isi usus yang berupa feses sedikit. ayam mati karena koksidiosis juga dinilai +4.
Differensiasi leukosit pada sampel darah ayam
Dalam satu preparat ulas darah dihitung 100 Leukosit dan dibedakan jenis-jenisnya kemudian dihitung persentasenya.
Pelaksanaan Penelitian Isolasi Eimeria tenella
Sekum ayam yang terpapar koksidiosis dikoleksi dari lapangan (dari peternakan ayam di kota Medan) dan diproses dilaboratorium dengan cara sebagai
lumpang porselin (mortar), diberi aquades steril secukupnya kemudian digerus dan dihaluskan secara perlahan-lahan agar tidak merusak ookista. Kemudian disaring dengan saringan 25 μm. Hasil saringan diberi larutan gula jenuh, kemudian disentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm selama 5-10 menit untuk diperiksa ookistanya berdasarkan morfologi, ukuran, masa sporulasi lalu diisolasi (Levine, 1985).
Pembiakan Isolat Eimeria tenella
Setelah mendapat isolat E. tenella, kemudian disporulasikan dengan penambahan larutan kalium bikromat 2-2,5% 5-10 kali dari sampel (tidak diperkenankan kedalaman larutan lebih dari 4cm) selama 1-2 hari dalam suhu kamar (260C – 280C). Tutup cawan Petridis/ gelas dengan sedikit terbuka untuk memberikan kesempatan udara masuk. Untuk perbanyakan, isolat E.tenella diinokulasikan pada ayam umur 2 minggu yang bebas koksidia, 6 hari pasca inokulasi dipanen seperti cara kerja sebelumnya kemudian disimpan dalam lemari es sampai digunakan.
Pembuatan Larutan Jahe Merah
Dalam pembuatan larutan jahe merah, penelitian ini menggunakan 3 macam pengolahan jahe yang nantinya akan digunakan sebagai larutan. Adapun bentuk pengolahan jahe yang dimaksud adalah serbuk jahe, ekstrak jahe menggunakan ethanol, dan ekstrak jahe menggunakan air.
Serbuk Jahe
Jahe merah diperoleh dari Pasar kota Medan. Jahe merah segar dicuci kemudian disayat tipis-tipis dan dikeringkan dalam oven pada temperatur 370C
selama 48 jam sampai kering, lalu dibuat serbuk dengan cara digiling (Iskandar et al, 2000). Larutan dibuat dengan cara yang tertera dalam Farmakope Indonesia, sehingga diperoleh larutan dengan kepekatan 1 gr serbuk kering dalam 1 ml (Depkes.RI. 1979 dikutip dari Iskandar et al, 2000). Larutan pekat tadi akan diencerkan kembali dengan air menjadi 100 ml, sehingga konsentrasi 1% dari larutan jahe tersebut nantinya akan mengandung 10 mg jahe /ml.
a. Ekstraksi Jahe Menggunakan Ethanol
Rimpang jahe merah segar yang sudah dibersihkan dikeringkan dengan oven blower (40-60o C) selama 30-36 jam hingga diperoleh jahe kering dengan kadar air 8-11%. Jahe kering digiling kemudian disaring sehingga dihasilkan bubuk jahe berukuran 30 mesh. Sebanyak 250 gram bubuk jahe di ekstrak 4 kali dengan menggunakan pelarut etanol (500 ml). Ekstrak yang diperoleh disaring dengan kertas saring pada kondisi vakum. Cairan yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabung rotavapor yang telah ditimbang, kemudian disuling dengan rotaryvacum-evaporator. Penyulingan dihentikan setelah pelarut berhenti menetes, maka didapatkan oleoresin yang konsistensinya semi padat berwarna coklat muda sampai dengan coklat tua. Selanjutnya dilakukan penimbangan terhadap oleoresin yang dihasilkan dalam labu rotavapor. Untuk menghomogenkan hasil ekstrak jahe dengan air pada saat pembuatan larutan perlu penambahan larutan CMC (Carboxyl Methyl Cellulosa) 1%. Perbandingan dosis serbuk dengan hasil ekstrak adalah 1 : 5. Sehingga Larutan ekstrak jahe merah menggunakan ethanol dibuat dengan konsentrasi 1% ( 2mg jahe/ ml).
b. Ekstraksi Jahe Menggunakan Air
Ekstraksi jahe merah menggunakan air sebagai larutan pengekstrak.
Ekstraksi jahe dilakukan terhadap bubuk jahe. Setiap 25 gr bubuk jahe membutuhkan 125 ml air. Ekstraksi dilakukan sebanyak 4 kali. Untuk memperoleh ekstrak jahe, filtrat dikeringbekukan sehingga pelarut dan air yang ada menguap. Larutan ekstrak jahe merah menggunakan air dibuat dengan konsentrasi 1% (2mg jahe/ml).
Gambar 4. Ekstraksi Jahe
Kandang terlebih dahulu didesinfeksi dengan menggunakan rodalon, kemudian dilakukan fumigasi dengan menggunakan formalin dan dibiarkan
Rimpang jahe
Ekstrak air-jahe bubuk Fraksi terlarut etanol
Penguapan pelarut s/d konstan
Ekstrak ethanol
selama tiga hari. Peralatan kandang dibersihkan dan didesinfeksi sebelum digunakan (Siagian, 2009).
Uji In Vivo
Pada penelitian ini menggunakan 80 ekor anak ayam pedaging umur satu hari (DOC) Strain Cobb 500 yang diacak ke dalam 5 perlakuan (KP, KO, K1, K2, K3) dengan 4 ulangan, dan masing-masing ulangan terdiri atas 4 ekor.
Sebelum DOC dimasukkan kedalam kandang sesuai dengan perlakuan, dilakukan penimbangan untuk mengetahui bobot badan awal dari masing-masing DOC kemudian dilakukan random (pengacakan) pada DOC yang bertujuan memperkecil nilai keragaman. Lalu DOC dimasukkan sebanyak 4 ekor per kandang.
Kandang terbuat dari kayu berukuran 1m x 1m x 1m dengan lantai diberi sekam padi kering (umur 1 hari -14 hari ), dilengkapi dengan tempat pakan dan minum serta dilengkapi dengan 1 buah lampu pijar berkekuatan 60 Watt untuk masing - masing kandang.
Sebagai pencegahan terhadap penyakit Tetelo (New Castle Disease) diberikan vaksinasi ND Strain Hitchner B1 yang dilakukan melalui tetes mata pada ayam umur empat hari, kemudian vaksinasi IBD (Gumboro) pada umur 12 hari melalui air minum, dan selanjutnya pengulangan vaksinasi ND Strain Lasota pada umur tiga minggu melalui tetes mata.
Pada umur 23 hari, lima perlakuan ayam (KP,KO,K1,K2,K3) diinfeksi dengan Eimeria tenella masing-masing sebanyak 10.000 ookista/ekor per oral.
Lima (5) hari pasca diinfeksi Eimeria tenella, diberikan perlakuan berupa larutan jahe sebanyak 1ml/ekor per oral (K1, K2, K3), dan aquadest (KP) selama 3 hari,
istirahat (tidak diberi) 2 hari, lalu diberi kembali selama 3 hari (sistem 3-2-3), begitu juga dengan pemberian koksidiostat Coxymas (sesuai petunjuk dari PT.Mensana).
Penentuan Jumlah Ookista per Gram Ekskreta
Enam (6) hari pasca diinfeksi Eimeria tenella, ekskreta ayam ditampung setiap hari. Pada masing – masing perlakuan diambil ekskreta sebanyak 2 sampel perkandang, kemudian dikoleksi dan dipisahkan berdasarkan perlakuan masing-masing selama 1 minggu. Ekskreta ditimbang sebanyak 1 gram yang kemudian dilarutkan ke dalam 29 ml larutan garam jenuh, disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 1500 rpm. Setelah disentrifuge, bagian atas supernatan (bening) diambil menggunakan pipet Pasteur kemudian diteteskan pada kedua sisi kamar hitung Mc Master. Selanjutnya diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 x10 (Alamsari, 2000). Jumlah ookista yang ditemukan dalam sepuluh lapangan pandang kemudian dihitung, dijumlahkan, lalu dirata-rata.
Penghitungan ookista dilakukan dengan menggunakan kamar hitung Mc Master dengan rumus sebagai berikut :
OPG (N) = Ookista hasil pengamatan x 100 2
Keterangan : OPG = Ookista Per Gram
Penentuan SLS (Skor Lesi Sekum)
Skor lesi sekum (SLS) ditentukan berdasar perubahan patologi-anatomi berupa derajat kerusakan dari sekum ayam yang terinfeksi menurut metoda Johson and Reid (1970). Hari ke-13 pasca infeksi Eimeria tenella, semua
ditandai dengan adanya perdarahan yang hebat, penebalan dinding sekum dan nekrotik. Sebaran nilainya berkisar antara 0-4, dimana nilai skor 0 untuk keadaan normal dan skor 4 untuk kerusakan sekum yang parah sesuai dengan metode Johnson dan Reid (1970). Penentuan nilai perlukaan sekum dan produksi ookista hanya dilakukan oleh satu orang untuk menghindari bias.
Pemeriksaan Differensiasi Leukosit a. Pengambilan Sampel Darah
Pengambilan sampel darah dilakukan sebanyak 3 kali, yaitu pada ayam umur 27 hari, 30 hari, dan 35 hari, dan pada masing-masing perlakuan diambil 2 sampel perkandang. Pengambilan darah dilakukan pada Vena brachialis.
b. Cara Pembuatan Ulas Darah Tipis
Gelas obyek 1 ditetesi darah sampel, kemudian ujung gelas obyek 2 disentuhkan ke preparat darah pada gelas obyek 1 dan dibiarkan mengalir melalui ruang kapiler dari gelas obyek 2. Posisi antara kedua gelas obyek membentuk sudut 450. Dengan segera gelas obyek 2 digeser dengan gerakan langsung dan dihindari penekanan yang berlebihan. Setelah itu preparat difiksasi dengan methanol lalu diwarnai dengan Giemsa 10% (Piatina, 2001).
c. Pemeriksaan Sampel Darah
Preparat ulas darah tipis diperiksa dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 x100 menggunakan minyak emersi. Dalam satu preparat dihitung 100 Leukosit dan dibedakan jenis-jenisnya (diferensiasi dari leukosit tersebut kemudian dihitung persentasenya) (Piatina, 2001).
Prosedur Kerja