Bab II Tinjauan Pustaka
2.5 Metode Pengujian Bakteri E.coli pada Makanan
Total Plate Count (TPC) atau dikenal juga dengan Angka Lempeng Total (ALT) merupakan metode pengujian bakteri pada makanan, dimana menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati secara visual dan dihitung, interpretasi hasil berupa angka dalam koloni (cfu) per ml/g atau koloni/100 ml. Cara yang digunakan antara lain dengan cara tuang, cara tetes dan cara sebar (BPOM RI, 2008). Total Plate Count (TPC) merupakan indikator umum yang menggambarkan derajat kontaminasi makanan (Puspandari dan Isnawati, 2015).
Kelebihan dari metode ini antara lain, beberapa mikroba dapat dihitung sekaligus, hanya sel mikroba hidup yang dapat dihitung, dan dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari mikroba yang memiliki penampang spesifik. Namun, kelemahan dari metode ini, yaitu hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk koloni, media dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang berbeda pula, mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada media padat dan membentuk koloni yang kompak, jelas dan tidak menyebar, serta memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang relatif lama hingga pertumbuhan koloni dapat dihitung (Fardiaz, 1992).
Prosedur pemeriksaan bakteri E.coli pada makanan dengan metode TPC menurut APHA 2001 adalah sebagai berikut (Da Silva et. al, 2012):
32
Sebanyak 25 gram sampel makanan atau 250 ml sampel minuman diambil dan dilarutkan dalam 225 ml air peptone. Setelah itu dilakukan pengenceran dan memasukkan larutan tersebut ke dalam tabung reaksi dengan konsentrasi larutan untuk masing-masing tabung sebesar 10-1, 10-2, dan 10-3. Kemudian dilakukan inokulasi sampel dalam tabung reaksi tersebut ke dalam cawan petri yang telah berisi media agar Violet Red Bile (VRB).
2) Inkubasi dan perhitungan koloni
Media agar VRB hasil inokulasi sampel kemudian diinkubasi pada suhu 36oC selama 18 – 24 jam. Setelah 18 – 24 jam, ambil cawan petri yang berisi 15 -150 koloni dan hitung koloni dalam media agar VRB yang berwarna merah keunguan dengan diameter 0,5 mm atau lebih. 3) Uji penegasan
Untuk memastikan bahwa koloni tersebut merupakan bakteri E.coli maka dilakukan inokulasi kembali koloni yang terdapat pada cawan petri tersebut ke dalam tabung berisi media Brilliant Green Bile Broth (BGB). Kemudian diinkubasi kembali pada suhu 35,5oC selama 24 – 26 jam dan periksa apakah terbentuk gas dalam tabung tersebut. Apabila terbentuk gas, maka dilakukan pengujian gram, oksidasi, dan indol. Hasil dalam uji penegasan untuk bakteri E.coli diperoleh jika hasil pengujian gram menunjukkan negatif, uji oksidasi negatif dan uji indol positif.
4) Perhitungan hasil
Setelah diketahui bahwa bakteri yang diperiksa merupakan E.coli, kemudian dilakukan perhitungan jumlah koloni berdasarkan persentasi
33
koloni yang terkonfirmasi sebagai bakteri E.coli. Misalnya, jika pada hasil pengenceran sampel dengan konsentrasi 10-4 didapatkan 65 koloni dimana, 4 dari 5 koloni (80%) diketahui merupakan bakteri E.coli setelah dilakukan uji penegasan, maka perhitungannya adalah 65 x 0,8 x 104= 520.000 CFU/g = 5,4 x 105CFU/g.
b) Most Probable Number (MPN)
Most Probable Number (MPN) merupakan metode pengujian bakteri pada makanan menggunakan media cair dengan tiga replikasi dan hasil akhir berupa kekeruhan atau perubahan warna dan atau pembentukan gas yang juga dapat diamati secara visual dan interpretasi hasil dengan merujuk kepada tabel MPN. Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh yang berbentuk cair. Metode ini dikenal dengan 2 cara, yaitu metode 3 tabung dan metode 5 tabung (BPOM RI, 2008).
Metode MPN memiliki beberapa kelebihan, antara lain metode MPN dapat dibuat sangat peka dengan penggunaan volume inokulum contoh yang lebih besar dari 1,0 ml/tabung, metode MPN dapat dipakai di lapangan, media pertumbuhan yang selektif dapat digunakan untuk menghitung jenis mikroorganisme yang ingin diperiksa serta pelaksanaan metode MPN ini sederhana dan cepat. Sedangkan kelemahan dari metode MPN ini adalah untuk mendapatkan hasil yang valid, maka diperlukan banyak pengulangan (Harmita, 2006).
34
Langkah-langkah untuk melakukan pemeriksaan bakteri E.coli pada makanan dengan menggunakan metode MPN menurut APHA 2001 adalah sebagai berikut (Da Silva et. al, 2012):
1) Persiapan sampel dan inokulasi
Sebanyak 25 gram sampel makanan atau 25 ml sampel minuman dilarutkan dalam 225 ml air peptone 0,1% atau buffer Butterfield’s Phospate (pengenceran 10-1). Setelah itu dilakukan pengenceran dan memasukkan larutan tersebut ke dalam tabung reaksi dengan konsentrasi larutan untuk masing-masing tabung sebesar 10-1, 10-2, dan 10-3. Kemudian dilakukan inokulasi sampel dalam masing-masing tabung reaksi tersebut ke tabung reaksi lain yang telah berisi media berupa larutan Lauryl Sulfate Tryptose (LST) sebanyak 1 ml.
2) Inkubasi untuk uji presumtif
Tabung reaksi yang berisi larutan LST hasil inokulasi sampel kemudian diinkubasi pada suhu 35,5oC selama 24 – 26 jam dan perhatikan apakah terdapat gas yang terbentuk, apabila terdapat tabung rekasi yang tidak terbentuk gas, maka dilakukan inkubasi kembali selama 24 jam.
3) Uji penegasan
Dari masing-masing tabung reaksi yang terbentuk gas, ambil 1 ose sampel dari dalam tabung tersebut dan inokulasi pada larutan BGB. Kemudian tabung reaksi yang berisi larutan BGB diinkubasi pada suhu 35,5oC selama 24 – 26 jam dan periksa apakah terbentuk gas. Jika terbentuk gas maka mengindikasikan hasil yang positif.
35
4) Uji pelengkap
Pada tabung reaksi yang berisi larutan BGB dan terbentuk gas, kemudian diambil 1 ose sampel dan ditanam pada cawan petri yang berisi agar Levine’s Eosin Methylene Blue (L-EMB). Inkubasi cawan petri tersebut pada suhu 36oC selama 24 – 26 jam. Setelah itu akan tumbuh koloni bakteri yang kemudian ditanam kembali pada tabung reaksi yang berisi Plate Count Agar (PCA) dan inkubasi pada suhu 36oC selama 24 – 26 jam. Setelah diinkubasi, maka dilakukan serangkaian uji biokimia sebagai berikut:
a. Masukkan 1 ose sampel dari tabung reaksi yang berisi PCA ke dalam tabung reaksi yang berisi Koser’s Citrate Broth atau Simmons Citrate Agar. Lalu inkubasi pada suhu 36oC selama 96
– 98 jam.
b. Masukkan 1 ose sampel dari tabung reaksi yang berisi PCA ke dalam tabung reaksi yang berisi MR-VP Broth. Lalu inkubasi pada suhu 36oC selama 48 – 50 jam (VP) atau pada suhu 36oC selama 96 – 98 jam (MR).
c. Masukkan 1 ose sampel dari tabung reaksi yang berisi PCA ke dalam tabung reaksi yang berisi Tryptone (Tryptophane) Broth. Lalu inkubasi pada suhu 36oC selama 24 – 26 jam.
d. Ambil 1 ose sampel dari tabung reaksi yang berisi PCA dan letakkan pada kaca preparat untuk dilakukan pewarnaan gram.
Jika hasil uji citrate, VP dan pewarnaan gram menunjukkan hasil negatif, serta uji MR dan indol menunjukkan hasil positif, maka dapat dikonfirmasi bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri E.coli.
36
c) Presence – Absence (P/A) Testing
Metode Presence-Absence (P/A) merupakan modifikasi sederhana dari metode MPN. Penyederhanaan dilakukan dengan menggunakan satu porsi besar dalam botol kultur tunggal untuk mendapatkan informasi kualitatif, yaitu ada tidaknya mikroba. Metode ini dikembangkan dengan penambahan substrat fluorogenic dapat digunakan untuk menumbuhkan dan membedakan bakteri E.coli dari bakteri lainnya (Indriani, 2010). Pengujian bakteri E.coli pada makanan dilakukan dengan menggunakan media yang mengandung substrat berupa fluorogenic dan chromogenic, dimana bertujuan untuk mengetahui jenis mikroorganisme dengan mengidentifikasi aktivitas enzim spesifik yang dimiliki oleh mikroorganisme tersebut (Merck, 2004).
Kelebihan dari metode P/A ini antara lain dapat mendeteksi keberadaan bakteri E.coli secara simultan, prosedurnya lebih mudah dan cepat daripada pengujian TLP maupun MPN, lebih murah karena tidak memerlukan bahan/material yang banyak dan proses inkubasi dapat dilakukan dilapangan (Merck, 2004). Namun, kelemahan dari metode ini adalah apabila hasilnya positif maka tidak ada informasi secara kuantitatif tentang tingkat kontaminasi yang terjadi dan sensitivitas dari metode ini sangat tergantung pada jumlah sampel yang dianalisa (Indriani, 2010).
Langkah-langkah untuk melakukan uji bakteri E.coli pada makanan dengan media Fluorocult LMX Broth adalah sebagai berikut (Merck, 2004):
1. Pembuatan larutan Fluorocult LMX dan inokulasi bakteri
Larutan Fluorocult LMX dibuat dengan melarutkan 17 gram Fluorocult LMX dengan 1 liter aquades. Kemudian dicampurkan dengan menggunakan hotplate dan masukkan sebanyak 20 ml ke dalam tabung
37
reaksi. Sebanyak 25 gram sampel makanan yang akan diperiksa dilarutkan dengan aquades kemudian masukkan sebanyak 5 ml ke dalam tabung reaksi yang berisi larutan Fluorocult LMX, sedangkan untuk sampel minuman masukkan sebanyak 10 ml.
2. Inkubasi dan uji penegasan
Sampel yang telah diinokulasi ke dalam tabung reaksi yang berisi larutan Fluorocult LMX kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 36oC. Untuk mengetahui ada tidaknya bakteri E.coli pada sampel yang diuji tersebut, teteskan reagen kovacs sebanyak 5 – 10 tetes.
3. Interpretasi hasil
Setelah diteteskan reagen kovacs maka tabung reaksi yang terbentuk cincin berwarna merah menandakan bahwa sampel dalam tabung reaksi tersebut positif mengandung bakteri E.coli. Sedangkan apabila tidak terbentuk cincin berwarna merah, maka negatif mengandung E.coli.