A. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Program Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Pembangunan Nasional “Veteran” Jawa Timur. Pelaksanaan penelitian dimulai bulan November 2010 sampai dengan bulan Mei 2011.
B. Bahan dan Alat
1. Bahan Tanaman dan Media
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi bahan bahan tanam, media dan bahan penunjang lainnya. Bahan tanaman yang digunakan sebagai sumber eksplan adalah embrio kelapa kopyor jenis genjah. Embrio kelapa berasal dari buah kelapa kopyor umur 11-12 bulan. Buah kelapa kopyor diambil dari kebun kelapa petani di daerah Pati, Jawa Tengah.
Bahan media yang digunakan adalah media mengandung senyawa makro dan mikro Eeuwens (1976) dan vitamin dari Morel dan Wetmore (1951). Media juga mengandung sukrosa 60 g/l, arang aktif 2,5 g/l dan agar 7,5 g/l. Media Eeuwens dilengkapi dengan zat pengatur tumbuh dan bahan aditif sebagai sumber perlakuan. Zat pengatur tumbuh yang digunakan adalah hormon auksin yaitu IAA dan 2,4-D serta hormon sitokinin yaitu BAP. Sedangkan bahan aditif yang digunakan adalah air kelapa normal dari buah kelapa Dalam hijau.
Bahan penunjang lain adalah bahan sterilisasi. Bahan sterilisasi yang digunakan adalah aluminium foil, spiritus, alhokol 70% dan alkohol 96%, betadine dan klorox (mengandung natrium hipoklorit) yang berfungsi untuk membunuh kuman yang terbawa oleh bahan eksplan dan alat yang digunakan pada saat penanaman.
2. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Laminar Air Flow yang berfungsi sebagai tempat penabur eksplan. Autoklaf digunakan untuk mensterilkan alat-alat gelas, dissecting kit dan media kultur sebelum digunakan. Timbangan analitik berfungsi untuk menimbang bahan media sampai satuan yang kecil (milligram). Magnetic hot-stirer digunakan untuk mengaduk, melarutkan dan memanaskan bahan kimia sehingga bahan kimia dapat larut dengan baik. pH meter digunakan untuk mengukur derajat keasaman media.
Alat-alat lain yang digunakan selama pelaksanaan kultur embrio adalah tabung reaksi, erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, petridish, pipet, pengaduk, pinset, scalpel, lampu bunsen, aluminium foil.
C. Metode Penelitian
Penelitian dilakukan dengan melaksanakan 2 rangkaian percobaan laboratorium, yaitu :
Per cobaan I. Per anan ZPT BAP + IAA dan Air Kelapa pada Per tumbuhan Planlet Kelapa Kopyor Asal Kultur Embr io yang Tidak Dibelah
Penelitian ini merupakan percobaan yang disusun berdasarkan Rancangan Acak Lengkap (RAL) 1 (satu) faktor dengan 5 perlakuan. Setiap perlakuan diulang 10 kali. Setiap botol kultur yang mewakili satu unit percobaan diisi dengan 1 embrio. Perlakuan yang diberikan yaitu :
1) A = Media Eeuwens (kontrol)
2) B = Media Eeuwens + Air Kelapa 150 ml/l
3) C = Media Eeuwens + BAP 2,5 mg/l
4) D = Media Eeuwens + BAP 2,5 mg/l + Air kelapa 150 ml/l
5) E = Media Eeuwens + BAP 2,5 mg/l + IAA 2 mg/l
+ Air Kelapa 150 ml/l
Per cobaan II. Per anan ZPT BAP + 2,4-D dan Air Kelapa pada Per tumbuhan Planlet Kelapa Kopyor Asal Kultur Embr io Dibelah
Penelitian ini merupakan percobaan yang disusun berdasarkan Rancangan Acak Lengkap (RAL) 1 (satu) faktor dengan 5 perlakuan. Setiap perlakuan diulang 10 kali. Setiap botol kultur yang mewakili satu unit percobaan diisi dengan 2 potongan embrio yang berasal dari satu embrio yang sama. Perlakuan yang diberikan yaitu :
1) F = Media Eeuwens + Air Kelapa 150 ml/l
3) H = Media Eeuwens + 2,4-D 2,5 mg/l
4) I = Media Eeuwens + BAP 5 mg/l + 2,4-D 2,5 mg/l
5) J = Media Eeuwens + BAP 5 mg/l + 2,4-D 2,5 mg/l
+ Air Kelapa 150 ml/l
D. Pelaksanaan Penelitian 1. Ster ilisasi Alat
Alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian kultur jaringan dipersiapkan terlebih dahulu seperti beaker glass, tabung reaksi, gelas ukur, erlenmeyer, petridish, pinset, pipet, scalpel, corong, spatula dan gunting. Semua alat-alat disterilkan dengan cara dicuci dengan air sabun hingga bersih kemudian ditiriskan pada rak sampai kering. Semua alat yang sudah kering dibungkus dengan kertas coklat kemudian disterilkan di dalam lemari steril atau autoklaf selama + 1 jam.
2. Pembuatan Media
Media dasar Eeuwens (1976) digunakan untuk proses pertumbuhan planlet kelapa kopyor yaitu pada tahap perkecambahan, tahap pertumbuhan dan tahap pendewasaan.
a. Pada tahap perkecambahan, media yang digunakan adalah media padat Eeuwens yang mengandung sukrosa 60 g/l, arang aktif 2,5 g/l, agar 7,5 g/l. Ke dalam media ditambahkan perlakuan yang diberikan yaitu zat pengatur tumbuh dan bahan aditif air kelapa sesuai dengan percobaan 1 dan percobaan 2. Setiap tabung reaksi diisi dengan media sebanyak 10 ml.
b. Pada tahap pertumbuhan, media yang digunakan adalah media padat Eeuwens yang mengandung sukrosa 60 g/l, arang aktif 2,5 g/l, agar 7,5 g/l. Ke dalam media ditambahkan perlakuan yang diberikan yaitu zat pengatur tumbuh dan bahan aditif air kelapa sesuai dengan percobaan 1 dan percobaan 2. Setiap botol kultur diisi dengan media sebanyak 50 ml. c. Pada tahap pendewasaan, media yang digunakan adalah media cair
Eeuwens yang mengandung sukrosa 60 g/l dan arang aktif 2,5 g/l. Ke dalam media ditambahkan perlakuan yang diberikan yaitu zat pengatur tumbuh dan bahan aditif air kelapa sesuai dengan percobaan 1 dan percobaan 2. Setiap botol kultur diisi dengan media sebanyak 70 ml. 3. Ster ilisasi Media
Media kemudian disterilisasi menggunakan autoclave. Sterilisasi dilakukan selama + 30 menit di dalam autoclave dengan suhu 121o C dan tekanan 1,5 atm. Media yang telah disterilisasi kemudian diletakkan pada rak botol sampai media akan digunakan.
4. Ster ilisasi Embr io
Embrio diambil dari buah kelapa kopyor umur 11-12 bulan diambil dari kebun petani di daerah Pati, Jawa Tengah. Buah kelapa kopyor dibelah secara horizontal dan diambil bagian endosperma yang berisi embrio dengan alat cork borer (diameter 2 cm). Silinder endosperma yang didalamnya mengandung embrio dikumpulkan di beaker glass steril. Silinder endosperma selanjutnya dibawah ke laboratorium untuk sterilisasi. Silinder endosperma dicuci sampai
bersih, kemudian disterilisasi menggunakan klorox 20% dengan cara direndam selama 20 menit dan dibilas dengan aquadest steril sebanyak 3-5 kali.
Sterilisasi silinder endosperma dilakukan kembali di dalam laminar air flow. Embrio dikeluarkan dari endosperma dan dimasukkan dalam erlenmeyer 250 ml. Embrio kemudian disterilisasi menggunakan alkohol 70% dengan cara direndam selama 5 menit dan dibilas aquadest steril sebanyak 3 kali. Selanjutnya embrio disterilisasi lagi menggunakan klorox 10% dan direndam selama 5 menit, kemudian dibilas aquadest steril 3 kali. Sebelum tahap penanaman, embrio direndam dalam air steril yang ditetesi dengan betadine 5-8 tetes.
5. Penanaman Embr io
Penanaman embrio dilakukan di dalam laminar air flow. Embrio yang sudah steril ditanam pada media padat Eeuwens 10 ml yang mengandung sukrosa 60 g/l, arang aktif 2,5 g/l, agar 7,5 g/l. Ke dalam media ditambahkan perlakuan yang diberikan yaitu zat pengatur tumbuh dan bahan aditif air kelapa sesuai dengan percobaan 1 dan percobaan 2. dengan pH media 5,8. Satu tabung reaksi ditanam satu embrio. Tabung reaksi kemudian ditutup dengan aluminium foil dan diletakkan pada ruang tumbuh selama 6-8 minggu.
6. Penumbuhan Embr io Kelapa Kopyor
Tahap perkecambahan, pada tahap ini embrio kelapa kopyor dikecambahkan didalam ruang gelap dengan suhu sekitar kurang lebih 200C dan kelembaban udara 60-70% selama 6-8 minggu pada media padat. Proses perkecambahan ditandai dengan munculnya bakal tunas dan bakal akar.
Tahap periode pertumbuhan, embrio yang telah berkecambah dipindahkan kedalam media padat Eeuwens yang mengandung sukrosa 60 g/l, arang aktif 2,5 g/l, agar 7,5 g/l. Ke dalam media ditambahkan berbagai kombinasi zat pengatur tumbuh dan bahan aditif air kelapa sesuai pada percobaan 1 dan percobaan 2. Pemindahan embrio tersebut dilakukan di dalam laminar air flow. Embrio yang telah berkecambah ditumbuhkan didalam ruang terang dengan suhu 200 C selama 3 bulan sampai menjadi planlet.
Pada tahap pendewasaan planlet, planlet dipindahkan kedalam media cair Eeuwens yang mengandung sukrosa 60 g/l dan arang aktif 2,5 g/l. Ke dalam media ditambahkan berbagai kombinasi zat pengatur tumbuh dan bahan aditif air kelapa sesuai pada percobaan 1 dan percobaan 2. Pemindahan embrio tersebut dilakukan di dalam laminar air flow. Pemindahan media ini dimaksudkan untuk mengganti unsur hara yang telah habis pada media sebelumnya. Pada tahap pendewasaan, planlet diinkubasikan selama 2-3 bulan dalam ruang terang sampai terbentuk 2-3 helaian daun dan akar.
E. Var iabel Pengamatan
Untuk mengetahui pertumbuhan embrio kelapa kopyor, maka variabel pengamatan yang digunakan ada 2 cara yaitu secara deskriptif dan secara kuantitatif.
1. Pengamatan secar a desk r iptif
Pengamatan secara deskriptif dilakukan dengan mendeskripsikan morfologis atau visualisasi perubahan dari setiap tahap pertumbuhan embrio sampai menjadi planlet. Setiap tahapan diambil gambar dengan menggunakan kamera.
2. Pengamatan secar a kuantitatif
a. Tahap Perkecambahan
Selama tahap perkecambahan, pengamatan dilakukan dengan interval waktu 14 hari sekali dengan variabel yang diamati pada tahap perkecambahan terdiri dari :
1) Panjang Embrio
Pengukuran panjang embrio dilakukan dengan menggunakan penggaris. Panjang embrio mulai dari bagian ujung titik tumbuh tunas dan akar sampai pada ujung haustorium.
2) Presentase Perkecambahan
Presentase perkecambahan diperoleh dengan cara menjumlah semua embrio yang berkecambah pada akhir tahap perkecambahan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
Presentase perkecambahan = Jumlah embrio yang berkecambah Jumlah embrio yang ditanam 3) Presentase Eksplan Stagnan
Embrio stagnan pada tahap perkecambahan ditandai dengan tidak adanya kemajuan pertumbuhan embrio. Embrio tetap segar tetapi tidak x 100%
mati, namun juga tidak tumbuh ataupun berkecambah. Presentase stagnan dihitung pada akhir tahap perkecambahan dengan menggunakan rumus :
Presentase embrio stagnan = Jumlah embrio yang stagnan Jumlah embrio yang ditanam
b. Tahap Pertumbuhan Planlet
Selama tahap pertumbuhan planlet, pengamatan dilakukan dengan interval waktu 14 hari sekali dengan variabel yang diamati terdiri dari :
1) Pertumbuhan Tunas
Tinggi tunas, pengukuran tinggi tunas dilakukan dari ujung terpanjang sampai pangkal batang dan dilakukan pada saat subkultur atau pemindahan planlet.
2) Pertumbuhan Akar
Panjang akar primer, pengukuran panjang akar primer dilakukan setelah muncul akar primer dan diukur pada saat subkultur.
3) Persentase Planlet Keluar Tunas
Perhitungan persentase planlet yang terbentuk tunas dilakukan setelah embrio terbentuk tonjolan yang merupakan bakal tunas. Presentase planlet keluar tunas dihitung pada akhir tahap pertumbuhan planlet dengan menggunakan rumus :
Presentase planlet keluar tunas = Jumlah planlet keluar tunas Jumlah planlet yang ditanam
x 100%
4) Persentase Planlet Keluar Akar
Perhitungan persentase planlet yang terbentuk akar dilakukan setelah embrio terbentuk tonjolan yang merupakan bakal akar. Presentase planlet keluar akar dihitung pada akhir tahap pertumbuhan planlet dengan menggunakan rumus :
Presentase planlet keluar akar = Jumlah planlet keluar akar Jumlah planlet yang ditanam 5) Persentase Planlet dengan Tunas dan Akar
Perhitungan persentase planlet yang terbentuk tunas dan akar dilakukan setelah embrio terbentuk tonjolan yang merupakan bakal tunasdan bakal akar. Presentase planlet dengan tunas dan akar dihitung pada akhir tahap pertumbuhan planlet dengan menggunakan rumus : Presentase planlet dengan tunas dan akar =
Jumlah planlet yang ditanam
6) Persentase Planlet Browning
Planlet browning pada tahap pertumbuhan planlet ditandai dengan terjadinya pencoklatan pada planlet yang menyebabkan planlet tidak
berkecambah. Presentase browning dihitung pada akhir tahap
perkecambahan dengan menggunakan rumus :
Presentase Planlet browning = Jumlah planlet yang browning Jumlah planlet yang ditanam
Jumlah planlet dengan tunas dan akar
x 100% x 100%
7) Presentase Planlet Stagnan
Planlet stagnan pada tahap pertumbuhan planlet ditandai dengan tidak adanya kemajuan pertumbuhan planlet. Planlet tetap segar tetapi tidak mati, namun juga tidak tumbuh ataupun berkecambah. Presentase stagnan dihitung pada akhir tahap perkecambahan dengan menggunakan rumus :
Presentase planlet stagnan = Jumlah planlet yang stagnan Jumlah planlet yang ditanam 8) Persentase Planlet Mati
Planlet yang mati pada tahap pertumbuhan planlet ditandai dengan tidak menunjukkan adanya pertumbuhan atau planlet yang mati disebabkan karena kontaminasi jamur dan bakteri. Presentase eksplan mati dihitung pada akhir tahap pertumbuhan planlet dengan menggunakan rumus :
Presentase planlet mati = Jumlah planlet yang mati Jumlah planlet yang ditanam
F. Analisis Data
Analisis data yang dilakukan adalah menggunakan Rancangan Acak Lengkap. Langkah-langkah dalam menganalisis data RAL dengan 5 perlakuan masing-masing diulang 10 kali ulangan.
Analisis RAL
a. Model percobaan RAL adalah
Yij = µ + τ i + € ij i = 1, 2, ….., 5 (banyaknya perlakuan) j = 1, 2, …… 10 (banyaknya ulangan)
x 100%
Yij = nilai keberhasilan pertumbuhan embrio ke-j yang memperoleh perlakuan ke-i.
µ = nilai tengah umum (rata-rata) pertumbuhan planlet
τ = pengaruh perlakuan ke- i terhadap keberhasilan pertumbuhan embrio εij = pengaruh galat percobaan terhadap keberhasilan pertumbuhan embrio
ke- j yang memperoleh perlakuan ke- i.
b. Asumsi
Asumsi yang dibutuhkan untuk analisis percobaan ini adalah : • Komponen-komponen µ, τ i, εij bersifat aditif
• Nilai-nilai τ i ( i = 1, 2, ……., 5) tetap, ∑ τ i = 0 ; ε (τ i) = τ i
• Εij timbul secara acak, menyebar secara normal dengan nilai tengah nol dan ragam τ 2
Apabila asumsi RAL memenuhi syarat maka langsung dapat dilakukan analisis ragam RAL, jika tidak maka data perlu ditransformasi terlebih dahulu. Hasil dari data transformasi yang telah memenuhi asumsi RAL dapat diteruskan dengan analisis ragam, jika tidak maka untuk penarikan kesimpulan dari data yang ada dapat menggunakan mean atau rata-ratanya. c. Analisis Ragam
Data yang telah diperoleh akan dianalisis dengan menggunakan analisis Rancangan Acak Lengkap seperti pada tabel berikut ini :
Tabel 2. Analisis Ragam Percobaan yang terdiri dari Satu Faktor dengan RAL (Sastrosupadi, 2000) SK Db JK KT F Hitung F 5% F 1% Perlakuan Galat t – 1 t(r -1) ∑ y 2 ij – FK (tot.pelak)2/r-FK JKP / t – 1 JKG / t -1 KTP / KTG Total Rt - 1
• Kaidah keputusan pengujian adalah :
a. Jika F hitung > F tabel pada taraf 1 % pengaruh perlakuan dikatakan sangat berbeda nyata ( pada hasil F hitung ditandai dengan 2 tanda **). b. Jika F hitung > F tabel pada taraf 5 %, pengaruh perlakuan dikatakan
berbeda nyata (pada hasil F hitung ditandai dengan satu tanda*). c. Jika F hitung < F tabel pada taraf 5 %, pengaruh perlakuan dikatakan
tidak nyata (pada hasil F hitung ditandai dengan tn). d. Hipotesis
H0 = τ 1 = τ 2 = ………= τ 5 = 0 (berarti konsentrasi zat pengatur tumbuh dan bahan aditif ada yang memberikan hasil yang sama dengan media kontrol).
H1 = minimal ada 1 τ I ≠ 0 ( i = 1, 2, …….., 5) artinya minimal ada 1 perlakuan yang memberikan hasil lebih baik dibandingkan dengan kontrol.
e. Uji BNT
Pengaruh perlakuan diuji dengan uji Fhitung. Apabila nilai Fhitung lebih besar daripada Ftabel pada taraf 1% perlakuan dianggap berbeda nyata. Jika nilai Fhitung lebih besar daripada Ftabel pada taraf 5%, perlakuan dianggap tidak nyata. Untuk pengujian lebih lanjut digunakan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) pada taraf 5%.