1. Analisis Kandungan Karotenoid, Metode Spektrofotometri (Parker, 1992)
Sampel sebanyak 0.5 g didispersikan dalam 6 ml KOH 5% dalam metanol di dalam tabung reaksi bertutup. Headspace diisi dengan gas nitrogen, kemudian disaponifikasi pada temperatur 60-70oC selama 1 jam di dalam penangas air dengan kondisi gelap. Setiap 10 menit dikocok dengan vortex. Setelah itu didinginkan dan ditambahkan 2 ml air bebas ion dan 6 ml heksana. Headspace diisi nitrogen, ditutup dan dikocok selama 1 menit. Kemudian di- sentrifuge, larutan bagian atas dipindahkan ke tabung reaksi yang bersih. Bagian bawah hasil ekstrak pertama diekstrak ulang dengan 6 ml heksana, di- sentrifuge dan lapisan atas ditambahkan ke ekstrak pertama.
Selanjutnya kumpulan ekstrak ditambahkan 3 ml asam asetat 5% (di dalam air) dan headspace diisi gas nitrogen, ditutup dan dikocok selama 3 menit, di- sentrifuge dan lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung reaksi bersih dan dievaporasi vakum pada suhu 40oC dan kemudian hasil ekstrak ditimbang. Selanjutnya hasil ekstrak dilarutkan dengan 3 ml pelarut asetonitril:metanol:diklorometana (75:20:5) dan diukur absorbansinya pada = 450 nm dengan spektrofotometer. Kandungan total karotenoid dalam sampel dihitung dengan menggunakan nilai E1% (1 cm) untuk β-karoten = 2600 yaitu absorbansi dari 1% larutan β-karoten (10 mg/ml atau μg/μl) pada
panjang gelombang 450 nm menggunakan kuvet 1 cm. Skema analisis konsentrasi karotenoid disajikan pada Gambar 10. Perhitungan:
[karotenoid] = 2600 10 x A x fp x B V
Keterangan : [karotenoid] = konsentrasi karotenoid sampel (μg/g) A = absorbansi pada panjang gelombang 450 nm fp = faktor pengenceran
V = volume sampel yang diukur (μl) B = bobot sampel yang dianalisis (g)
Gambar 10. Skema analisis konsentrasi karotenoid (Parker, 1992) 0.5 g sampel + 6 ml KOH 5%
dalam metanol, kocok, N2head
saponifikasi, water bath 60oC, 1 jam, kocok setiap 10 menit
ditambahkan 2 ml akuades, kocok
ditambahkan 6 ml heksana, kocok
Lapisan bawah Lapisan atas
ditambahkan 6 ml heksana
N2, kocok ditambahkan 3 ml as. asetat 5%, N2, kocok
Lapisan atas rotavapor
Lapisan bawah dibuang
Analisis Spektofotometer
(3 ml asetonitril:metanol:diklorometan 75:20:5) ekstrak
2. Penetapan Komposisi Asam Lemak, Metode Kromatografi Gas (AOAC, 1995)
Contoh yang akan dianalisis asam lemaknya ditimbang dalam tabung reaksi bertutup, kemudian ditambahkan larutan standar internal 1.0 mg/ml sebanyak 0.5 ml. Campuran tersebut selanjutnya ditambahkan 1.5 ml NaOH metanolik 0.5 N, dihembus dengan gas nitrogen, ditutup rapat, kemudian dikocok. Campuran ini selanjutnya dipanaskan dalam penangas air yang mendidih (suhu air sekitar 100oC) selama 5 menit, diikuti dengan pendinginan sampai suhu campuran berada pada kisaran suhu 30-40oC. pereaksi BF3-metanol 14% (b/v) segera ditambahkan ke dalam campuran, dialiri gas nitrogen dan ditutup rapat, kemudian dipanaskan kembali dalam penangas air mendidih selama 30 menit. Campuran didinginkan kemudian ditambahkan 1 ml heksana, dialiri gas nitrogen, ditutup rapat dan dikocok selama 30 detik. Campuran yang dihasilkan selanjutnya ditambahkan 5 ml larutan NaCl jenuh, dihembus gas nitrogen, ditutup rapat dan dikocok. Lapisan heksana dipindahkan ke dalam vial, fase metanol-air diekstrak kembali dengan 1 ml heksana dan hasil ekstraksi digabungkan serta disaring dengan Na2SO4 anhidrat dan telah dipekatkan dengan gas nitrogen sampai diperoleh volume sekitar 1 ml.
Metil ester asam lemak yang telah dibebaskan dari kandungan air dengan Na2SO4 anhidrat dan telah dipekatkan dengan gas nitrogen, sebanyak 1 μl disuntikkan ke alat kromatografi gas. Alat kromatografi dilengkapi dengan detektor FID, integrator chromatopac C-R6 dan kolom kapiler DB- 23 (30 m x 0.25 mm: J & W Scientific, Folson, CA). Suhu injektor diatur 250oC dan suhu detektornya 260oC. Suhu awal kolom 140oC dipertahankan selama 6 menit dengan laju kenaikan suhu 30oC/menit. Suhu akhir kolom diatur 230oC dan dipertahankan selama 25 menit. Gas pembawa yang digunakan adalah gas helium dengan tekanan 1 kg/cm2 dan dilengkapi dengan detektor FID. Tekanan gas hidrogen dan tekanan udara diatur sampai 0.5 kg/cm2. Kromatogram yang diperoleh digunakan untuk menentukan persentase komposisi asam lemak menggunakan persamaan :
a. Penentuan respon faktor (Rf) standar asam lemak:
area standar internal mg asam lemak X Rf = x
mg standar internal area asam lemak
b. Penentuan kadar asam lemak sampel
WSI (mg) area X Konsentrasi asam lemak (mg/g) = x Rf x
Wminyak (g) Area SI Keterangan :
WSI = bobot asam lemak standar internal (SI) (mg) Wminyak = bobot minyak yang dimetilasi (g)
c. Penentuan persen asam lemak
Luas area puncak asam lemak
Persen asam lemak = x 100% Luas total puncak asam lemak
3. Kadar Air, Metode Oven Vakum (AOAC, 1995)
Sampel minyak sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam cawan aluminium. Sampel lalu dikeringkan dalam oven vakum pada suhu 20-25oC dan tekanan di bawah 100 mmHg hingga bobotnya konstan. Cawan dan sampel tersebut kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit. Bobot konstan terjadi bila pada selang selama 1 jam pengeringan perubahan bobot kurang dari 0.05%. Perhitungan:
Bobot yang hilang (g)
Kadar air (%) = x 100% (basis basah) Bobot sampel (g)
4. Rendemen (Muchtadi, 1992)
Rendemen dari masing-masing perlakuan dihitung berdasarkan jumlah berat contoh yang diperoleh setelah perlakuan dibagi dengan jumlah bahan awal. Perhitungan:
Berat akhir (g)
Rendemen (%) = x 100% Berat awal (g)
5. Bilangan Asam (AOCS, 1995)
Sampel ditimbang sebanyak 19-21 + 0.05 g ke dalam sebuah erlenmeyer 250 ml, kemudian ditambahkan 100 ml campuran pelarut yang telah dinetralkan ke dalam labu erlenmeyer tersebut. Campuran pelarut yang digunakan terdiri atas 50% (volume) dietil eter dan 50% (volume) etanol 95%. Dalam keadaan teraduk kuat, larutan isi labu erlenmeyer dititrasi dengan larutan KOH 0.1 N dalam alkohol sampai berwarna merah muda. Warna merah muda ini harus bertahan paling sedikit 15 detik. Indikator yang digunakan yaitu phenolphtalein yang dilarutkan dalam etanol. Perhitungan: 56.1 x V x N
Bilangan asam (mg KOH/g sampel) = m
Keterangan: V = volume larutan KOH yang dibutuhkan pada titrasi (ml) N = normalitas larutan KOH hasil standarisasi
m = bobot sampel (g)
6. Bilangan Penyabunan (AOCS, 1995)
Sampel ditimbang sebanyak 4-5 g ke dalam labu erlenmeyer, kemudian ditambahkan 50 ml KOH alkoholik 0.5 N. Labu erlenmeyer kemudian disambungkan dengan kondensor dan dididihkan selama 1 jam agar terjadi reaksi saponifikasi. Setelah reaksi saponifikasi selesai, labu dan kondensor didinginkan sebentar dan kemudian bagian dalam kondensor dicuci dengan sedikit akuades. Labu dilepaskan dari kondensor dan
ditambahkan 1 ml indikator phenolphtalein dan dititrasi dengan HCl 0.5 N sampai warna merah muda menghilang. Titrasi juga dilakukan pada blanko, yaitu semua perlakuan seperti sampel tetapi tanpa penambahan sampel. Perhitungan:
(B-S) x (N)
Bilangan penyabunan (mg KOH/g sampel) = x 56.1 W
Keterangan: B = volume HCl 0.5 N yang dibutuhkan pada titrasi blanko (ml)
S = volume HCl 0.5 N yang dibutuhkan pada titrasi sampel (ml)
N = normalitas larutan HCl hasil standarisasi W = bobot sampel (g)
7. Total Gliserol (AOCS, 1995)
Sampel ditimbang sebanyak 9.9-10.1 g ke dalam labu erlenmeyer, kemudian ditambahkan 100 ml KOH alkoholik + 0.7 N. Labu erlenmeyer kemudian disambungkan dengan kondensor dan dididihkan selama 30 menit agar terjadi reaksi saponifikasi. Setelah reaksi saponifikasi selesai, labu dan kondensor didinginkan sebentar dan kemudian dicuci bagian dalam kondensor dengan sedikit akuades.
Labu erlenmeyer lalu dilepaskan dari kondensor dan dipindahkan isinya ke dalam larutan yang merupakan campuran 91 ml khloroform dan 25 ml asam asetat glasial dalam labu takar 1 liter. Labu erlenmeyer dibilas dengan menggunakan akuades sebanyak 500 ml. Labu takar tersebut kemudian ditutup dan dikocok kuat-kuat selama 30-60 detik dan selanjutnya ditambahkan akuades sampai batas takar dan dibiarkan beberapa saat hingga lapisan akuatik memisah sempurna.
Sementara itu dipipet masing-masing 6 ml larutan asam periodat ke dalam 2 atau 3 gelas piala 400-500 ml dan disiapkan dua blanko dengan
mengisi masing-masing 50 ml akudes (sebagai pengganti asam periodat). Lapisan akuatik yang telah terpisah kemudian dipipet sebanyak 100 ml ke dalam gelas piala berisi larutan asam periodat dan kemudian dikocok perlahan. Sesudahnya, gelas piala ditutup dan dibiarkan selama 30 menit.
Setelah 30 menit kemudian ditambahkan 3 ml larutan KI, dikocok perlahan dan dibiarkan selama 1 menit (tidak boleh lebih dari 5 menit) sebelum dititrasi. Isi gelas piala dititrasi dengan larutan natrium tiosulfat yang sudah distandarkan. Titrasi diteruskan sampai warna coklat iodium hampir hilang. Setelah tercapai, ditambahkan 2 ml larutan indikator pati dan titrasi diteruskan sampai warna biru kompleks iodium-pati hilang. Perhitungan:
2.302 (B-C) N
Total gliserol (%-b) = W
Keterangan: C = volume larutan Na2S2O3 yang dibutuhkan pada titrasi sampel (ml)
B = volume larutan Na2S2O3 yang dibutuhkan pada titrasi blanko (ml)
N = normalitas larutan Na2S2O3
Berat sampel x ml sampel (lapisan akuatik)
W =
900
8. Kadar Ester (SNI, 2006)
Berdasarkan SNI dengan nomor 04-7182-2006 tentang “Biodiesel”, kadar ester dapat ditentukan dengan perhitungan berdasarkan bilangan asam, bilangan penyabunan dan total gliserol. Perhitungan:
100 (As - Aa - 4.57Gttl) Kadar ester (%-b) =
Keterangan: As = angka penyabunan yang ditentukan dengan metoda AOCS Cd 3-25 (mg KOH/g sampel)
Aa = angka asam yang ditentukan dengan metoda AOCS Cd 3-63 (mg KOH/g sampel)
Gttl = total gliserol yang ditentukan dengan metoda AOCS Ca 14-56 (%-b)
9. Perolehan Metil Ester
Perolehan metil ester dihitung berdasarkan prinsip stoikiometri reaksi metanolisis trigliserida dimana dari satu mol trigliserida akan bereaksi dengan tiga mol metanol menghasilkan tiga mol metil ester. Perhitungan:
Bobot sampel minyak
Bobot metil ester teoritis (g) = x 3 x MR metil ester MR triglierida rata-rata
Bobot CME x kadar ester
Perolehan metil ester (%) = x 100% Bobot metil ester teoritis