Metode pengujian Antioksidan DPPH

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.7 Antioksidan

2.7.4 Metode pengujian Antioksidan DPPH

Metode DPPH (1,1 Diphenyl-2-picrylhidrazyl) merupakan salah satu uji untuk menentukan aktivitas antioksidan penangkap radikal. Metode DPPH memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil.

DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap. Penangkap radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang diambil (Sayuti dan Yenrina, 2015).

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH). Metode DPPH merupakan metode yang sederhana, cepat, tidak membutuhkan banyak reagen seperti halnya metode lain dan mudah untuk skrining aktivitas penangkap radikal beberapa senyawa selain itu metode ini terbukti akurat, reliabel dan praktis (Sayuti dan Yenrina, 2015).

Radikal DPPH adalah suatu senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil dengan absorbansi kuat pada λ max 517 nm dan berwarna ungu gelap.

Setelah bereaksi dengan senyawa antioksidan, DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan berubah menjadi kuning. Perubahan tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer, dan diplotkan terhadap konsentrasi. Penurunan intensitas warna

yang terjadi disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH. Hal ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat antioksidan, menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk beresonansi (Sayuti dan Yenrina, 2015).

DPPH radikal (ungu) DPPH stabil (kuning)

Metode ini menggunakan IC50 sebagai parameter untuk menentukan konsentrasi senyawa antioksidan yang mampu menghambat 50% oksidasi.

Semakin kecil nilai IC50, maka semakin tinggi aktivitas antioksidan (Lung dan Destiani, 2017). Semakin kecil nilai IC50 maka semakin aktif sediaan tersebut sebagai senyawa penangkap radikal DPPH atau senyawa antioksidan (Rahmatullah dkk., 2019).

Tabel 2. 1 Sifat antioksidan berdasarkan nilai IC₅₀ Nilai IC50 Intensitas Antioksidan

<50 ppm Sangat Kuat

50 ppm – 100 pppm Kuat 100 ppm – 250 ppm Sedang 250 ppm – 500 ppm Lemah

>500 ppm Tidak aktif

Gambar 2. 2 Reaksi Radikal DPPH dengan Antioksidan

23 BAB III

METODE PENELITIAN

Metode penelitian ini dilakukan secara eksperimental. Penelitian meliputi penyiapan bahan tumbuhan, identifikasi tumbuhan, pengolahan simplisia, karakterisasi simplisia, pengolahan ekstrak etanol biji markisa secara maserasi, skrining fitokimia ekstrak biji markisa, pengolahan minyak wijen dengan metode press panas, skrinning fitokimia minyak wijen, formulasi sediaan serum kosmetik, pengujian aktivitas antioksidan sediaan serum kosmetik menggunakan metode pemerangkapan radikal bebas DPPH, penentuan mutu fisik sediaan serum (organoleptis, pengamatan tipe emulsi, uji homogenitas, pengukuran pH, pengujian daya sebar, pengukuran viskositas serta penentuan stabilitas sediaan).

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biologi dan Laboratorium Farmasetika Dasar Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara Medan.

3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah: alat-alat gelas laboratorium, alfa-naftol, aluminium foil (total wrap), beaker glass (pyrex), botol ekstrak, cawan porselen, deck glass, gelas ukur (oberoi), grinder, hotplate, kaca arloji, kertas perkamen, kertas saring, klem, kondensor, kurs porselin, kuvet ( labu tentukur (iwaki), lemari pengering, lumpang dan alu, magnetic stirrer, neraca analitik (boeco germany), object glass, oven (memmert), penangas air (18-One), pH meter (ATC), pH indicator (nesco), pipet tetes, pot plastik, rotary evaporator,

screw press machine, serbet, spatula, spektrofotometer UV-Visibel (shimadzu), spuit (one-med), statif, stirer digital, sudip, tanur (neotherm), tisu (paseo), dan Viskometer NDJ-8S.

3.1.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitan ini antara lain amil alkohol, aquadest, asam asetat anhidrat, asam klorida, asam nitrat, asam sulfat pekat, biru metil, ekstrak etanol biji markisa, etanol 96%, HCl, isopropanol, karbopol, kloroform, larutan dapar pH asam (pH 4,01), larutan dapar pH netral (pH 7,01), methanol, minyak wijen, n-heksan, nipagin, nipasol, parfum, pereaksi bouchardat, pereaksi dragendorff, pereaksi mayer, pereaksi molish, serbuk DPPH, serbuk Mg, setil alkohol, sorbitol, timbal (II) asetat, toluene, trietanolamin (TEA), tween 80.

3.2 Pengambilan sampel

Pengambilan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan tanaman yang sama dari daerah lain. Sampel yang digunakan adalah biji markisa yang diambil dari Berastagi, Kabupaten Karo, Provinsi Sumatera Utara dan biji wijen yang diperoleh dari Pasar Sukaramai Kec.

Medan Area, Kota Medan, Provinsi Sumatera Utara.

3.3 Identifikasi sampel

Identifikasi sampel biji markisa dan biji wijen dilakukan di Herbarium Medanense (MEDA) Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara.

25 3.4 Pengolahan sampel

3.4.1 Biji Markisa

Biji markisa diambil dan dipisahkan dari daging buahnya lalu dicuci bersih dengan air mengalir dan ditiriskan, lalu ditimbang dan diperoleh berat basah.

Kemudian di keringkan di dalam lemari pengering dengan suhu 30-40⁰C hingga kering dan rapuh, lalu ditimbang berat keringnya. Selanjutnya simplisia kering di grinder sampai menjadi serbuk dan disimpan dalam wadah yang terlindungi dari sinar matahari sebelum dilakukan proses ekstraksi dengan cara maserasi.

3.4.2 Biji Wijen / Pembuatan Minyak Wijen

Pembuatan minyak wijen dilakukan dengan metode pengepresan panas menggunakan screw press machine dengan suhu 85⁰C (Handjani dkk., 2010).

Minyak yang diperoleh kemudian ditampung dan diendapkan beberapa hari. Hasil minyak kemudian disaring dan ditimbang beratnya

3.5 Pembuatan Ekstrak Etanol Biji Markisa

Berdasarkan Farmakope Herbal Indonesia Edisi 2 (2017) Pembuatan ekstrak etanol biji markisa dilakukan secara maserasi dengan pelarut etanol 96%.

Sebanyak 200 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam maserator, ditambahkan pelarut etanol 96% sebanyak 2 L. Rendam selama 6 jam pertama sambil sekali-sekali diaduk, kemudian diamkan selama 18 jam. Pisahkan maserat dengan cara filtrasi, kemudian diulangi penyarian dengan etanol 96% sebanyak 1L.

Hasil yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator (suhu 40-50⁰) sampai sebagian besar pelarutnya menguap dan dilanjutkan proses penguapan pada oven (suhu 50⁰C) sampai diperoleh ekstrak kental.

26 3.6 Pembuatan Pereaksi

3.6.1 Pereaksi besi (III) klorida 1%

Sebanyak 1 g besi (III) klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air secukupnya hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).

3.6.2 Pereaksi timbal (II) asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 g timbal (II) asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida sebanyak 100 mL (Depkes RI, 1995).

3.6.3 Pereaksi asam klorida 2 N

Sebanyak 17 mL larutan asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).

3.6.4 Pereaksi asam sulfat 2 N

Sebanyak 5,4 mL asam sulfat pekat kemudian diencerkan dengan air suling hingga 100 mL (Ditjen POM, 1979).

3.6.5 Larutan kloralhidrat

Sebanyak 50 g kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam campuran 15 mL air dan 10 mL gliserin (Ditjen POM, 1995).

3.6.6 Pereaksi mayer

Sebanyak 1,4 g air raksa (II) klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 mL, pada wadah lain ditimbang 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10 mL air suling, kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).

3.6.7 Pereaksi dragendorf

Sebanyak 0,8 g bismut (III) nitrat ditimbang, dilarutkan dalam 20 mL asam nitrat pekat, pada wadah lain ditimbang sebanyak 27,2 g kalium iodida,

dilarutkan dalam 50 mL air suling. Kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan yang jernih diambil dan diencekan dengan air suling hingga volume larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).

3.6.8 Pereaksi bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya lalu ditambahkan 2 g iodium kemudian ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).

3.6.9 Pereaksi molisch

Sebanyak 3 g -naftol ditimbang, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).

3.6.10 Pereaksi liebermann-burchard

Sebanyak 5 bagian volume asam sulfat pekat dicampurkan dengan 50 bagian volume etanol 95%. Lalu ditambahkan dengan hati-hati 5 bagian volume asam asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut dan dinginkan (Depkes RI, 1995).

3.7 Pemeriksaan Makroskopik Biji Markisa dan Biji Wijen

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, bau, warna,ukuran dan rasa dari biji markisa dan biji wijen.

3.8 Pemeriksaan Mikroskopik Biji Markisa dan Biji Wijen

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia biji markisa dan biji wijen dilakukan dengan cara menaburkan serbuk simplisia diatas kaca

objek yang telah ditetesi dengan kloralhidrat, kemudian ditutup dengan kaca penutup, dipanaskan dan diamati dibawah mikroskop.

3.9 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia Biji Markisa, Ekstrak Biji Markisa, Biji Wijen dan Minyak Wijen

3.9.1 Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode destilasi toluen (Azeotropi).

Prosedur kerja:

a. Penjenuhan toluen

Sebanyak 200 mL toluen dan 2 mL air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, didestilasi selama 2 jam, kemudiaan toluen didinginkan selama 30 menit dan volume air pada tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 mL (WHO, 1998).

b. Penetapan kadar air

Sebanyak 5 g sampel yang telah ditimbang seksama dimasukkan ke dalam labu alas bulat berisi toluen, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit, setelah toluene mendidih kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes perdetik sampai bagian air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen.

Destilasi dilanjutkan selama 5 menit kemudian tabung penerima dibiarkan dingin sampai suhu kamar, setelah air dan toluen memisah sempurna volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa.

Kadar air dihitung dalam persen (WHO, 1998) 3.9.2 Penetapan kadar sari larut air

Sebanyak 5 g sampel dimaserasi selama 24 jam dalam 100 mL airkloroform (2,5 mL kloroform dalam air suling 1000 mL) dalam labu bersumbat

sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Diuapkan 20 mL filtrat sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan dalam oven pada suhu 105⁰C hingga diperoleh bobot tetap, kemudian dihitung kadar sari larut air (Depkes RI, 1995).

3.9.3 Penetapan kadar sari larut etanol

Sebanyak 5 g sampel dimaserasi selama 24 jam dalam 100 mL etanol 96%

dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Diuapkan 20 mL filtrat sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan dalam oven pada suhu 105⁰C hingga diperoleh bobot tetap, kemudian dihitung kadar sari larut etanol (Depkes RI, 1995).

3.9.4 Penetapan kadar abu total

Sebanyak 2 g sampel ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Kurs dipijarkan perlahan-lahan pada suhu 550⁰C hingga arang habis, lalu didinginkan dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap. Kemudian dihitung kadar abu total (WHO, 1998).

3.9.5 Penetapan kadar abu tidak larut asam

Abu yang telah diperoleh dari penetapan kadar abu total dididihkan dengan 25 mL asam klorida encer selama 5 menit. Bagian yang tidak larut asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, kemudian dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan, didinginkan dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap, kemudian dihitung kadar abu tidak larut asam (WHO, 1998).

3.10 Skrining Fitokimia Simplisia Biji Markisa, Ekstrak Biji Markisa, Biji Wijen dan Minyak Wijen

Skrining fitokimia yang dilakukan meliputi : 3.10.1 Alkaloida

Sebanyak 0,5 g sampel ditambahkan 1 mL asam klorida 2 N dan 9 mL air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit. Didinginkan dan disaring.

Filtrat dipakai untuk percobaan sebagai berikut:

a. Sebanyak 3 tetes filtrat ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal bewarna putih atau kuning.

b. Sebanyak 3 tetes filtrat ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam.

c. Sebanyak 3 tetes filtrat ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan merah atau jingga. Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percobaan diatas (Depkes RI, 1995).

3.10.2 Flavonoida

Sebanyak 0,5 g sampel ditambahkan 20 mL air panas, dididihkan selama 10 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 mL filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 mL asam klorida pekat dan 2 mL amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol (Farnsworth, 1966).

Menurut penelitian terdahulu Sapoetro (2020) uji flavonoid pada minyak wijen dapat dibuktikan dengan penambahan NaOH dan HCl pada 2 mL minyak wijen yang telah diuapkan selama 2 jam di atas waterbath menunjukkan warna kuning atau oranye adanya kandungan flavonoid.

31 3.10.3 Tanin

Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 mL air suling kemudian disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 mL dan ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi (III) klorida. Jika terjadi warna hijau, biru kehitaman menunjukkan adanya tanin (Farnsworth, 1966).

3.10.4 Saponin

Sebanyak 0,5 g sampel ditimbang dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 10 mL air panas, didinginkan kemudian dikocok selama 10 detik, jika terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan busa tersebut tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N, maka hasil tersebut menunjukkan terdapatnya saponin (Depkes RI, 1995).

3.10.5 Steroid/Triterpenoid

Sebanyak 1 g serbuk simplisia di maserasi dengan 20 mL n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan beberapa tetes pereaksi Liebermenn-Burchard. Timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroid, sedangkan warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid (Harborne, 1996).

3.10.6 Glikosida

Sebanyak 3 g sampel disari dengan 30 mL campuran etanol 96% dengan air suling (7:3), ditambahkan asam sulfat pekat hingga diperoleh pH 2, kemudian direfluks selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Sebanyak 20 mL filtrat ditambahkan 25 mL air suling dan 25 mL timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 mL campuran isopropanol dan kloroform (2:3), dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Kumpulan

sari air diuapkan dengan temperatur tidak lebih dari 50⁰C. Sisanya dilarutkan dalam 2 mL metanol.

a. Sari air dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu diuapkan di atas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 mL air dan 5 tetes pereaksi Molisch. Tambahkan hatihati 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula.

b. Sari pelarut organik diuapkan di atas penangas air. Larutkan sisa dalam 5 mL asam asetat anhidrat. Tambahkan 10 tetes asam sulfat pekat, akan terjadi warna biru atau hijau, menunjukkan adanya glikosida (Depkes RI, 1995).

3.11 Formula sediaan serum 3.11.1 Formula standar

Formula standar yang digunakan pada penelitian sebelumnya Handayani dkk. (2015).

R/ Carbopol 0,5

TEA 1

Methylparaben 0,06 Prophylparaben 0,03

Tween 60 5

Span 60 5

Paraffin Cair 5 Propilenglikol 10

Aquadest ad 100

3.11.2 Formula modifikasi serum kosmetik dari kombinasi ekstrak etanol biji markisa dan minyak wijen

Tabel 3. 1 Formulasi Modifikasi Sediaan Serum Ekstrak Etanol Biji Markisa dan Minyak Wijen

Bahan Serum Formula (%v/v)

F0 F1 F2 F3

Formula F0 : blanko (serum tanpa sampel)

Formula F1 : serum dengan konsentrasi ekstrak etanol biji markisa 0,3% dan minyak wijen 2%

Formula F2 : serum dengan konsentrasi ekstrak etanol biji markisa 0,5% dan minyak wijen 2%

Formula F3 : serum dengan konsentrasi ekstrak etanol biji markisa 0,7% dan minyak wijen 2%

3.11.3 Pembuatan sediaan serum kosmetik kombinasi ekstrak etanol biji markisa dan minyak biji wiijen

Semua bahan yang diperlukan ditimbang. Pembuatan awal dimulai dengan melarutkan nipagin dan nipasol kedalam sebagian aqua DM panas di beaker gelas, kemudian setelah semua larut ditambahkan karbopol. Karbopol dikembangkan dengan cara diaduk menggunakan digital stirer hingga larut sempurna, kemudian ditambahkan sorbitol (massa 1). Pada beaker gelas berbeda dimasukkan tween 80, minyak wijen dan ekstrak etanol biji markisa (massa II), kemudian diaduk sampai

homogen setelah itu digabung massa II kedalam massa I sedikit demi sedikit sampai semua larut sempurna kemudian di tambahkan sisa aqua DM diaduk kembali. Terakhir, ditambahkan TEA secukupnya sampai diperoleh konsistensi serum yang diharapkan dan ditambahkan juga parfum secukupnya.

3.12 Pengujian Aktivitas Antioksidan menggunakan Metode DPPH

Metode pengujian antioksidan yang digunakan yaitu radikal bebas 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH). Serum digunakan sebagai sampel uji dan vitamin C digunakan sebagai pembanding.

3.12.1 Pembuatan larutan induk baku DPPH 0,5mM

Sebanyak 10 mg serbuk DPPH dilarutkan dengan metanol hingga 50 mL.

Diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 200 μg/mL (Molyneux, 2004).

3.12.2 Pembuatan larutan blanko

Sebanyak 2 mL larutan DPPH 0,5 mM dipipet kemudian dimasukkan kedalam labu tentukur 10 mL, dicukupkan volumenya dengan metanol sampai garis tanda (konsentrasi 40μg/mL).

3.12.3 Pengukuran panjang gelombang serapan maksimum DPPH

Larutan DPPH konsentrasi 40 μg/mL dihomogenkan. Diukur absorbansi larutan menggunakan spektrofotometer UV-Visibel dengan panjang gelombang 400-800 nm (Molyneux, 2004).

3.12.4 Penentuan waktu kerja (operating time)

Larutan DPPH konsentrasi 40 μg/mL diukur serapannya untuk menentukan operating time larutan DPPH dalam metanol sampai menit ke- 60.

3.12.5 Pembuatan larutan induk baku ekstrak etanol biji markisa

Sebanyak 25 mg ekstrak dilarutkan dengan metanol hingga 25 mL sehingga diperoleh larutan ekstrak dengan konsentrasi 1000 μg/mL. Perhitungan dapat dilihat pada lampiran 18 halaman 90.

3.12.6 Pembuatan larutan induk baku sediaan serum formula 0

Sebanyak 25 mg sediaan serum dilarutkan dengan metanol hingga 25 mL sehingga diperoleh larutan induk serum dengan konsentrasi 1000 μg/mL.

Perhitungan dapat dilihat pada lampiran 18.

3.12.7 Pembuatan larutan induk baku sediaan serum formula 1

Sebanyak 8,33 g sediaan serum dilarutkan dengan metanol hingga 25 mL sehingga diperoleh larutan induk serum dengan konsentrasi 1000 μg/mL.

Perhitungan dapat dilihat pada lampiran 18 halaman 90.

3.12.8 Pembuatan larutan induk baku sediaan serum formula 2

Sebanyak 5 g sediaan serum dilarutkan dengan metanol hingga 25 mL sehingga diperoleh larutan induk serum dengan konsentrasi 1000 μg/mL.

Perhitungan dapat dilihat pada lampiran 18 halaman 90.

3.12.9 Pembuatan larutan induk baku sediaan serum formula 3

Sebanyak 3,57 g sediaan serum dilarutkan dengan metanol hingga 25 mL sehingga diperoleh larutan induk serum dengan konsentrasi 1000 μg/mL.

Perhitungan dapat dilihat pada lampiran 18 halaman 90.

3.12.10 Pembuatan larutan induk baku vitamin C konsentrasi 0,1%

Sebanyak 25 mg vitamin C dilarutkan dalam labu tentukur 25 mL lalu dicukupkan dengan metanol hingga 25 mL sehingga diperoleh larutan konsentrasi 1000 μg/mL. Perhitungan dapat dilihat pada lampiran 18 halaman 90.

3.12.11 Pembuatan larutan uji serum formula 0

Sebanyak 0,2 mL; 0,4 mL; 0,6 mL; 0,8 mL dan 1,0 ml larutan induk serum dipipet dan ditambahkan 2 mL larutan induk DPPH (konsentrasi 200 μg/mL) kemudian ditambahkan metanol hingga 10 mL sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi masing-masing 20 μg/mL, 40 μg/mL, 60 μg/mL, 80 μg/mL dan 100 μg/mL. Diinkubasi selama 30 menit dan diukur absorbansi masing-masing konsentrasi larutan menggunakan spektrofotometer UV-Visibel dengan panjang gelombang visibel 516 nm.

3.12.12 Pembuatan larutan uji ekstrak, serum formula 1, formula 2 dan formula 3

Sebanyak 0,05 mL; 0,10 mL; 0,15 mL; 0,20 mL dan 0,25 ml larutan induk serum dipipet dan ditambahkan 2 mL larutan induk DPPH (konsentrasi 200 μg/mL) kemudian ditambahkan metanol hingga 10 mL sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi masing-masing 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL dan 25 μg/mL. Diinkubasi selama 30 menit dan diukur absorbansi masing-masing konsentrasi larutan menggunakan spektrofotometer UV-Visibel dengan panjang gelombang visibel 516 nm.

3.12.13 Pembuatan larutan uji vitamin C

Sebanyak 0,02 mL, 0,04 mL, 0,06 mL dan 0,08 mL larutan induk baku vitamin C dipipet, ditambahkan 2 mL larutan induk DPPH (konsentrasi 200 μg/mL) kemudian ditambahkan metanol hingga 10 mL sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi masing-masing 2 μg/m, 4 μg/mL, 6 μg/mL dan 8 μg/mL.

Diinkubasi selama 30 menit dan diukur absorbansi masing-masing konsentrasi larutan menggunakan spektrofotometer UV-Visibel dengan panjang gelombang visibel 516 nm.

3.12.14 Penentuan persen peredaman radikal bebas DPPH

Penentuan persen peredaman radikal bebas oleh serum kosmetik dihitung menggunakan rumus (Molyneux, 2004).

Aktivitas Peredaman (%) = –

x100 % 3.12.15 Penentuan nilai IC50

Penentuan hasil dari metode peredaman DPPH adalah dengan menghitung IC50, nilai ini menunjukkan bahwa sampel uji dapat menyebabkan peredaman sebanyak 50% dari aktivitas DPPH, hal ini dapat dilihat juga dari perubahan warna dari sampel uji yang berwarna ungu pekat ketika ditambahkan DPPH akan berubah menjadi kekuningan. Hasil perhitungan dimasukkan ke dalam persamaan regresi dengan konsentrasi sampel (μg/mL) sebagai absis (sumbu x) dan nilai persen aktivitas peredaman sebagai ordinat (sumbu Y) (Molyneux, 2004).

3.13 Evaluasi Mutu Fisik 3.13.1 Pemeriksaan homogenitas

Uji homogenitas dilakukan dengan cara meneteskan 3 tetes sediaan serum pada sekeping kaca atau bahan transparan lain yang cocok, sediaan harus menunjukkan susunan yang homogen dan tidak terlihat adanya butiran kasar (Ditjen POM, 1979).

3.13.2 Pemeriksaan tipe emulsi

Penentuan tipe emulsi sediaan dilakukan dengan penambahan 1 tetes biru metil ke dalam 3 tetes sediaan serum, jika larut sewaktu diaduk, maka emulsi tersebut adalah tipe m/a (Ditjen POM, 1985).

38 3.13.3 Uji Daya Sebar

Ditimbang 1 gram serum, kemudian diletakan diantara lempeng kaca berdiameter 15 cm. Lempeng kaca bagian atas ditimbang terlebih dahulu kemudian diletakan diatas serum dan dibiarkan 1 menit. Diatasnya diberi 50 gram beban tambahan, dibiarkan 1 menit dan diukur diameter sebarnya. Kemudian ditambah kembali beban dengan berat 100 gram beban tambahan, dibiarkan 1 menit dan diukur diameternya sebarnya.Kemudian tambahkan kembali beban dengan maksimum 150 gram dan diukur kembali diameter sebarnya (Numberi dkk., 2020).

3.13.4 Pengukuran pH

Penentuan pH sediaan dilakukan dengan menggunakan pH meter. Alat terlebih dahulu dikalibrasi dengan menggunakan larutan dapar pH netral (pH 7,01) dan larutan dapar pH asam (4,01) hingga alat menunjukkan harga pH tersebut. Kemudian elektroda dicuci dengan air suling, lalu dikeringkan dengan tisu. Sampel dilihat dalam konsentrasi 1% yaitu ditimbang 1 g sediaan dan dilarutkan dalam larutan 100 mL aquadest. Kemudian elektroda dicelupkan dalam larutan tersebut. Dibiarkan alat menunjukkan harga pH sampai konstan. Angka yang ditujukan pH meter merupakan pH sediaan (Rawlins, 2003).

3.13.5 Viskositas

Pengujian viskositas dilakukan dengan menempatkan sampel dalam viskometer hingga spindel terendam. Spindel diatur dengan kecepatan (Hasrawati dkk., 2020) yang sesuai dengan bentuk sediaan. Angka konstan yang ditunjukkan oleh viskometer merupakan nilai viskositas dari sediaan.

39 3.13.6 Uji Stablitas Fisik

Uji stabilitas terhadap sediaan serum dilakukan pada suhu kamar (25-30⁰C) dan dievaluasi parameter-parameter kestabilan seperti bau, warna, bentuk, pH dan viskositas selama penyimpanan 12 minggu (National Health Surveillance Agency, 2015).

3.13.7 Uji Iritasi

Uji iritasi dilakukan terhadap sediaan serum dengan maksud untuk mengetahui bahwa serum yang dibuat dapat menimbulkan iritasi pada kulit atau tidak. Iritasi dapat dibagi menjadi 2 kategori, yaitu iritasi primer yang akan segera timbul sesaat setelah terjadi pelekatan atau penyentuhan pada kulit dan iritasi sekunder yang reaksinya baru timbul beberapa jam setelah penyentuhan dan pelekatan pada kulit (Ditjen POM, 1985).

Teknik yang digunakan pada uji iritasi adalah metode uji tempel terbuka (open patch) pada bagian belakang daun telinga. Uji tempel terbuka dilakukan dengan cara mengoleskan sediaan pada lokasi lekatan dengan luas tertentu (2,5 x 2,5 cm), dibiarkan terbuka dan diamati reaksi yang terjadi. Uji ini dilakukan sebanyak 2-3 kali selama 2 hari berturut-turut (Tranggono dan Latifah, 2007).

Sukarelawan yang dijadikan panel pada uji iritasi berjumlah 6 orang dengan masing-masing menggunakan 2 jenis konsentrasi formula dan dengan kriteria sebagai berikut : 1. Wanita/Pria berbadan sehat, 2. Usia antara 20-30

Dalam dokumen FORMULASI SERUM KOSMETIK DARI KOMBINASI EKSTRAK BIJI MARKISA (Halaman 36-0)