Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni sampai Juli 2011 bertempat di Laboratorium Helmintologi Bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan, serta Laboratorium Terpadu, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Metode
1. Koleksi Serum Contoh
Tahap koleksi serum contoh dalam penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2009 sampai Juni 2011. Tahap koleksi ini dilaksanakan oleh tim peneliti mahasiswa Pascasarjana Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner, Institut Pertanian Bogor. Serum contoh yang dikoleksi diambil secara purposif yaitu berasal dari babi yang diizinkan oleh pemiliknya untuk diambil darahnya dan dipelihara secara diumbar.
Dalam penelitian ini diperiksa sebanyak 39 serum contoh yang terdiri atas 26 serum yang dikoleksi pada tahun 2009 dan 13 serum pada tahun 2010. Serum tersebut diperoleh dari babi asal Distrik Assologaima dan Wamena Kota (Tabel 1). Babi tersebut terdiri atas 18 ekor jantan dan 21 ekor betina. Serum kontrol positif yang digunakan dalam penelitian ini dikoleksi dari babi yang dalam pemeriksaan postmortem ditemukan adanya sistiserkus dalam dagingnya. Babi tersebut berasal dari peternakan rakyat di Kabupaten Jayawijaya. Serum kontrol negatif yang digunakan dalam penelitian ini dikoleksi dari babi yang berasal dari peternakan di Jawa Tengah.
Pembuatan serum dilakukan dengan cara mengambil darah babi melalui vena jugularis menggunakan spuit 5 mL. Darah yang telah diambil tersebut selanjutnya diinkubasi dalam suhu ruang selama satu jam dengan posisi mendatar. Darah tersebut kemudian diinkubasikan kembali selama 24 jam dalam suhu 4 °C. Serum yang terbentuk selanjutnya dipanen dengan meletakkannya dalam tabung
mikro berukuran 1.5 mL. Penyimpanan serum dilakukan dalam suhu -18 °C hingga akan digunakan.
Tabel 1 Daerah asal dan jumlah babi yang dilakukan pemeriksaan serologis
2. Protokol ELISA
Penelitian ini dilakukan dengan metode sandwich ELISA untuk mendeteksi Cysticercus cellulosae yang dikembangkan oleh Institute of Tropical Medicine Antwerpen, Belgia (ITM 2009). Metode ini menggunakan antibodi monoklonal sebagai bahan pendeteksi keberadaan antigen Cysticercus cellulosae dalam serum contoh. Tingkat spesifitas dari metode ini adalah 98.7% dan tingkat sensitifitasnya adalah 92.3% (Van Kerckhoven et al. 1998, diacu dalam Dorny el al. 2000). Metode ini terdiri dari delapan tahap, yaitu pre-treatment serum, coating sumuran cawan, blocking, peletakan serum contoh (sampel), pemberian antibodi pendeteksi, konjugat, substrat, stop solution, dan pembacaan nilai absorbansi.
Pre-treatmentserum dilakukan dengan mencampurkan 75 µL serum dan 75 µL larutan TCA (tricloroacetic acid 5% dalam akuabides) dalam tabung mikro. Campuran tersebut dikocok menggunakan vortex dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu ruang. Setelah diinkubasi, campuran tersebut kembali dikocok menggunakan vortex dan disentrifus selama sembilan menit dalam kecepatan 12 000 g. Supernatan yang diperoleh selanjutnya diambil menggunakan pipet mikro dan dicampurkan dengan larutan karbonat/bikarbonat pH 10 sebanyak 75 µL di dalam tabung mikro. Campuran tersebut kemudian disimpan dalam suhu 4 °C sampai akan digunakan. Setelah tahap pre-treatment dilakukan, selanjutnya dilakukan pembuatan pola peletakan sampel.
No. Daerah asal (Distrik) Jumlah (ekor)
Jenis Kelamin
Jantan Betina Tidak diketahui
1. Assologaima 22 7 15 -
2. Wamena Kota 17 11 6 -
Coating dilakukan dengan melapisi sumuran cawan dengan antibodi penangkap dalam konsentrasi 5 µg/mL coating buffer karbonat/bikarbonat pH 9.8. Antibodi penangkap yang digunakan dalam penelitian ini berupa antibodi monoklonal anti Taenia saginata (kode produksi: B158C11A10) hasil produksi Institute of Tropicaledicine Antwerpen, Belgia. Antibodi penangkap sebanyak 100 µL dimasukkan ke dalam masing-masing sumur kecuali sumur A1 dan B1. Sumur A1 dan B1 merupakan sumur kontrol untuk substrat buffer, kedua sumur ini hanya diisi dengan 100 µL coatingbuffer. Inkubasi dilakukan di dalam shaker inkubator selama 30 menit pada suhu 37 °C. Setelah inkubasi selesai, dilakukan pencucian dengan PBS Tween-20 0.05% (buffer pencuci) sebanyak satu kali menggunakan pipet mikro multi channel.
Blocking dilakukan dengan tujuan untuk menutup permukaan sumur yang tidak dilekati oleh antibodi penangkap. Tahap ini dilakukan dengan cara memasukkan 100 µL larutan blocking berupa New Born Calf Serum 1% di dalam buffer pencuci pada setiap sumur. Cawan tersebut diinkubasi dalam shaker inkubator selama 15 menit pada suhu 37 °C.
Pemasukan sampel dilakukan dengan memasukkan serum contoh yang telah dipre-treatment sebanyak 100 µ L ke dalam masing-masing sumur sesuai dengan pola. Cawan tersebut diinkubasi dalam shaker inkubator pada suhu 37 °C selama 15 menit. Tiap-tiap sumur dalam cawan kemudian dicuci sebanyak lima kali menggunakan buffer pencuci.
Pemberian antibodi pendeteksi. Antibodi pendeteksi yang digunakan dalam penelitian ini berupa antibodi monoklonal anti Taenia saginata yang telah dikonjugasikan dengan biotin (kode produksi: B158C11A10) produksi Institute of Tropical Medicine Antwerpen, Belgia. Sebanyak 100 µL antibodi pendeteksi dengan konsentrasi 1.25 µg/ mL larutan blocking dimasukkan ke dalam setiap sumur kecuali sumur A1 dan B1. Sumur A1 dan B1 hanya diisi dengan larutan blocking sebanyak 100 µL. Selanjutnya cawan tersebut diinkubasikan di dalam shaker inkubator pada suhu 37 °C selama 15 menit. Pencucian dilakukan sebanyak lima kali dengan buffer pencuci setelah inkubasi selesai.
Pemberian konjugat. Konjugat yang digunakan berupa streptavidin (1/10000 µl larutan blocking) sebanyak 100 µL pada semua sumur kecuali sumur
A1 dan B1. Kedua sumur ini diisi dengan 100 µL larutan blocking. Cawan tersebut diinkubasikan dalam shaker inkubator selama 15 menit pada suhu 37 °C. Selanjutnya dilakukan pencucian sebanyak lima kali dengan buffer pencuci.
Pemberian substrat. Substrat yang digunakan berupa ortho phenil diamine (OPD)yang dibuat dengan cara melarutkan 1 tablet OPD dalam 10 mL akuabides dengan ditambahkan H2O2 sebanyak 2.5 µL. Tahap ini dilakukan dengan cara
meletakkan 100 µL substrat ke dalam setiap sumur dan dilaksanakan dalam kondisi ruangan gelap. Cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30 °C selama 15 menit di dalam inkubator.
Pemberian stop solution. Tujuan dari tahap ini adalah untuk menghentikan reaksi pada sumur. Larutan stop solution yang digunakan berupa asam kuat yaitu H2SO4. Tahap ini dilakukan dengan cara menambahkan 50 µL larutan stop
solution pada setiap sumur.
Pembacaan nilai absorbansi dilakukan dengan menggunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 492 nm dan 655 nm. Penghitungan rataan nilai absorbansi dari masing-masing serum contoh dilakukan setelah diperoleh data nilai absorbansi dari hasil pembacaan. Penentuan nilai cut off didapatkan dari hasil perhitungan nilai t-student dari kontrol negatif (Sokal & Rohlf1981).
Status serum contoh ditentukan berdasarkan rasio dari rata-rata nilai absorbansi (OD) terhadap nilai cut off. Serum dinyatakan positif mengandung antigen sisrkulasi Cysticercus cellulosae bila nilai rasio antara rataan nilai absorbansinya dengan cut off bernilai lebih besar dari 1. Serum dinyatakan negatif mengandung antigen sirkulasi Cysticercus cellulosae bila nilai rasio antara rataan nilai absorbansinya dengan cut off bernilai kurang dari 1. Serum positif menandakan bahwa di dalam serum tersebut mengandung antigen Cysticercus cellulosae. Sedangkan serum negatif menandakan bahwa serum tersebut tidak mengandung antigen Cysticercus cellulosae. Data hasil pemeriksaan ELISA selanjutnya dianalisis menggunakan metode deskiptif.