(1) (2)
(3)
Gambar 3. Ragi Tape (1) Daerah DKI Jakarta dan Jawa Barat ; (2) Daerah Yogyakarta dan Jawa Timur (3) Daerah Jawa Tengah
C. Metode Penelitian
Penelitian yang dilakukan terdiri dari dua tahap yaitu penelitian pendahuluan yang meliputi isolasi serta identifikasi kapang dan khamir, kemudian uji kemampuan isolat kapang/khamir dalam mereduksi aflatoksin. Selanjutnya dipilih satu isolat kapang/khamir yang berpotensi tinggi dalam mereduksi aflatoksin tertinggi untuk digunakan dalam penelitian utama. Penelitian utama meliputi uji kemampuan penghambatan isolat kapang dan khamir terhadap pertumbuhan A. parasiticus, uji pengaruh filtrat isolat kapang dan khamir terhadap pertumbuhan A. parasiticus dan biosintesis aflatoksin serta uji kemampuan isolat kapang dan khamir dalam mendegradasi aflatoksin. Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 4.
1. Isolasi Kapang dan Khamir (Daulay 1989)
Sebanyak 5 g ragi tape berbentuk bubuk ditambah dengan 45 ml akuades steril, setelah itu dilakukan pengenceran 10-2, 10-3, 10-4 dan seterusnya. Selanjutnya dilakukan pemupukan cawan sebanyak 1 ml suspensi ragi tape, kemudian 15 ml medium APDA (PDA+asam tartarat 10%) dituang ke dalam cawan dan diratakan, setelah itu diinkubasi selama 2-3 hari pada suhu 28-30oC. Setiap koloni kapang dan khamir yang berbeda warna dan penampilannya dipisahkan dan dimurnikan, selanjutnya digores kembali pada PDA miring dan disimpan di kulkas sebagai kultur stok.
2. Identifikasi Kapang dari Ragi Tape
a. Pembuatan Kultur Slide (Harrigan 1998)
Untuk membuat kultur slide dibutuhkan cawan petri yang di dalamnya terdapat gelas obyek yang diletakkan di atas batang U atau V, perangkat tersebut berada dalam keadaan steril. Potongan medium PDA steril berukuran 1x1 cm diletakkan di atas gelas obyek yang berada di dalam cawan petri, selanjutnya dilakukan inokulasi kapang pada potongan agar tepat di tengah-tengah keempat sisinya menggunakan jarum ose.
Potongan agar yang telah diinokulasi kemudian ditutup dengan
cover glass. Akuades steril diteteskan ke dalam cawan petri tanpa
membasahi gelas obyek yang ada di dalamnya, selanjutnya kultur slide diinkubasi pada suhu 28-30oC sekitar 2-4 hari. Bila spora telah muncul, cover glass diangkat dan diletakkan pada gelas obyek lain yang telah diberi cairan pewarna lactophenol cotton blue, kemudian struktur kapang diamati di bawah mikroskop.
Gambar 4 Diagram alir tahap penelitian Koleksi sampel ragi tape
Jakarta, Bandung, Semarang, Rembang, Yogyakarta, Madiun
Isolasi Kapang dan Khamir
Persiapan Spora
A. parasiticus
Seleksi Isolat Kapang dan Khamir dengan Aktivitas Reduksi Aflatoksin terbaik Uji Kemampuan Isolat Kapang dan Khamir untuk Mereduksi Kandungan Aflatoksin
Uji Kemampuan Penghambatan Kapang /Khamir thd Pertumbuhan
A. parasiticus
1. Perhitungan koloni (CFU/ml) 2. Karakteristik morfologi 3. Interaksi Langsung antara
Khamir dgn A. parasiticus
Uji Pengaruh Filtrat Kapang/Khamir terhadap Biosintesis Aflatoksin
1. Pengukuran Berat Kering Miselium 2. Analisis Aflatoksin
3. Pengukuran pH
Uji Kemampuan Kapang/Khamir dalam Mendegradasi Aflatoksin
1. Analisis Aflatoksin 2. Pengukuran pH Identifikasi Kapang dan Khamir
b. Identifikasi Isolat Kapang
Identifikasi isolat kapang dilakukan baik secara makroskopis maupun mikroskopis. Identifikasi secara makroskopis dilakukan dengan cara melihat langsung koloni yang tumbuh pada media CYA, MEA dan G25N setelah 2 hari inkubasi pada suhu 28-30oC. Koloni yang tumbuh akan memiliki spora dengan bentuk dan warna yang berbeda-beda tergantung spesies kapang, sedangkan identifikasi secara mikroskopis dilakukan dengan cara mengamati struktur kapang di bawah mikroskop setelah sebelumnya ditumbuhkan terlebih dahulu pada kultur slide selama 3 hari.
Identifikasi spesies kapang ditentukan dengan membandingkan ciri-ciri makroskopis dan mikroskopis kapang tersebut dengan ciri-ciri kapang yang terdapat pada pustaka. Berdasarkan kunci identifikasi Pitt dan Hocking (1997), penggolongan Ordo Mucorales ke dalam genus berdasarkan pada morfologi sporangiofor dan sporangium (Lampiran 3). Penggolongan Rhizopus dan Mucor ke dalam spesies berdasarkan kunci identifikasi Gilman (1957) di mana penggolongan
Mucor ke dalam spesies berdasarkan ukuran sporangium dan
sporangiospora, warna hifa serta suhu optimum pertumbuhan (Lampiran 4), sedangkan penggolongan Rhizopus ke dalam spesies berdasarkan perkembangan rhizoid, ukuran spora dan sporangiofor (Lampiran 5). Deskripsi Chlamydomucor oryzae berdasarkan Heyne (1987) dan penggolongan Aspergillus ke dalam spesies berdasarkan warna/pigmentasi konidia Raper dan Fennell (1973) (Lampiran 6).
Konfirmasi beberapa spesies kapang dilakukan di Laboratorium Fitopatologi, SEAMEO BIOTROP Bogor.
3. Identifikasi Khamir
Identifikasi khamir yang dilakukan dalam penelitian ini hanya meliputi pengamatan terhadap morfologi serta uji-uji sifat fisiologis khamir yang meliputi uji fermentasi dan asimilasi gula-gula, kemampuan
tumbuh pada suhu 37oC serta kemampuan untuk membentuk pati ekstraseluler (Lampiran 7). Hasil pengamatan morfologi dan uji fisiologis selanjutnya dicocokkan dengan ciri-ciri khamir pada pustaka Lodder (1974) dan Barnett et al. (2000).
a. Karakteristik Morfologi Khamir (Lodder 1974)
Isolat khamir digoreskan pada permukaan media CMA kemudian ditutup dengan cover glass dan diinkubasi pada suhu 28-30oC selama 3 hari. Bagian sisi atau tepi koloni yang tumbuh diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x untuk melihat ada tidaknya miselium (semu atau sejati), blastospora dan arthrospora.
b. Uji Fermentasi Gula (Lodder 1974)
Mula-mula dilakukan penyegaran isolat khamir pada tabung agar miring PDA dan diinkubasi selama 2 hari pada suhu 28-30oC. Selanjutnya secara aseptis dibuat suspensi khamir dengan menambahkan 5 ml akuades steril ke dalam tabung yang berisi isolat khamir. Media fermentasi gula di dalam tabung reaksi diinokulasi dengan menambahkan 0,1 ml suspensi khamir (Lampiran 2). Setelah dikocok, media diinkubasi pada suhu 28-30oC dan dilakukan pengamatan terhadap pembentukan gas (pada tabung Durham) dan pembentukan asam setiap hari ke -3, 7 dan 14.
c. Uji Asimilasi Karbon (Lodder 1974)
Sebanyak 1 ml suspensi khamir diinokulasikan ke dalam cawan Petri, kemudian dita mbahkan media YNB + agar noble sebanyak 15-20ml. Setelah membeku, sebanyak 5 mg gula-gula yang akan diuji ditaburkan secara terpisah. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 28-30oC dan diamati pada hari ke-3 dan 7 untuk mengetahui ada tidaknya pertumbuhan yang menunjukkan sumber karbon tersebut dapat diasimilasi atau tidak oleh khamir yang diuji.
d. Uji Pertumbuhan pada Suhu 37oC (Lodder 1974)
Isolat khamir digoreskan pada tabung agar miring PDA dan diinkubasi pada suhu 37oC untuk menentukan kemampuan tumbuh khamir pada suhu tersebut.
e. Uji Kemampuan Membentuk Pati Ekstraseluler (Lodder 1974) Isolat khamir digoreskan pada cawan Petri yang berisi media PDA dan diinkubasi pada suhu 28-30oC selama 3 hari, selanjutnya pada koloni khamir yang terbentuk ditete si larutan iod untuk mengetahui kemampuan membentuk pati. Apabila terbentuk warna biru, berarti khamir tersebut membentuk pati.
4. Persiapan Spora Kapang dan Sel Khamir (Kim et al. 2000)
Kultur murni kapang dan khamir disegarkan dengan cara menggoreskan kembali kultur murni tersebut pada agar miring PDA yang baru, kemudian kapang diinkubasi pada suhu 28-30oC selama 7 hari, sedangkan khamir 2 hari.
Suspensi spora dibuat dengan menambahkan akuades steril yang mengandung Tween 80 0,1% ke dalam tabung agar miring, sedangkan suspensi khamir tanpa penambahan Tween 80. Suspensi spora kapang dan sel khamir dihitung menggunakan hemasitometer kemudian diatur konsentrasinya menjadi 106 spora kapang/ml atau 106 sel khamir/ml dan digunakan untuk uji selanjutnya.
5. Uji Kemampuan Isolat Kapang dan Khamir dalam Mereduksi
Kandungan Aflatoksin (Modifikasi Sardjono et al. 1992)
Sebanyak 0,5 ml suspensi spora A. parasiticus dengn konsentrasi 106 spora/ml dicampur dengan 0,5 ml (106 spora/ml atau 106 sel/ml) suspens i spora isolat kapang atau sel khamir yang diuji, diinokulasikan ke
dalam 100 ml medium PDB dan diinkubasi selama 10 hari pada suhu 28-30oC.
Sebagai kontrol, sebanyak 0,5 ml suspensi spora A. parasiticus 106 spora/ml diinokulasi pada medium PDB, kemudian diinkubasi pada waktu dan kondisi yang sama. Setelah itu dilakukan analisis aflatoksin dan dihitung reduksi aflatoksin dari isolat kapang atau khamir uji dibandingkan dengan kandungan aflatoksin pada kontrol.
Persentase reduksi aflatoks in ditentukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
( A – B )
% reduksi aflatoksin = x 100% A
Keterangan :
A : Kandungan aflatoksin yang dihasilkan oleh A. parasiticus (kontrol) B : Kandungan aflatoksin yang dihasilkan oleh A. parasiticus yang
ditumbuhkan bersama-sama dengan isolat kapang/khamir
6. Uji Kemampuan Penghambatan Kapang dan Khamir terhadap
Pertumbuhan A. parasiticus (Modifikasi Gourama dan Bullerman 1995)
Sebanyak 0,5 ml suspensi spora A. parasiticus 106 spora/ml dicampur dengan 0,5 ml suspensi spora isolat kapang 106 spora/ml atau sel khamir uji, diinokulasikan ke dalam 100 ml medium MEB dan diinkubasi pada suhu 28-30oC. Sebagai kontrol, 0,5 ml suspensi spora A. parasiticus 106 spora/ml dan 0,5 ml suspensi spora isolat kapang 106 spora/ml atau sel khamir uji masing-masing diinokulasi pada medium MEB, kemudian diinkubasi pada waktu dan kondisi yang sama.
Inkubasi campuran di atas dilakukan selama 9 hari karena waktu pertumbuhan optimum kapang umumnya sekitar 5-7 hari dan selanjutnya kapang memasuki fase pertumbuhan stasioner. Selama inkubasi, pada hari ke-0, 3, 6 dan 9 dilakukan sampling dan pemupukan cawan pada medium PDA kemudian diinkubasi pada suhu 28-30oC selama 2 hari. Selanjutnya
dilakukan pengamatan dan perhitungan koloni per ml (CFU/ml) dari
A. parasiticus dan isolat kapang/khamir uji.
Pada hari ke-9, terhadap semua campuran di atas dibuat kultur slide
lalu diamati karakteristik morfologinya.
7. Pengamatan Interaksi Langsung Khamir dengan A. parasiticus secara in vitro (Modifikasi Chan dan Tian 2005)
Sebanyak 8 ml medium PDA dituang ke dalam cawan Petri. Setelah membeku, diletakkan agar (berdiameter 5 mm) yang mengandung miselium A. parasiticus (berumur 3-4 hari) di atas permukaan agar PDA. Setelah diinkubasi selama 72 jam pada suhu 28-30oC, 50 µl suspensi khamir (108 sel khamir/ml) diteteskan pada bagian tepi miselium kapang yang tumbuh dan diinkubasi kembali selama 48 jam. Selanjutnya terhadap koloni yang tumbuh di cawan Petri dicuci dengan air mengalir selama 30 detik dan kemudian diamati di bawah mikroskop cahaya.
8. Uji Pengaruh Filtrat Kapang dan Khamir terhadap Pertumbuhan
A. parasiticus dan Biosintesis Aflatoksin (Modifikasi Sardjono et al.
