1. Persiapan pakan mencit
Ransum mencit perlakuan mengandung bubuk daun cincau hijau Premna oblongifolia Merr dengan dosis meningkat. Pemberian cincau tidak dalam wujud gel atau minuman jelli karena bentuk bubuk daun cincau hijau yang diberikan sudah merupakan hancuran dari daun cincau hijau melalui proses seperti yang dilakukan oleh Chalid (2003) dengan beberapa modifikasi. Pembuatan bubuk daun cincau hijau disajikan dalam lampiran 1. Ransum pakan mencit diberikan dalam bentuk pelet kering.
Komposisi ransum mencit mengacu pada standar AIN (American Institut of Nutrition) 1976 yang dimodifikasi. Dosis bubuk daun cincau yang diberikan meningkat pada kelompok perlakuan,
yaitu: 0.88%, 1.76%, dan 2.64%. Berikut rincian komposisi pakan mencit yang digunakan dalam penelitian ini:
Tabel 2. Komposisi pakan standar dan pakan uji mencit AIN 1976 yang dimodifikasi (AIN 1977)
komponen komposisi (AIN 1976) yang dimodifikasi (%) Kelompok mencit A B C D E (Gram) Bubuk daun Cincau Hijau 0.0 0.000 0.000 0.880 1.760 2.640 Protein (kasein) 20.0 21.900 21.900 21.736 21.567 21.396 Lemak (minyak jagung) merek Mazola 5.0 4.950 4.950 4.933 4.914 4.896 Selulosa (CMC) 5.0 5.000 5.000 4.551 4.102 3.653 Mineral mix 3.5 2.850 2.850 3.279 3.208 3.137 Vitamin merek Fitkom 1.0 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 Air 10.0 8.310 8.310 8.287 8.279 8.258 Karbohidrat (maizena) merek Honig 55.5 55.990 55.990 55.334 55.170 55.021
2. Pemeliharaan Mencit Percobaan
Pemeliharaan dilakukan selama 52 hari dan merupakan kerja tim yang terdiri dari empat orang peneliti. Sebanyak 25 ekor mencit resipien umur 2-3 bulan dan jenis kelamin jantan atau betina dibagi mejadi 5 kelompok, tiap kelompok terdiri dari 5 ekor mencit. Tiap ekor mencit menempati satu kandang yang terbuat dari plastik dan ditempatkan dalam ruangan yang telah diatur siklus udara dan cahaya. Terhadap mencit dilakukan adaptasi selama satu minggu dengan pakan standar sebagai rnakanan dan air sebagai minuman (ad libitum). Pemberian pakan dan minuman dilakukan tiap hari antara pukul 07.00 sampai dengan 09.00 WIB. Jumlah pakan yang diberikan sebanyak 5 gram
ad-libitum. Banyaknya pakan yang dikonsumsi dihitung tiap hari berdasarkan hasil penimbangan jumlah
pakan yang tersisa.
Pemberian pakan pada awal perlakuan dilakukan selama 30 hari yang terdiri dari 6 hari adaptasi dan 24 hari pemberian pakan standar atau perlakuan. Kemudian pada hari ke-31 dilakukan transplantasi suspensi sel tumor kelenjar susu sebanyak 0.2 ml (±106 sel hidup) dari mencit donor kepada mencit kelompok B, C, D, dan E pada daerah subkutan aksila kanan. Pemberian pakan dilanjutkan kembali selama 22 hari setelah transplantasi sel tumor. Bobot badan mencit ditimbang dua
kali dalam satu pekan, pengukuran tumor juga diukur dua kali sepekan dengan menggunakan jangka sorong digital, dan masa laten diukur dengan cara meraba menggunakan tangan. Semua organ hati dan jaringan tumor pada mencit diambil dan ditimbang pada saat terminasi. Organ hati diproses lebih lanjut untuk dilihat profil histopatologisnya menggunakan teknik pewarnaan HE (Hematoksilin Eosin).
Tabel 3. Kelompok mencit kontrol dan perlakuan
Kode Kelompok Perlakuan
A kontrol positif diberi pakan standar dan tidak ditransplantasi tumor
B kontrol negatif hanya diberi pakan standar dan ditransplantasi tumor C diberi pakan yang telah ditambahkan dengan bubuk daun
Premna oblongifolia Merr 0.88% dan ditransplantasi tumor
D diberi pakan yang telah ditambahkan dengan bubuk daun
Premna oblongifolia Merr 1.76% dan ditransplantasi tumor
E diberi pakan yang telah ditambahkan dengan bubuk daun
Premna oblongifolia Merr 2.64% dan ditransplantasi tumor
3. Mencit donor
Mencit donor yang digunakan dalam proses transplantasi adalah mencit yang sudah mencapai tahap pasasi ke-13. Hal tersebut berarti mencit donor yang digunakan merupakan generasi ke-13 mencit C3H yang ditransplantasi tumor secara subkutan di aksila kanannya. Proses transplantasi mencit donor dari mencit donor sebelumnya sama seperti proses transplantasi tumor dari mencit donor ke mencit resipien yang dilakukan di penelitian ini (lampiran 2). Mencit yang sudah ditransplantasi dan mengandung sel tumor di dalam tubuhnya dipelihara dan dipisahkan dari populasi mencit yang normal. Selama masa pemeliharaan, mencit calon donor tersebut selalu diamati kondisinya. Apabila mencit sudah menampakkan tanda-tanda kematian, mencit segera dimatikan dan diambil kembali tumornya untuk ditransplantasikan ke mencit resipien yang lain.
4. Transplantasi dan pengukuran tumor (Chalid, 2003)
Transplantasi dilakukan dengan jalan mematikan mencit C3H donor dengan eter, ditelentangkan pada papan fiksasi, keempat kakinya difiksasi dengan jarum. Kulit mencit bagian bawah disterilisasi dengan alkohol 70%. Pengambilan dilakukan dengan menggunakan gunting steril, tumor dibersihkan dengan larutan buffer posfat (PBS) di dalam cawan petri dan diletakkan di atas es. Jaringan tumor yang tidak mengalami nekrosis dipisahkan, dibersihkan dari jaringan ikat dan darah kemudian dicacah sampai halus dengan menggunakan gunting. Pengerjaan ini tetap dilakukan di atas es. Tambahkan larutan buffer sebanyak volume tumor, aduk sampai homogen. Suspensi tumor disuntikan dengan jarum trokar secara subkutan di aksila kanan mencit C3H resipien sebanyak 0,2 ml yang mengandung ± 106 sel tumor hidup. Penghitungan jumlah sel dilakukan dengan menggunakan hemasitometer dan
tryphan blue dan diamati di bawah mikroskop. Selama masa pengamatan tumor diukur menggunakan
jangka sorong digital dengan mengukur panjang dan lebarnya dalam satuan mm. Proses transplantasi tumor secara lebih jelas disajikan dalam bentuk diagram di lampiran 2.
Gambar 4. Foto transplantasi tumor di subkutan aksila kanan mencit C3H
5. Pembuatan preparat histopatologi dengan pewarnaan HE (Panigoro et al.
2007 yang dimodifikasi)
Pemrosesan jaringan untuk dibuat menjadi preparat histopatologi melalui tahapan-tahapan sebagai berikut; fiksasi jaringan, dehidrasi, clearing, infiltrasi, embedding, trimming, sectioning, deparafinisasi, dan dilanjutkan dengan staining (pewarnaan). Fiksasi jaringan dilakukan dengan merendam sampel jaringan ke dalam larutan formalin. Proses pembuatan preparat dan pewarnaan histologi ini disesuaikan dengan metode yang biasa digunakan di laboratorium Patologi Anatomi FKUI.
Sampel jaringan yang sudah menjadi histopat direndam ke dalam xylol I selama 5-10 menit untuk menghilangkan parafin, kemudian direndam dalam xylol II kembali untuk membilas selama 5-10 menit. Setelah itu, sampel mulai direndam dalam alkohol. Pada tahap ini sampel mulai berturut-turut direndam dalam alkohol yang menurun konsentrasinya secara bertingkat, yaitu: alkohol absolut (100%), alkohol 96%, kemudian alkohol 70% masing-masing 5 menit. Konsentrasi yang menurun secara berturut-turut tersebut akan membuat air memasuki sampel jaringan. Sampel kemudian direndam dalam akuades selama 5 menit dan direndam dalam larutan hematoksilin selama 5-10 menit. Hematoksilin akan mewarnai inti sel pada sampel jaringan dengan warna biru. Setelah itu, sampel dimasukkan dalam air mengalir (secara tidak langsung) selama 5-10 menit untuk membilas. Sampel yang terlalu biru dicelupkan dalam alkohol asam sebanyak 2-3 celupan. Sampel kemudian dibilas dalam air mengalir kembali selama 5-10 menit. Kemudian sampel dicelup ke dalam larutan Litium karbonat sebanyak 2-3 celupan agar warna biru yang timbul menjadi lebih jelas. Sampel kembali dibilas dengan air mengalir selama 5-10 menit. Tahap pewarnaan selanjutnya adalah pewarnaan dengan pewarna eosin selama 1-2 menit untuk mewarnai sitosol sel pada sampel jaringan. Setelah tahap ini, sampel memasuki tahap pencelupan alkohol yang meningkat konsentrasinya secara berturut-turut sebagai kebalikan dari tahap yang sebelumnya, yaitu: alkohol 70%, alkohol 96%, dan alkohol absolute (100%) masing-masing sebanyak 3-4 celupan. Pada akhir tahap pewarnaan, sampel kembali direndam dengan xylol selama 5-10 menit, kemudian direndam kembali dalam xylol selama 5-10 menit. Setelah itu, sampel jaringan ditutup dengan gelas penutup dan direkatkan dengan entellan. Slide histopatologi siap diamati di bawah mikroskop dan difoto. Tahapan proses ini lebih jelas terlampir pada lampiran 3a dan 3b.
6. Pengamatan preparat histopatologi jaringan hati (Syabana 2010 yang
dimodifikasi)
Metode pengamatan preparat histopatologi jaringan hati dilakukan dengan mengamati melalui mikroskop dengan perbesaran lensa objektif 40x. Jaringan hati diamati pada lima lapang pandang yang berbeda. Sel hati diamati berkaitan dengan terjadinya kerusakan degenerasi hidropis, degenerasi lemak, dan nekrosis. Jumlah sel yang mengalami kerusakan dihitung persentasenya dari jumlah seluruh sel yang diamati.