Metode Rekayasa Genetika

REKAYASA GENETIKA

B. Teknik Rekayasa Genetik

4. Metode Rekayasa Genetika

Gambar 2.4. Pemotongan Enzim retriksi dari Escherichia coli

Enzim restriksi (endonuklease restriksi) mengenal sekuen pemotongan yang khas dan memotong DNA pada situs pemotongan yang khas pula. Selanjutnya disambung dengan menggunakan enzim ligase (gambar 2.4). Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi untuk menyambung dua ujung potongan DNA. Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari E. Coli dan DNA ligase dari Fage

T4 (Gambar 2.5)

Gambar 2.5. Penyambungan oleh enzim ligase

4. Metode Rekayasa Genetika

Dalam pelaksanaan metode dalam rekayasa genetik untuk organisme tumbuhan dan hewan ada perbedaan karena menyangkut struktur sel tumbuhan dan hewan berbeda. Berikut kita bahas satu persatu.

 Metode Rekayasa Genetika Pada Hewan

Pada prinsipnya rekayasa genetika pada hewan cara kerjanya lebih kurang sama dengan rekayasa genetika tumbuhan, yaitu (1) Identifikasi gen yang diharapkan; (2) Pengenalan kode DNA terhadap gen yang diharapkan; (3) Pengaturan ekpresi gen yang sudah

direkayasa; dan (4) Pemantauan transmisi gen terhadap

keturunannya. Beberapa metode yang sering digunakan dalam teknik rekayasa genetika hewan meliputi pengunaan vektor, kloning, PCR (Polymerase Chain Reaction), dan seleksi, screening, serta analisis rekombinan. Adapun metode tersebut adalah sebagai berikut;

a). Penggunaan Vektor

Vektor merupakan molekul DNA yang membawa suatu DNA asing kedalam sel inang, dengan harapan sifat yang ada pada DNA asing tersebut dapat terekspresi dalam sel inang. Salah satu vektor yang bisa digunakan untuk membawa molekul DNA asing masuk ke dalam sel inang adalah Plasmid. Plasmid digunakan untuk melakukan rekayasa pada berbagai organisme yang tidak bisa diperoleh secara alami.

Plasmid digunakan sebagai vektor dalam rekayasa genetika. Dalam hal ini plasmid digunakan untuk membawa suatu rangkaian fragmen DNA asing masuk dalam sel inang dengan harapan plasmid rekombinan itu mengalami replikasi dan mengekspresikan sifat baru pada DNA asing tersebut, sehingga sifat yang diinginkan dapat diperoleh dari plasmid rekombinan tersebut.

b). Penggunaan Plasmid

Penggunaan plasmid untuk rekayasa genetika harus

disesuaikan kebutuhannya sebab ada berbagai macam plasmid yang digunakan. Proses penggunaan plasmid dalam rekayasa genetika melalui langkah-langkah sebagai berikut :

 Penentuan terlebih dahulu jenis plasmid yang hendak digunakan sebab ada beberapa jenis plasmid seperti pBR 322

dan pUC19 yang bisa digunakan untuk prokariot dan plasmid Ti yang bisa digunakan untuk organisme eukariot.

 Bila plasmid telah ditentukan maka selanjutnya adalah menentukan tempat pengenalan enzim restriksi (pemotongan) yang hendak digunakan sebagai tempat penyisipan DNA asing dan marker untuk menandai masuk tidaknya plasmid pada sel inang.

 Apabila telah diketahui tempat pengenalan restriksi dan markernya maka langkah selanjutnya adalah menyiapkan enzim restriksi sebagai pemotong plasmid. Enzim yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing sehingga nanti keduanya bisa bersatu misal: EcoR1.

 Langkah selanjutnya adalah plasmid dipotong dengan enzim restriksi yang sesuai pada daerah potongannya.

 Plasmid siap disambungkan dengan DNA asing yang memiliki sifat tertentu, yang telah dipotong juga dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotong plasmid.

c). Restriksi sebagai Pemotong Plasmid

Untuk memotong plasmid digunakan enzim restriksi. Enzim restriksi adalah enzim yang digunakan untuk memotong DNA secara spesifik. Enzim restriksi disebut sebagai gunting biologi. Enzim ini diisolasi dari bakteri. Restriksi yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing agar urutan basanya bisa sesuai sehingga antara plasmid dan DNA asing yang disisipkan bisa bersatu. Prinsip kerja enzim restriksi adalah:

 Enzim restriksi yang digunakan adalah enzim endonuklease restriksi. Enzim pemotong ini mengenali DNA pada situs kusus dan memotong pada situs tersebut.

 Situs pengenalan enzim restriksi adalah daerah yang simetri dengan poliandrom, artinya bila kedua utas DNA tersebut masing-masing dibaca dengan arah yang sama akan memberikan urutan yang sama pula nukleotidanya.

 Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif (sticky end) dan ujung rata (blunt end).

d). Enzim Ligase sebagai penyembung plasmid dengan DNA asing

Prinsip kerja enzim ligase sebagai berikut:

 Enzim ligase menyambung dua ujung DNA yang semulanya terpotong

 penyambungan dilakukan dengan cara menyambung 2 ujung

DNA melalui ikatan kovalen antara ujung 3’OH dari utas satu

dengan ujung 5’P dari utas yang lain

 Penggunaan ligasi DNA ini mengkatalis ikatan fosfodiester antara kedua ujung DNA sehingga kedua fragmen DNA yang berupa potongan bisa bersatu menjadi satu.

e). Pembuatan Plasmid Rekombinan

Untuk menciptakan plasmid rekombinan yang mengandung sifat DNA asing yang diinginkan maka dilakukan penyambungan DNA asing engan plasmid yang ada. Plasmid rekombinan terbentuk sebagai sambungan antara plasmid dengan DNA asing, sehingga plasmid tersebut mengandung sifat tertentu yang telah disesuaikan dengan kebutuhan.

Prosedur pembuatan plasmid rekombinan adalah sebagai berikut:  Menyiapkan bakteri yang mengandung DNA asing dengan sifat

tertentu.

 Menyiapkan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor.  Pemotongan DNA asing dengan sifat yang dibutuhkan dengan

enzim restriksi semisal dari E. Coli.

 Pemotongan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor dengan enzim restriksi yang sama yaitu E. Coli.

 Hasil potongan DNA dengan sifat tertentu disambungkan pada plasmid dngan menggunakan enzim penyambung yaitu DNA ligase. DNA ligase akan mengikat ujung 3’OH dengan ujung 5’P dan membentuk ikatan fosfodiester sehingga plasmid dan DNA asing dengan sifat tertentu bisa bersatu.

 Terbentuklah plasmid rekombinan yang membawa DNA asing dengan sifat tertentu tersebut. Plasmid ini siap ditransfer ke dalam sel inang untuk memperoleh organisme transgenik.

Gambar 2.6. Proses pembuatan enzim insulin dari bakteri

 Metode Rekayasa Genetika Pada Tumbuhan

Teknologi pemindahan gen atau tranformasi gen untuk mendapatkan tanaman transgenik dapat dibedakan menjadi 2 yaitu: langsung dan tidak langsung. Contoh transfer gen secara langsung adalah perlakuan pada protoplasma tanaman dengan eletroforasi atau dengan poliethileneglikol (p), penembakan eksplan gen di vortex dengan karbit silikon. Teknik pemindahan gen secara tidak langsung dilakukan dengan bantuan bakteri Agrobakterium tumecien.

Metode ini merupakan metode yang paling sering digunakan dalam tyransfomasi 56loning tanaman pertanian.Agrobacterium yang digunakan yaitu: A. tumefaciens (Plasmid Ti) (Tumor inducing atau penyebab tumor). Cara Kerja:

 Kawasan T-DNA yang terdapat pada meristem sebagai stuktur transformasi dan

 proses perpindahan dilakukan oleh bakteria melalui virulen dalam kromosom dengan cara melukakan jaringan.

 Untuk lokus virulen plasmid Ti yaitu Vir A, VirB, VirD dan VirG yang terlibat

 dalam proses perpindahan T-ADN, sedangkan VirC dan VirE bertindak sebagai peningkatan proses transformasi. Bahan fenolik bertindak sebagai pengesan dan pengatur dan komponen pengesan diberi kode gen VirA dan komponen pengatur diberi kode gen VirG.

Metode transfer DNA yang umum digunakan pada tanaman monokotil adalah elektroporasi dari protoplas, perlakuan peg pada protoplas memudahkan presifitasi DNA dan membuat kontak lebih baik dengan protoplas juga melindungi DNA plasmid mengalami degradasi dari enzim nuklease.

b) Metode Transpeksi (Transformasi Biolistik)

Metode Transpeksi yaitu suatu metode pemindahan gen ke dalam sel-sel atau jaringan melalui penggunaan mikroprojektil seperti tungsten dan emas yang dibungkus DNA.

Cara Kerja:

 Sistem ini menggunakan alat penekan partikel dengan kecepatan tinggi menembus 56loning56 sel seterusnya disatukan ke dalam 56loning sel.

 Cara ini adalah mudah dan cepat tidan tergantung kepada jaringan tanaman.

 Partikel tungsten dilumuri dengan mengendapkan CaCl2 dan spermidin.

 Untuk partikel emas, ADN direndam dalam partikel sebelum dikeringkan ini disebut mikroprojektil

 Kemudian baru digunakan alat 57loning5757

 Mikroprajektil yang telah mengandung ADN diletakkan pada permukaan lapisan makro dan ditekan dengan plat dengan tekanan udara atau listrik.

 Setelah itu Mikroprajektil yang telah mengandung ADN telah menyatu dalam genom tanaman, dan siap dikulturkan (Gambar 2.7 dan 2.8).

Gambar 2.7. Sketsa Mikro projektil

Gambar 2.8. Mesin Biolistik

c). Penembakan Partikel (Gun Gene)

Metode transfer gen ini dioperasikan secara fisik dengan menembakkan partikel DNA langsung ke sel atau jaringan tanaman. Penggunaan senjata gen memberikan hasil yang bersih dan aman meskipun ada kemungkinan terjadi kerusakan sel selama proses penembakan berlangsung.

Cara kerja:

 Membuat partikel DNA tungsen, pembuatan pertikel DNAnya sama cara transeksi pada alat Mikroprajektil.

 Partikel yang terbentuk perannya seperti peluru pada pistol  Selanjutnya siap ditembakkan ke tisu sasaran pada tanaman

yang diinginkan (Gambar 2.9 dan 2.10).

Gambar 2.9. Sketsa cara kerja Pistol penembak gen

d). Metode Elektroporasi (Transformasi Protoplasma)

Transformasi dengan perantaraan protoplasma adalah:

Memasukkan DNA secara langsung ke dalam protoplasma baik dengan cara elektroporasi atau dengan bahan kimia polietilenglikol (PEG).

Metode elektroporasi adalah: Suatu metode memasukkan DNA melalui tenaga listrik dengan perlakuan getaran gelombang listrik dengan intensitas tinggi untuk menghasilkan liang 60loning60 sel untuk tempat masuknya DNA asing kedalam genom sel sasaran. Cara kerja:

 Menginkubasikan protoplasma dalam suasana alkali/basa yang tinggi pada suhu 37ºC selama 30 menit.

 Kemudian tambahkan PEG dengan konsentrasi antara 28-30% (w/v) sehingga dapat menyebabkan terjadinya adhesi secara ekstensif.

 Seterusnya fusi diinkubasi oleh PEG. Protoplasma yang hidup akan dikembangkan ke tanaman lengkap.

 Tingkat keberasilan cara ini mencapai 50%.

Kelemahannya:

Proses regenerasi pembesaran protoplasma menjadi tanaman sempurna dan lengkap agak sukar perlu keahlian khusus.

a. Perlahan tambahkan buffer, pastikan semua gel

terendam dalam buffer; b. Sebagai alternatif bisa

memasukkan sampel setelah buffer dimasukkan (jangan lupa basic dye)

c. Sambungkan kedalam listrik dengan voltase rendah

d. Pasang dalam chamber dan nyalakan saklar listriknya;

e. Umumnya akan selesai dengan waktu satu jam;

f. lampu UV jangan lupa untuk membuat

stainingnya dari Etidium Bromida.

Gambar 2.11. Proses Elektroforesis

e). Metode Pengambilan DNA secara Langsung

Penggunaan metode ini dalam trsnfomasi tumbuhan banyak menimbulkan kontroversi, namun hasilnya cukup positif. Metode ini cukup ringkas dan menggunakan bahan dan alat yang murah, mudah mengaplikasikannya dan waktu yang singkat.

Cara Kerja:

 Teknik pengambilan DNA secara langsung dengan melakukan perendama embrio dalam larutan DNA melalui proses penyerapan selama 10 menit.

 Pengambilan DNA oleh Jaringan tumbuhan yang kering terjadi

disebabkan oleh perubahan ciri fisiokimia sewaktu