Penelitian pemekatan karotenoid pada metil ester kasar (crude methyl ester) terdiri dari tiga tahap yaitu: (1) Persiapan dan karakterisasi bahan baku; (2) Optimasi proses produksi metil ester kasar (crude methyl ester) dengan kandungan karotenoid tinggi; dan (3) Optimasi proses pemekatan karotenoid pada metil ester kasar (crude methyl ester) dengan metode kolom kromatografi adsorpsi. Tahap persiapan bahan baku terdiri dari karakterisasi bahan baku CPO dan pengabuan sekam padi dalam tanur. Tahap optimasi proses produksi crude methyl ester (CME) terdiri dari tahap optimasi proses dengan perlakuan kecepatan pengadukan serta optimasi proses dengan kombinasi tiga perlakuan (konsentrasi NaOH, waktu reaksi dan suhu reaksi). Sedangkan tahap optimasi pemekatan karotenoid terdiri dari tahap optimasi proses dengan perlakuan nisbah adsorben abu sekam padi dan silika gel serta tahap optimasi proses dengan perlakuan jumlah sampel yang dilewatkan dalam kolom kromatografi. Diagram alir penelitian ini disajikan pada Gambar 6.
Gambar 6. Diagram alir penelitian optimasi pemekatan karotenoid dari minyak sawit kasar skala laboratorium
1. Persiapan dan Karakterisasi Bahan Baku
Bahan baku CPO yang digunakan mula-mula dianalisis untuk mengetahui kadar air, kadar asam lemak bebas, konsentrasi karotenoid serta komposisi asam lemaknya. Sedangkan abu sekam padi dibuat dengan cara mengabukan sekam padi dalam tanur pada suhu 1200oC yang selanjutnya diayak menggunakan saringan ukuran 60 mesh agar didapatkan abu sekam yang halus dan bebas kotoran. Diagram alir persiapan bahan abu sekam padi disajikan pada Gambar 7.
Produksi CME
CME berkaroten tinggi
Pembuatan Konsentrat Karotenoid
Analisis Kuantitatif dan Kualitatif Optimasi produksi CME
Optimasi pemekatan karotenoid pada CME dengan kolom kromatografi
Konsentrat karotenoid Persiapan dan karakterisasi
Sekam padi ↓ Pengabuan suhu 1200oC ↓ Pengayakan ↓
Abu sekam padi berukuran 60-100 mesh ↓
Pengaktifan kembali pada suhu 100oC selama dua jam ↓
Abu sekam padi yang siap digunakan
Gambar 7. Diagram alir persiapan bahan abu sekam padi
2. Optimasi Produksi Metil Ester Kasar (Crude Methyl Ester)
Metanolisis CPO dilakukan berdasarkan metode Ooi et al. (1994) dengan menggunakan katalis NaOH dalam metanol seperti tertera pada Gambar 8. Penentuan kondisi optimum proses produksi CME dilakukan dengan penerapan dua tahap optimasi. Tahap pertama yaitu optimasi proses dengan perlakuan kecepatan pengadukan, sedangkan tahap kedua yaitu optimasi proses dengan kombinasi tiga perlakuan (konsentrasi NaOH, waktu reaksi dan suhu reaksi).
CPO ↓ Erlenmeyer bertutup ↓ Penyemprotan N2 head ↓ Orbital thermoshaker ↓ Pendinginan ↓ Sentrifuge ↓
Pencucian dengan akuades ↓
Sentrifuge
↓
Metil ester sawit
Gambar 8. Proses produksi metil ester (Ooi et al., 1994) Metanol + NaOH
a. Penentuan kecepatan pengadukan optimum
Reaksi transesterifikasi terjadi antara minyak (CPO) dengan metanol. Proses ini dipengaruhi oleh kecepatan pengadukan saat reaksi terjadi. Kecepatan pengadukan yang menghasilkan CME dengan tingkat ester dan konsentrasi karotenoid yang tinggi diseleksi melalui penerapan empat tingkatan kecepatan yaitu 150, 200, 250 dan 300 putaran per menit (rotation per minute/rpm). Proses transesterifikasi dilakukan pada temperatur 60oC selama 1 jam dalam orbital thermoshaker dengan nisbah CPO/metanol 1:10 (mol/mol) serta konsentrasi NaOH 1% (b/b CPO). Setelah reaksi selesai, campuran reaksi di-sentrifuge sehingga terbentuk dua lapisan. Lapisan atas berwarna merupakan fase ester dengan karotenoid di dalamnya dan lapisan bawah tak berwarna adalah fase air dan gliserol. Lapisan atas dicuci dengan air dan dipisahkan dengan sentrifuge, kemudian dilihat penampakan hasil dan pemisahan lapisannya secara kualitatif serta dianalisis tingkat ester dan kandungan total karotennya.
b. Penentuan konsentrasi NaOH, waktu reaksi dan suhu reaksi optimum
Reaksi transesterifikasi dapat terjadi dengan adanya katalis, baik berupa asam ataupun basa. Katalis yang digunakan dalam penelitian adalah natrium hidroksida (NaOH). Di samping itu, reaksi transesterifikasi dapat berlangsung dengan baik pada suhu dan waktu reaksi tertentu. Ketiga faktor ini dikombinasikan sebagai perlakuan optimasi proses produksi CME.
Kombinasi perlakuan konsentrasi NaOH, waktu reaksi dan suhu reaksi yang menghasilkan metil ester kasar dengan tingkat ester dan konsentrasi karotenoid tinggi diseleksi melalui penerapan tiga tingkatan konsentrasi NaOH, waktu reaksi dan suhu reaksi. Konsentrasi NaOH yang diterapkan yaitu 1%, 1.5%, dan 2%. Waktu reaksi yang diterapkan yaitu 60, 90, dan 120 menit, sedangkan suhu reaksi yang diterapkan yaitu 40, 50 dan 60oC. Perbandingan CPO/metanol yang digunakan dalam
reaksi adalah 1: 10 (mol/mol). Kecepatan pengadukan yang digunakan adalah kecepatan pengadukan optimum yang terpilih pada tahap sebelumnya. Metil ester yang terbentuk kemudian dianalisis tingkat ester dan kandungan total karotennya.
3. Pemekatan Karotenoid pada CME
Pemisahan karotenoid pada CME dilakukan dengan menggunakan kolom kromatografi. Bahan penjerap yang digunakan yaitu abu sekam padi dan silika gel. Kolom yang digunakan berdiameter 2.0 cm dan tinggi 40 cm. Setiap kolom diisi dengan bahan penjerap yang telah diaktifkan (dipanaskan dalam oven pada suhu 100oC selama lebih dari 2 jam) sebanyak 40 g dan dicampur dengan pelarut yang digunakan sebagai eluen untuk mengelusi contoh. Eluen yang digunakan yaitu heksana. Diagram alir pemekatan karotenoid pada CME menggunakan kolom kromatografi dapat dilihat pada Gambar 9.
Persiapan kolom kromatografi ↓
Pengisian kolom dengan bahan penjerap ↓
Pelarutan sampel dalam eluen ↓
Pengisian sampel ke dalam kolom ↓
Penyerapan sampel dalam bahan penjerap ↓
Pengelusian menggunakan heksana ↓
Penampungan fraksi eluat yang berwarna ↓
Penghitungan konsentrasi karotenoid dari setiap fraksi menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 446 nm
↓
Penguapan pelarut dengan rotavapor dan penyemprotan N2
↓
Konsentrat karotenoid
Gambar 9. Diagram alir pemekatan karotenoid pada CME menggunakan kolom kromatografi
Penentuan kondisi optimum proses produksi konsentrat karotenoid dilakukan dengan penerapan dua tahap optimasi. Tahap pertama yaitu optimasi proses dengan perlakuan nisbah abu sekam padi dan silika gel (b/b), sedangkan tahap kedua yaitu optimasi proses dengan perlakuan jumlah sampel yang dilewatkan dalam kolom.
a. Penentuan nisbah abu sekam padi/silika gel optimum
Abu sekam padi sebagai adsorben bersifat kurang menjerap karotenoid dan mudah melepaskannya kembali. Sedangkan silika gel memiliki kemampuan adsorpsi terhadap senyawa karotenoid yang tinggi tetapi kemampuan desorpsinya rendah (Masni, 2004). Berdasarkan hal tersebut, maka dilakukan pencampuran abu sekam padi dan silika gel sebagai adsorben dalam kromatografi kolom dengan harapan kelemahan dari masing-masing adsorben tersebut dapat tertutupi oleh kelebihan masing-masing adsorben. Nisbah abu sekam/silika gel yang menghasilkan konsentrat dengan konsentrasi karotenoid dan tingkat pemekatan yang tinggi diseleksi melalui penerapan tiga tingkatan nisbah abu sekam padi/silika gel yaitu 35:5, 30:10, dan 25:15 (b/b). Pada proses kromatografi, sampel yang telah dilarutkan dalam eluen dimasukkan ke dalam kolom, dibiarkan terserap dalam penjerap, kemudian dielusi dengan bahan pengelusi yaitu heksana. Jumlah ekstrak yang dilewatkan dalam kolom yaitu sebanyak 1 g. Cairan yang keluar dari kolom ditampung per fraksi sampai eluat yang keluar tidak berwarna lagi dengan volume setiap fraksi adalah 3 ml (Hasanah, 2006).
Konsentrasi karotenoid dari setiap fraksi ditentukan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 446 nm. Fraksi yang menunjukkan konsentrasi karotenoid yang tinggi disatukan dalam satu tabung reaksi baru, diuapkan pelarutnya dengan jalan dihembus menggunakan gas nitrogen dan kemudian ditentukan konsentrasi karotenoidnya.
b. Penentuan jumlah sampel yang dilewatkan dalam kolom optimum
Jumlah sampel yang dilewatkan dalam kolom yang menghasilkan konsentrat dengan konsentrasi karotenoid dan tingkat pemekatan yang tinggi diseleksi melalui penerapan empat tingkatan jumlah sampel yaitu 1, 2, 3, dan 4 g. Nisbah abu sekam/silika gel yang digunakan adalah nisbah abu sekam/silika gel optimum yang terpilih pada tahap sebelumnya. Produk konsentrat karotenoid selanjutnya dikarakterisasi, mencakup analisis konsentrasi karotenoid, kadar ester dan komposisi asam lemak.