Undang-Undang Nomor 19 Tahun 2002, tentang Hak Cipta PASAL 2
(1) Hak Cipta merupakan hak eksklusif bagi Pencipta atau Pemegang Hak Cipta untuk mengumumkan atau memperbanyak ciptaannya, yang timbul secara otomatis setelah suatu ciptaan dilahirkan tanpa mengurangi pembatasan menurut perundang-undangan yang berlaku.
PASAL 72
(1)Barang siapa dengan sengaja dan tanpa hak melakukan perbuatan sebagaimana dimaksud dalam Pasal 2 ayat (1) atau Pasal 49 ayat (1) dan ayat (2) dipidana penjara masing-masing paling singkat 1 (satu) bulan dan/atau denda paling sedikit Rp 1.000.000.00 (Satu Juta Rupiah), atau paling lama 7 (tujuh) tahun dan/atau denda paling banyak Rp5.000.000.000,00 (Lima Miliar Rupiah).
(2) Barang siapa dengan sengaja menyiarkan, memamerkan, mengedarkan, atau menjual kepada umum suatu Ciptaan atau barang hasil pelanggaran Hak Cipta atau Hak Terkait sebagaimana dimaksud pads ayat (1) dipidana dengan pidana penjara paling lama 5 (lima) tahun dan/atau denda paling banyak Rp 500.000.000.00 (lima ratus juta rupiah).
Buku Ajar
BIOTEKNOLOGI
Dr. Zulfarina M.Si
Dr.Imam Mahadi, M.Sc
Penerbit
UR Press Pekanbaru
2019
Buku Ajar
BIOTEKNOLOGI
Penulis:Dr. Zulfarina M.Si dan Dr.Imam Mahadi, M.Sc
Desain Sampul : Zulfarina Tata Letak : Zulfarina Editor: Rapika Sirait
Diterbitkan Oleh UR Press, September 2019
Alamat Penerbit
Badan Penerbit Universitas Riau
Jl. Pattimura No. 9, Gobah Pekanbaru 28132, Riau, Indonesia e-mail: unri_press@yahoo.co.id
ANGGOTA IKAPI
Hak Cipta dilindungi Undang-undang Dilarang mengutip atau memperbanyak
sebagian atau seluruh isi buku ini tanpa izin tertulis dari penulis
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kami panjatkan ke hadirat Allah SWT, yang telah melimpahkan rahmat dan hidayahNya dengan memberikan izin dan kemampuan kepada kami, sehingga kami dapat menyelesaikan Buku Bioteknologi.
Buku Bioteknologi dimaksudkan untuk bahan ajar dalam mata kuliah Bioteknologi Program Magister Pendidikan Biologi. Buku ini mengulas materi tentang proses dalam bioteknologi dan bagaimana aplikasinya dalam kehidupan sehari hari. Melalui buku ini penulis ingin mengajak pembaca untuk mendalami berbagai isu dalam bidang bioteknologi. Buku ini berisi rangkuman isu dan topik bioteknologi yang terdiri atas delapan bab. Bab 1. Materi Genetik (DNA, Gen ,dan Kromosom); Bab 2. Rekayasa genetika; Bab 3.
Ekspresi Gen; Bab 4. Sintesis Protein; Bab 5. Polymerase Chain
Reaction (PCR); Bab 6. Molekular Kloning; Bab 7. Sekuen DNA; Bab 8. Manipulasi Gen pada Tanaman.
Kami menyadari bahwa buku ini masih memiliki kekurangan dan kelemahannya, baik dalam isi maupun sistematikanya. Oleh sebab itu, sangat mengharapkan kritik dan saran untuk perbaikan pada masa yang akan datang. Akhirnya, kami mengharapkan semoga buku ini dapat memberikan manfaat.
Pekanbaru, April 2019
TINJAUAN MATA KULIAH BIOTEKNOLOGI
Bioteknologi merupakan mata kuliah yang disajikan pada mahasiswa Program Pascasarjana Magister Pendidikan Biologi FKIP UNRI. Pengajaran Bioteknologi pada mahasiswa disajikan pada semester satu, dengan jumlah kredit semester 3 SKS dengan kode
Mata Kuliah MKKU 6104.
Mata kuliah ini mengkaji tentang Materi Genetik (DNA, Gen , dan Kromosom), Rekayasa genetika, Ekspresi Gen, Sintesis Protein, Polymerase Chain Reaction (PCR), Molekular Kloning, Sekuen DNA dan Manipulasi Gen pada Tanaman.
Kompetensi umum yang ingin dicapai setelah menyelesaikan mata kuliah ini adalah mahasiswa mampu memahami proses-proses bioteknologi dan aplikasinya dalam kehidupan. Setelah anda selesai mempelajari mata kuliah ini, diharapkan anda dapat :
1. Menjelaskan Materi Genetik (DNA, Gen , dan Kromosom) 2. Menguraikan rekayasa genetika
3. Menjelaskan Ekspresi Gen 4. Menjelaskan Sintesis Protein
5. Menjelaskan Polymerase Chain Reaction (PCR) 6. Menjelaskan Molekular Kloning
7. Menjelaskan Sekuen DNA
Lingkup materi yang akan dibahas pada buku ini terdiri atas 9 Bab yaitu :
Bab 1. Materi Genetik (DNA, Gen , dan Kromosom) Bab 2. Rekayasa genetika
Bab 3. Ekspresi Gen Bab 4. Sintesis Protein
Bab 5. Polymerase Chain Reaction (PCR) Bab 6. Molekular Kloning
Bab 7. Sekuen DNA
Bab 8. Manipulasi Gen pada Tanaman
Petunjuk Belajar
Petunjuk agar anda berhasil dalam mempelajari materi yang ada, dianjurkan kepada anda untuk memperhatikan saran berikut : 1. Pelajari setiap bab secara bertahap dan berulang-ulang sampai
benar-benar mencapai tingkat penguasaan paling sedikit 80 %. 2. Buatlah rangkuman yang memuat konsep-konsep penting dari
setiap bab pada buku catatanmu
3. Kerjakanlah setiap latihan dan test formatif yang ada pada setiap kegiatan belajar
4. Untuk konsep-konsep yang belum anda kuasai, diskusikanlah dengan teman dan dosen saat perkuliahan
DAFTAR ISI
Halaman
Kata Pengantar 5
Tinjauan Mata Kuliah 6
Daftar Isi 8
Daftar Tabel 11
Daftar Gambar 12
BAB I. Materi Genetik (DNA, Gen , dan Kromosom) A. Struktur DNA, GEN dan Kromosom
B. Replikasi DNA
C. Perbedaan DNA dan RNA D. Ekstrak DNA E. Ringkasan F. Latihan 14 15 25 32 34 38 39 BAB II. Rekayasa Genetika
A. Defenisi Rekayasa Genetika
B. Teknik Rekayasa Genetika
C. Vektor D. Primer E. Ringkasan F. Latihan 40 41 43 64 71 77 78 BAB III. Ekspresi Gen
A. Gen dan Ekspresinya B. Pembuktian Ekspresi Gen
C. Faktor yang Mempengaruhi Ekspresi Gen D. Lac Operon E. Ringkasan F. Latihan 79 80 83 84 87 93 93
BAB IV. Sintesis Protein
A. Proses Sintesis Protein B. Transkripsi C. Translasi D. Sintesis RNA E. Ringkasan F. Latihan 94 95 96 99 108 109 BAB V. Polymerase Chain Reaction (PCR)
A. Fungsi PCR B. Prinsip Kerja PCR
C. Komponen dan Regulasi PCR D. Deteksi PCR E. Aplikasi PCR F. Ringkasan G. Latihan 110 111 111 116 118 120 121 122
BAB VI. Molekular Kloning A. Pengertian Kloning B. Proses Kloning
C. Tahapan Molekular Kloning D. Enzim Restriksi dan Ligase E. Perkembangan Kloning F. Ringkasan G. Latihan 123 124 131 132 133 134 135
BAB VII. Sekuen DNA
A. Defenisi Sekuen DNA B. Kegunaan Sekuen DNA C. Cara Membaca Sekuen DNA D. Pembacaan Pohon Filogenetik E. Ringkasan F. Latihan 136 137 138 138 152 162 163
BAB VIII. Manipulasi Gen pada Tanaman
A. Tujuan Manipulasi gen pada Tanaman
B. Tanaman Transgenik
C. Faktor yang mempengaruhi Pembuatan
164 165 168 175
Tanaman Transgenik
D. Contoh Tanaman Transgenik
E. Ringkasan F. Latihan 178 189 189 Lampiran Daftar pustaka 190 Indeks 192 Glosarium 196
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1.1. Jumlah Kromosom dari Beberapa Makhluk Hidup ... 19
2.1. Enzim- Enzim retriksi dan organisme asalnya ... 45
6.1. Karakteristik Enzim Restriksi ... 132
8.1. Jenis-jenis Enzim Rertriksi ... 176
8.2 Tanaman Transgenik yang dimanfaatkan oleh masyarakat Dunia ... 186
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1.1. Struktur kromosom ... 16
1.2. Tipe Morfologi Kromosom ... 18
1.3. Basa nitrogen pada DNA dan RNA ... 21
1.4. Model struktur DNA Watson – Crick ... 22
1.5. Urutan gen ... 24
1.6. Model Replikasi DNA ... 26
1.7. Replikasi DNA ... 27
1.8. Replikasi DNA Sel Prokariotik ... 29
1.9. Replikasi DNA Sel Eukariotik ... 31
1.10. Model Replikasi DNA ... 32
1.11. Perbedaan struktur RNA dan DNA ... 34
1.12. Tahap Ekstrak DNA ... 36
2.1 Proses penambahan ekor homopolimer ... 48
2.2 Proses penambahan ekor linker ... 49
2.3 Proses penambahan ekor Adaptor ... 50
2.4 Pemotongan Enzim retriksi dari Escherichia coli ... 51
2.5 Penyambungan oleh enzim ligase ... 51
2.6 Proses pembuatan enzim insulin dari bakteri ... 55
2.7 Sketsa Mikro projektil ... 57
2.8 Mesin Biolistik ... 58
2.9 Sketsa cara kerja Pistol penembak gen ... 59
2.10 Pistol penembak gen ... 59
2.11 Proses Elektroforesis ... 62
2.12 Rekayasa genetika Pada Tumbuhan ... 64
2.13 Plasmid pada bakteri ... 64
2.14 Plasmid pBR 322 ... 67
2.15 Plasmid Ti ... 68
2.16 Konjugasi pada bakteri ... 70
2.17 Transformasi DNA oleh bakteri ... 70
2.18 Transduksi DNA oleh virus ... 71
2.19 Data sumber gen selulase diperoleh Bacillus subtilis str. DLG ... 73
4.2. Transkripsi ... 97
4.3. Proses Transkripsi ... 98
4.4. Langkah pemrakarsaan: Pembentukan kompleks pemrakarsaan ………..102
4.5. Diagram Pergeseran Ribosoma pada proses sintesis protein ………..…104
4.6. Diagram proses berhentinya sintesis protein ……….…..106
4.7. Kode 20 asam amino ………..…107
5.1 Teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vivo dan in vitro ... 111
5.2 Tahapan proses PCR ... 114
5.3 Penggunaan Elektroforesis ... 119
6.1 Tahapan teknologi Molekular Kloning ... 124
6.2 Peta dari Vektor plasmid pGEM-3Z ... 127
7.1 Mesin Sekuen DNA ... 141
7.2 Sekuen DNA ... 142
7.3 Gel sekuensing metode Sanger yang telah dilabel radioaktif ... 144
7.4 Contoh hasil bacaan suatu sekuensing metode dye terminator ... 146
7.5 Susunan aligment DNA ... 152
7.6 Pohon Filogeni berakar ... 157
7.7 Pohon Filogeni tidak berakar ... 157
7.8 Pohon Filogenetik (MP) ... 159
7.9 Pohon Filogenetik (Kladogram) dari Genus Acropora ... 160
8.1 Cara kerja plasmid Ti ... 171
8.2 Proses pembuatan tanaman transgenik ... 174
8.3 Tahap regenerasi sel tanaman menjadi plantlet ... 175
8.4 Tanaman Transgenik Sengon ... 176
8.5 Tanaman Transgenik Tembakau ... 181
8.6 Proses pembuatan Tanaman tembakau transgenik ... 181
8.7 Proses pembuatan tanaman transgenik kentang bt ... 183
8.8 Proses pembuatan tanaman transgenik Jagung Bt ... 184
BAB I
MATERI GENETIK
Di dalam sel mahluk hidup terkandung materi-materi genetik yang bertanggung jawab dalam pewarisan sifat dari induk kepada keturunannya. Unit-unit hereditas tersebut dikemas dalam kromosom dan akan dipindahkan dari satu generasi ke generasi berikutnya. Materi genetik meliputi Kromoson, gen, DNA dan RNA. Sel akan melakukan regenerasi sel jika sel tersebut akan berkembang. Langkah awal pada proses regerenasi sel dimana akan berkembang membelah diri terlebih dahulu selanjutnya sel akan melakukan penggandaan materi genetiknya melalui replikasi DNA. DNA dapat diisolasi atau dipisahkan dari sel dengan cara diekstrak, DNA ini nantinya dapat digunakan dalam rekayasa genetik untuk menghasilkan suatu sifat atau karakter baru pada suatu mahkluk hidup.
Dalam BAB ini kita akan membincangkan apa-apa saja materi genetik itu? Bagaimana mekanisme penggandaan materi genetik sehingga membentuk suatu gen salinan yang sama. Untuk memudahkan Anda dalam mempelajarinya, maka di dalam bab ini kita akan mempelajari 4 sub BAB yaitu :
A. Struktur DNA, GEN dan Kromosom B. Replikasi DNA
C. Perbedaan DNA dan RNA D. Ekstrak DNA
A. Kromosom, Struktur DNA dan Gen 1. Kromosom
MA
TE
RI G
EN
ET
IK
Kromosom adalah suatu struktur padat terdapat dalam nukleus yang terdiri dari molekul protein dan DNA. Kromosom pertama kali ditemukan oleh Weldeyer pada tahun 1888. Kromosom merupakan suatu kumpulan benda yang halus terbentuk lurus /panjang seperti benang atau bengkok yang terdapat dalam nukleus. Kromosom berasal dari bahasa latin (krom = warna, soma = badan). Jadi kromosom dapat menyerap warna dengan jelas, sehingga dapat diamati dibawah mikroskop elektron. Kromosom berungsi dalam pemindahan sifat-sifat genetik suatu mahkluk hidup.
a. Struktur Kromosom
Kromosom memiliki ukuran yang bervariasi dari setiap jenis mahkluk hidup, berbeda dari satu spesies dengan spesies lainnya.
Ukuran panjang komosom berkisar antara 0,2 sampai 50μ dan
diameter 0,2 sampai 20μ Pada tumbuhan kromosomnya lebih besar berbanding dengan kromosom hewan.
Kromosom akan tampak jelas pada inti sel pada saat sel melalukan pembelahan. Pada fase interfase kromosom-kromosom belum kelihatan jelas, melainkan hanya terlihat adanya benang-benang halus dan panjang. Setelah fase mitosis dalam siklus sel dimulai, benang-benang itu mengalami kontraksi sehingga menjadi pendek dan tebal. Kromosom paling tebal terlihat pada fase metafase.
Struktur terdiri dari dua bagian yang membagi kromosom kromatid dan dibatasi oleh sentromer, sehingga kromosom selalu berpasangan atau ganda. Perhatikan gambar 1.1 struktur kromosom di bawah ini
Gambar 1.1. Struktur kromosom
Struktur kromosom mempunyai beberapa bagian-bagian yang sebagai berikut;
1. Kromonema : Pita yang berbentuk spiral berada dalam
lengan kromosom.
2. Kromomer : Penebalan-penebalan kromonema di
beberapa Tempat.
3. Kromatid : Lengan kromosom yang terdapat kromonema
4. Sentromer : Bagian kepala kromosom, tempat melekatnya
benang spindel, dan membelah menjadi dua lengan kromosom. Juga disebut dengan kinetokor
5. Lekukan sekunder : Tempat terbentuknya nukleolus atau disebut Nucleolar Oraganizer (NOR).
6. Telomer : Ujung kromosom yang berfungi
menghalangi bersambungnya antar
kromosom.
7. Satelit : Bagian tambahan pada kromosom yang
berbentuk bulat dan terletak diujung kromatid Kromosom pada sel Prokariotik seperti pada bakteri melekat pada membran plasmanya yang mengkodekan sebanyak 1000-5000
asam amino. Kromosom bakteri sangat rapat (terkondensasi) yang terdiri dari DNA, RNA dan protein. Selain itu bakteri juga memiliki plasmid yaitu DNA yang berbentuk lingkaran yang berada dalam sitoplasma. Plasmid ini mengkode 20-100 asam amino.
Kromosom pada sel Eukariotik terutaman pada organisma multiseluler memiliki sejumlah kromosom yang sejajar yang ukuran dan jumlahnya berbeda-beda untuk setiap organima. Kromosom sel eukariotik terkondensasi melalui pengemasan DNA secara bertahap. Secara struktural kromosom sel eukariotik memiliki nukleosom yang terdiri dari DNA yang bergulung mengeliligi protein Histon. Sebanyak 200 nukleotida (besper/pasangan basa) membentuk nukleosom bulat seperti bola yang tersusun dari protein histon. Satu nukleosom memiliki 50 bp DNA dan saling berhubungan dengan nukleosom lainnya sehingga membentuk suatu cincin bulai yaitu salenoid. Ini terjadi pada saat interfase. Jika semakin besar salenoid-salenoid tersebut menjadi supersalenoid.
Heterokomatin adalah DNA yang sangat terkondensasi dalam bentuk salenoid selama siklus sel. DNA pada Heterokomatin tidak diekspresikan karena kondisi DNA yang terkondensasi. Selanjutnya pada Eukromatin akan mengurai memanjang saat terjadi replikasi DNA jika dalam bentuk nukleosom. Kromosom jiga memiliki sentomer yaitu suatu daerah yang mengecil saat proses mitosis atau meiosis. Disinilah benang-benang gelendong (spindel) melekat. Sentromer terdiri dari sekuen-sekuen DNA yang kompleks yang disebut dengan Kinetokor. Perbanyakan dan perawatan DNA pada kromosom
memerlukan situs dasar/awal replikasi (origin of replication sites).
Pada ujungnya ini disebut telomer.
Teknik pewarnaan pada kromosom mempunyai suatu pola
spesifik yaitu gelap atau terang yang disebut pita (band). Makin cerah
pita DNA maka semakin berat konsentrasi DNAnya, semakin gelap maka semakin ringan konsentrasi DNAnya. Kromosom yang homolog memiliki pita-pita yang sama.
b. Morfologi Kromosom
Secara morfologi kromosom memiliki beberapa bentuk atau tipe berdasarkan letak sentromernya atau panjang lengan kromosom (Gambar 1.2), sehingga dapat dibedakan mejadi 4 tipe yaitu;
Gambar 1.2. Tipe Morfologi Kromosom
1. Metasentrik
Kromosom yang mempunyai sentromer ditengah, sehingga membagi kromosom menjadi dua lengan yang sama panjang.
Biasanya kromosom membengkok ditempat sentromer
sehingga kromosom berbentuk huruf V.
2. Submetasentrik
Kromosom yang memiliki sentromer tidak ditengah, sehingga kedua lengan kromosom tidak sama panjang. Bila kromosom membengkok ditempat sentromer, maka kromosom berbentuk huruf J.
3. Akrosentrik
Kromosom yang memiliki sentromer tidak ditengah, tetapi sentromer lebih dekat kesalah satu ujung kromosom, sehingga satu lengan sangat pendek dibandingkan lengan kromosom yang lain.
4. Telosentrik
Kromosom yang sentromernya terletak pada salah satu kromosom nya. Sehingga kromosomnya tetap lurus dan tidak terbagi atas 2 lengan saja.
c. Jumlah Kromosom
Banyaknya jumlah suatu kromosom pada makhluk hidup
tergantung pada spesiesnya. Jumlah kromosom pada setiap spesies adalah tetap (konstan). Ada spesies yang memiliki jumlah kromosomnya banyak dan ada yang sedikit. Semakin dekat hubungan kekerabatan suatu spesies maka semakin mendekati persamaan jumlah kromosomnya. Namun tidak ada hubungan secara langsung hubungan kekerabatan dengan jumah kromosom.
Pada mamalia memiliki kromosom dapat berjumlah sekitar
40-70 an yang terbanyak di kalangan vertebrata. Manusia memiliki jumlah kromosom 46 pasang sedangkan hewan anjing lebih banyak lagi jumlah kromosomnya yaitu 78 pasang. Di kalangan hewan antropoid jumlah kromosomnya sekitar 48 pasang. Kelompok hewan tingkat rendah ada yang memiliki ribuan pasang kromosom. Rhizopoda memiliki kromosom 1500 pasang. Sedangkan untuk
bakteri Escherichia coli hanya memiliki 1 pasang kromosom. Untuk
lebih lengkapnya dapat dilihat pada tabel 1.1 di bawah ini. Tabel 1.1. Jumlah Kromosom dari Beberapa Makhluk Hidup
Kelompok Nama umum Nama ilmiah
Jumlah kromosom diploid HEWAN : Protozoa Mollusca Arthropoda Pisces Binatang Selop Bekicot Lalat Rumah Lalat Buah Lebah Madu Ikan Mas Paramaecium aurelia Helix pomatia Musca domestica Drosophila melanogaster Apis mellifica 30-40 54 12 8 32 100
Aves Mamalia Ayam Itik Tikus Marmot Kelinci Anjing Domba Kambing Sapi Simpanse Manusia Rana pipiens Gallus domesticus Anas platyrhyncha Rattus rattus Cavia cobaya Oryctolagus cuniculus Canis familiaris Ovis aries Capra hircus Bos taurus Pan troglodytes Homo sapiens 78 80 42 64 44 78 54 60 60 48 46 TUMBUHAN : Algae Gymnospermae Angiospermae Ganggang Klamidomonas Pinus Kobis Radis Pepaya Chlamydomonas reinhardii Pinus mercusii Brassica oleracea Raphanus sativus Carica papaya 10, 12, 16 (Set haploid) 24 18 18 18 2. Struktur DNA
Deoxyribo Nucleic Acid (DNA) adalah suatu susunan atau polimer asam nukleat yang mengandung informasi genetik yang terdapat di dalam kromosom mahkluk hidup. DNA juga merupakan makro molekul yang berperan sangat penting dalam mewarisi sifat-sifat morfologi, anatomi, fisiologi maupun siat (psikologi) dari individu suatu makhluk hidup.
Struktur DNA pertama kali di temukan oleh James Watson dan Francis Crik pada tahun 1953 memanfaatkan gambar foto sinar-X yang dibuat oleh Wilkins dan Rosalind Franklin. Mereka membuat
model struktur DNA dengan bentuk “untaian ganda” atau Double
helix. Untaian ganda DNA tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang berpilin. Unit terkecil pembentuk asam nukleat disebut “nukleotida” (Gambar 1.2 dan 1.3). Nukleotida ini terdiri dari tiga unsur molekul sederhana:
a. Basa nitrogen yaitu merupakan senyawa organik heterosiklik dengan dua atau lebih atom nitrogen pada cincin kerangkanya. Disebut basa sebab pasangan elektron bebas pada atom nitrogen dapat bertindak sebagai basa lewis.
b. Gula pentosa (gula beratom karbon lima). Pada DNA adalah deoksiribosa.
c. Asam fosfat H-PO, seperti yang akan ditunjukkan, akan
membentuk ester dengan gugus – OH dari gula, sehingga
antar nukleotida terjadi ikatan.
Gambar 1.4. Model struktur DNA Watson – Crick
Kedua rantai ini memiliki arah yang berlawanan. Rantai pertama mempunyai arah dari ujung 5’ – 3’ sedangkan rantai ke dua mempunyai arah dari ujung 3’ – 5’. Ujung 5’ maksudnya ujung 5’-P (5 fosfat) dan ujung 3’ yaitu 3’OH (3 Hidroksida). Misalnya untaian DNA terdiri dari ATGSAATTSSGG maka ditulis 5’-P ATGSAATTSSGG 3’-OH atau 5’ ATGSAATTSSGG 3’.
Kedua rantai tersebut berikatan dengan hidrogen antara basa Adenin (A) dengan Timin (T) dan Guanin (G) dengan Sitosin (S). Ikatan A-T diikat dengan dua hidrogen sedangkan G-S dengan ikatan tiga hidrogen. Kandungan GS berkisar 60% sedangkan AT berkisar
40% pada mahkluk hidup. Nukleotida dibentuk dengan
menkondensasikan basa nitrogen dengan gula pentosa.
Dari Gambar 1.2 di atas bahwa kerangka gula deoksiribosa dan fosfat yang menyusun DNA terletak di bagian luar, sedangkan basa purin dan pirimidin terletak di bagian dalam untaian. Basa-basa purin dan pirimidin terletak pada yang sama dan tegak lurus tehadap rantai untaian DNA. Diameter untaian DNA adalah 20À (amstrong) dengan jarak antara pasangan basa adalah 3,4À. Setiap putaran untaian memiliki 10 pasangan basa.
3. Gen
Gen adalah suatu unit molekul DNA atau RNA berupa untaian yang mengandung informasi genetik yang terdiri dari asam-asam amino. Gen merupakan unit hereditas yang terkecil dari mahkluk hidup. Gen adalah keseluruhan sekuen asam nukleat yang dapat ditranskrip menjadi RNA fungsional dan protein, pada waktu dan tempat yang tepat selama pertumbuhan dan perkembangan organisme. Istilah gen ditemukan oleh W. Johansen pada tahun 1909 pengganti istilah deteminan, faktor atau elemen yang dikemukakan oleh Gegor Mendel. Setiap ekspresi yang ada pada setiap mahkluk hidup baik secara morfologi, anatomi, fisiologi dan karekter sifat memiliki gen yang mengendalikannya.
Gen tersusun dalam satu molekul yang disebut asam deoksiribonukleat (ADN). Gen berada di dalam kromosom yaitu bagian kromomer berbentuk manik-manik. Manik-manik ini berjejer lurus (linear) sepanjang kromosom. Letak gen pada sepasang kromosom disebut Lokus. Lokus ini bersifat tetap, jika terjadi mutasi hanya belaku pada susunan kimianya saja. Lokus ini ditentukan jaraknya dari sentromer yang satuannya disebut unit atau mM (mili Morgan).
Simbol gen ditulis dalam huruf latin, huruf besar untuk gen doninan dan huruf kecil untuk gen resesif. Penulisan simbol ini boleh di sesuaikan dengan nama dari karakter gen tersebut dengan menulis huruf pertamanya.
Jumlah gen dari setiap mahkluk hidup berbeda-beda.
Diperkirakan jumlah gen dalam satu kromosom adalah 1000 gen.
Pada Drosophila memiliki 4 pasang kromosom sehingga jumlah gen
Drosophila adalah 4 x 1000 = 4000 gen, jika mengacu pada Drosophila maka pada manusia memiliki 46 pasang kromosom sehingga diperkirakan memiliki gen sebanyyak 46.000-50.000 gen. Namun di awal tahun 1980-an setelah ditemuka struktur DNA maka jumlah gen dalam suatu sel manusia diperkirakan lebih dari 10 juta gen.
Badan komosom selalu berpasangan maka gen juga digambarkan sepasang. Kromosom homolog memiliki kandungan gen yang sama. Setiap kali sebelum suatu sel membelah masing-masing kromosom membuat duplikasinya dengan gen-gen yang sama dalam urutan yang sama. Maka bila terjadi dua sel anak, masing-masing akan menerima kromosom-kromosom dan gen-gen dari tipe dan jumlah yang sama (Gambar 1.5).
Gambar 1.5. Urutan gen
Gen memiliki regulasi dalam proses pengkopian gen gen baru yang sama atau indentik. Sebelum penemuan DNA, telah diketahui bahwa gen adalah unit fisik dan fungsional dari hereditas yang mengandung informasi untuk sintesis protein. Jadi gen mengandung informasi hereditas. Gen-gen membawa informasi yang harus dikopi secara akurat untuk ditransmisikan kepada generasi berikutnya. Sekarang pertanyaannya adalah bagaimana suatu informasi dapat diformulasikan dalam bentuk molekul kimia? Bagaimana molekul tersebut dapat dikopi secara akurat? Pada tahun 1940-an, peneliti menemukan bahwa informasi genetik terutama terdiri dari instruksi untuk membentuk protein. Protein adalah molekul makro yang berperan dalam hampir semua fungsi sel yaitu: sebagai bahan pembangun struktur sel dan membentuk enzim-enzim yang mengkatalisis reaksi-reaksi kimia di dalam sel; meregulasi ekspresi gen, memungkinkan sel untuk bergerak dan berkomunikasi antar sel.
Jadi fungsi paling penting dari DNA adalah membawa gen yang mengandung informasi yang menentukan jenis protein yang harus disintesis, kapan, dalam tipe sel yang mana, dan seberapa banyak jumlah protein yang harus disintesis.
Komposisi gen adalah daerah pengkode (exon and intron) yang mengkode RNA atau protein+sekuen-sekuen pengaturan (Regulatory sequences): termasuk. promoter yang menginisiasi terjadinya transkripsi, enhancer/silencer yang menentukan tinggi rendahnya aktivitas transkripsi, polyadenylation site, splicing sites serta signal terminasi transkripsi).
Produk gen: RNA yang kemudian ditranslasi menjadi protein. Hanya RNA seperti rRNA, tRNA dan mRNA. Satu gen mempunyai potensi menghasilkan banyak produk karena adanya
promoter-promoter yang berbeda alternative splicing.
B. Replikasi DNA
Replikasi DNA adalah suatu proses perbanyakan bahan genetik atau DNA. Sering juga disebut penggandaan DNA. Setiap mahluk hidup akan mengalami pertumbuhan dan perkembangan yang pada prrinsipnya memperbanyak jumlah sel di dalam tubuh mahklum hidup tersebut. Setiap sel di perbanyak maka harus melalui proses pembelahan sel yang di mulai dengan jalan menyalin dan memperbanyak bahan genetik atau DNA. Tujuan repikasi DNA ini adalah untuk menyimpan informasi genetik dan membuat salinannya yang akan di turunkan ke generasi berikutnya.
Watson dan Crick menjelaskan bahwa replikasi DNA karena putusnya ikatan hidrogen yang menghubungkan pasangan-pasangan basa. Dengan terputusnya ikatan ini akan membentuk pita DNA komplementer. Proses replikasi DNA terjadi apa bila salah satu pita
dari double helix terbaca 5’ SAATASTAGA 3’ maka pita
komplementer (anti kodonnya) mereplikasi dengan 3’ GTTATGATST 5’. Ini yang di sebut pita poli nukleotida baru. Kajian ini didukung Meselson dan Stahl yang telah meneliti pada replikasi sel-sel E coli
keturunan pada dua generasi sel-sel mengandung satu untaian induk dan satu untaian yang baru dibuat, ini disebut semi konservatif.
Sebelum terjadi terjadi pembelahan sel, maka bahan genetik mengalami penggandaan terlebih dahulu atau replikasi yaitu;
Bahan : Nukleotida
Tempat : Kromatin
Pelaksana : Enzim Helikase, DNA polimerase, Protein pengikat DNA jalin tunggal, Ligase dan Primase dan ATP Pada saat enzim DNA polimerase bergerak pada benang kromatin, maka kedua pita DNA melepaskan diri dari pilinan, kemudian masing-masing mencetak DNA anak seperti DNA mencetak mRNA pada transkripsi. Hanya saja disini gulanya tetap deoksiribosa dan basanya tetap A, T, G dan S. DNA anak tersebut (anti kodon) akan berpilin dengan DNA induk (kodonnya) membetuk pasangan DNA baru. (Gambar 1.6).
Gambar 1.6. Model Replikasi DNA
1. Replikasi DNA Sel Prokariotik
Replikasi Kromosom sel prokariotik seperti pada Escherhicia
coli dimulai dari titik awal replikasi (oriR) yang berlangsung ke dua
arah menuju situs terminasi yang terletak di tengah kromosom sirkuler (pasmid). Selama replikasi untaian ganda DNA dalam kedaaan terbuka. Berikut prosesnya;
Replikasi dimulai pada saat protein (polimer asam amino) yang
dikode oleh Dna-A berikatan dengan sekuen berulang
sepanjang 9-mer pada titik awal replikasi (oriR).
Selanjutnya enzim helikase sebagai Dna-B dan protein
inhibitor Dna-C berikatan dengan sekuen repetitif (berulang) sepanjang 13-mer. Helikase (Dna-B) bergerak dari 5’-3’ untuk membuka pilinan DNA. Terbukanya pilinan DNA ini mendorong membentuk superheliks pada pilinan DNA yang belum terbuka akibat terdesak. Untuk mengurai superheliks diberi enzim DNA-girase. Sedangkan Protein pengikat berantai tunggal (Singel-stranded binding protein, SSBP) berperan menstabilkan pilinan DNA yang sedang terbuka.
Kemudian enzim Primase dikode dengan Dna-G bersama
enzim helikase membentuk sistem enzim kompleks yaitu primosom yang mensintesis primer.
Sebanyak 2 PolC (DNA polimerase III) bergabung dengan
cetakan DNA ujung 3’ dan memulai polimerisasi menjadi untaian DNA. Pada saat berlansung DNA-girase terus menerus bertugas menghilangkan superheliks. Cetakan DNA memberi sinyal pada primase pada primosom untuk melakukan polimerisasi primer RNA sepanjang 30 nukleotida satu garpu replikasi.
PolC melakukan polimerisasi dari ujung 5’-3’ dari setiap garpu
replikasi sehingga mencetak nukleotida DNA. Sementara untaian kedua DNA polimerisasi menjauhi garpu replikasi.
Seiring terus membukanya pilinan DNA, satu primer baru akan
disintesis menjauhi garpu replikasi dan DNA polimerase akan mencetak DNA dari primer baru yang berasal dari RNA polimerase. DNA akan memilih nukleotida sesuai dengan
komplementernya ini yang disebut fragmen atau untai Leading. Sedangkan untainya terputus-putus disebut fragmen atau untai Lagging atau fragmen Okazaki.
Primer RNA akan dihilangkan oleh enzim DNA polimerase I
dengan kode PolA. Enzim ini akan menggunakan DNA tetangga sebagai primer dan meneruskan polimerisasi DNA.
Di akhir replikasi, celah-celah (nick) yang terdapat dalam
utaian DNA akan disambung oleh enzim DNA ligase sehingga fragmen-fragmen DNA tersambung. Jika semua kegiatan replikasi DNA ini selesai, maka akan masuk enzim topoisomerase IV yang akan memisahkan kromoson baru yang terbentuk. Maka selesailah replikasi DNA pada bakteri tersebut (Gambar 1.8).
2. Replikasi DNA Sel Eukariotik
Replikasi Kromosom sel eukariotik contohnya pada jamur
umumnya dimulai dari situs titik awal replikasi otonom (ARS). Berikut
proses replikasi DNA sel eukariotik.
Pertama garpu replikasi ke dua arah situs awal tersebut.
sekuen situs titik awal replikasi otonom (ARS) ini memiliki dua
kawasan yang mengikat set protein berbeda yang membuat pilinan ganda DNA tidak stabil. Pada salah satu kawasannya
terdapat kawasan lestari yang disebut origin recognition
complex (ORC) yang memiliki 11-mer berulang saling berikatan membengkok dengan kawasan protein non lestari yang mengakibatkan terpisahnya untai DNA pada situs ARS. Maka dimulailah replikasi sistesa primer RNA.
Enzim-enzim yang terlibat dalam Replikasi DNA sel eukarotik
sama dengan enzim yang terlibat pada replikasi DNA pada sel prokariotik.
Selanjutnya prosesnya adalah sama, dimana enzim
Topoisomerase, helikase dan RNA polimerase akan
melakukan tugasnya seperti pada replikasi DNA sel prokariotik. DNA Topoisomerase I terlibat dalam penguraian super salenoid pada DNA yang sedang membuka. Sedangkan helikase membuka pilinan untaian DNA.
Ada 5 jenis enzim DNA polimerase berbeda yang terlibat pada
replikasi DNA sel eukariotik yaitu;
- DNA polα yang bertugas mensintesa untai lagging DNA.
- DNA polδ yang bertugas mensintesa untai leading DNA.
- DNA polδ dan DNA polβ sebagai enzim ligase
menyambung atau menghilangkan gap (nik) antara
nukleotida timbul saat primer RNA hilang oleh enzim pemotong yakni endonuklease.
- DNA polγ melaksanakan replikasi DNA dalam
mitokondria.
Selanjutnya primer RNA yang terdapat disetiap ujung kromosom hilangdan diganti dengn DNA. Dalam hal ini dipelukan primer DNA. DNA polimerase adalah enzim telomerase yang bertugas mencetak untai DNA telomer yang
berfungsi menjaga ukuran panjang kromosom. Tahap akhir Replikasi DNA eukariota tersambungnya untaian DNA baru. Maka selesai proses Replikasi DNA pada sel eukaryota (Gambar 1.9)
Gambar 1.9. Replikasi DNA Sel Eukariotik
Metode replikasi DNA dapat terjadi sebagai berikut: 1. Semi Konservatif
Pita double helix dari molekul DNA yang lama membuka
dengan perantaraan enzim helikase kemudian di samping pita yang lama membentuk pita DNA baru. Ini sesuai dengan pendapat Watson dan Crick didukung oleh Meselson dan Stahl. 2. Konservatif
Melekul DNA pita lama tetap tidak berubah, dimana double
helix tidak membuka, terbentuk melokul DNA yang terdiri dari dua pita baru. Molekul DNA anak tidak mengandung bagian dari molekul DNA induk.
3. Diversif
Melekul DNA pita lama putus menjadi beberapa bagian dan dari potongan-potongan pita tersebut dibentuk DNA baru.
Gambar 1.10. Model Replikasi DNA C. Perbedaan DNA dan RNA
Sebuah sel selain mempunyai DNA, kebanyakan sel-sel
prokaryota dan eukaryota memiliki asam nukleat yang lain yaitu asam ribonukleat (RNA). Virus tembakau dan virus influenza tidak memiliki DNA hanya memiliki RNA saja maka dinamakan RNA genetik. Berikut perbedaan DNA dengan RNA adalah sebagai berikut;
Antara DNA dan RNA terdapat beberapa perbedaan, yaitu : 1. Bentuk dan ukuran:
Molekul DNA berupa Double helix, sedangkan molekul RNA berbentuk pita tunggal (“Single Strand”). Pada umumnya molekul RNA lebih pendek dari pada molekul DNA.
2. Susunan kimia:
Molekul DNA juga merupakan polimer nukleotida, namun ada perbedaannya, ialah :
a. Gula yang menyusun DNA adalah deoksiribosa.,
sedangkan pada RNA adalah ribose.
b. Basa pirimidin yang menyusun pada DNA adalah timin dan
3. Lokasi:
DNA umumnya terdapat didalam inti. Ada sedikit DNA terdapat didalam mitokondria dan kloroplas. RNA terdapat dibagian lain dari sel, tergantung dari macam RNA.
a. mRNA atau RNA duta, dibuat didalam nukleus dan
kemudian dikeluarkan di sitoplasma. M RNA oleh DNA, namun harus diingat bahwa basa A dari pita DNA akan berpasangan dengan basa U dan RNA. Contohnya :
3΄- CATGACCTAAAGTCCTGA -5΄
DNA 5΄- GTACTGGATTTCAGGACT- 3΄ Double helix “
RNA 3΄- CAUGACCUAAAGUCCUGA -5΄ Pita tunggal
b. tRNA, berbentuk seperti daun daun semanggi , dan
terdapat didalam sitoplasma.
c. rRNA, yang bersama protein membentuk ribosom berupa
butiran halus didalam sitoplasma. 4. Fungsi:
DNA berfungsi membawa informasi/ keterangan genetik, sehingga segala “perintah “yang ada hubungannya dengan sifat keturunan diberikan oleh DNA. Adapun fungsi RNA tergantung dari macam RNA (lebih lanjut dibahas pada transkripsi dan translasi).
Gambar 1.11. Perbedaan struktur RNA dan DNA
D. Ekstrak DNA
Identifikasi molekuler memerlukan tahapan awal yaitu isolasi DNA atau dikenal dengan istilah ‘ekstrak DNA’. Hasil ektrak tersebut menghasilkan DNA genom. DNA genom adalah seluruh DNA yang ada pada organisme baik yang berfungsi ataupun tidak berfungsi yang berada di inti sel, mitikondia dan kloroplas. Prinsip ekstrak DNA adalah untuk mendapatkan DNA murni yang tidak tercampur dengan komponen sel lainnya seperti protein dan karbohidrat serta bahan metabolit sekunder lainnya.
Kita dapat melakukan suatu ekstrak DNA melalui berbagai sumber untuk mendapatkan DNA. DNA dapat ekstrak dari sampel segar tanaman, Bakteri, darah dan daging atau bagian organ lainnya dari manusia dan hewan. Perlu diingat bahwa untuk mendapatkan hasil ekstrasi DNA yang baik sebaiknya menggunakan sampel
Ekstrak DNA genom dapat dilakukan dengan metode lisis sel secara fisik dan kimia. Secara fisik sel dipecah dengan kekuatan
mekanik yaitu secara freeze thaw, bead mill homogenization dan
resonansi misalnya dengan sonikasi. Seperti sampel tanaman yang diawetkan atau sampel kering beku, tetapi untuk mendapatkan DNA yang berkualitas baik maka sampel segar tanaman. Penelitian
Bhattacharjee, et al (2009) menunjukkan bahwa penyimpanan
sampel daun dalam 20oC lebih dari 1 minggu sebelum isolasi DNA
dapat menurunkan kuantitas dan kualitas DNA. Kuantitas dan kualitas DNA genom yang diisolasi dari jaringan tanaman juga dipengaruhi oleh kandungan polisakarida, metabolit sekunder, tanin, dan polifenol. Metode lisis secara kimia yaitu sel dirusak dengan buffer lisis
berisi senyawa kimia yang dapat merusak integritas barrier membran
atau dinding sel misalnya Sodium Dedocyl Sulfate (SDS) dan
Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) (Cheng, et al., 2003). Larutan buffer adalah suatu sistem dalam larutan yang terdiri dari campuran basa lemah dan asam konjugatnya atau asam lemah dan basa konjugatnya, yang berfungsi untuk mempertahankan perubahan pH larutan walaupun ditambahkan sedikit asam kuat atau basa kuat. Larutan buffer yang digunakan dalam isolasi DNA terdiri dari beberapa senyawa yang memiliki fungsi berbeda. Sel tumbuhan
diperlakukan dengan senyawa sabun untuk mendegradasi
kandungan lipid.
Tahapan pada proses ekstrak DNA adalah ekstraksi dan pelisisan sel secara dapat dilakukan secara mekanik maupun kimia melalui penggerusan serta penggunaan garam dan detergen. Ekstraksi DNA meliputi tahap lisis, presipitasi dan purifikasi (gambar 1.12). Pencernaan protein (purifikasi) menggunakan enzim proteinase dan presipitasi DNA dari bahan yang lain yang tidak diinginkan menggunakan isopropanol, etanol atau alkohol dingin. Proses presipitasi yang akan mengendapkan DNA sehingga DNA menggumpal membentuk suatu fiber.
Gambar 1.12. Tahap Ekstrak DNA
1. Tahap Lisis
Tahap pertama dalam ekstrak DNA adalah lisis atau proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) dinding sel yang telah terdegradasi mengakibatkan DNA beserta isi sel keluar. DNA yang masih tercampur dengan kontaminan dipisahkan melalui proses ekstraksi. Kontaminan yang bercampur dengan DNA meliputi lemak, polisakarida, fenolik dan protein. Proses ekstraksi DNA biasanya menggunakan pelarut organik seperti kloroform dan isoamil alkohol (CIAA). Kloroform
mendenaturasi protein sedangkan isoamil alkohol untuk
menghilangkan busa.
Selanjutnya adalah penambahan larutan organik menyebabkan
campuran membentuk lapisan. Lapisan atas (supernatan)
mengandung DNA dan RNA karena bersifat polar oleh muatan negatif atom Oksigen pada gugus fosfat yang berinteraksi dengan muatan dipole positif air. Sehingga meningkatkan kelarutan DNA di air. Protein yang terdenaturasi akan masuk diantara lapisan organik
TAHAPAN
1. Penghancuran (Lisis)
2. Ekstraksi atau pemisahan DNA (Presipitasi)
dasar tabung setelah sentrifus. Lemak dan protein nonpolar mudah
larut dalam kloroform sehingga terdistribusi pada lapisan
organik/dasar. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi. Sentrifugasi adalah teknik pemisahan bahan berdasarkan berat molekul dengan kecepatan tertentu. Teknik ini digunakan untuk memisahkan atau memurnikan protein, partikel dan organel seluler yang sedimentasi
menurut ukuran dan bentuk relatifnya. Partikel biasanya
disuspensikan dalam medium tertentu yang dimasukkan ke dalam
tabung di tengah drive shaft sentrifus.
2. Tahap Presipitasi
Proses presipitasi DNA merupakan proses pengendapan DNA. Pengendapan DNA dibantu oleh etanol absolute/isopropanol atau garam ammonium asetat. Etanol absolut/isopropanol dingin akan memekatkan DNA dan menghilangkan residu kloroform. DNA yang bercampur etanol dingin akan menggumpal dan membentuk pellet di lapisan bawah. Etanol/isopropanol menghilangkan air disekitar.
3. Tahap Purifikasi
Proses purifikasi atau pemurnian hasil ekstrak DNA adalah dalam bentuk pellet DNA. Pencucian ini penting karena kemungkinan pellet DNA yang dihasilkan masih mengandung sisa kontaminan dari bahan-bahan lain dari organisme tersebut. Untuk pencucian DNA biasanya digunakan alkohol absolut arau etanol 70%. Pellet DNA yang telah murni dilarutkan dengan buffer TE bertujuan untuk menjaga sampel DNA agar tetap stabil.
Contoh ekstrak DNA pada tanaman yang telah di adaptasi dari Doyle & Doyle (1990) adalah sebagai berikut:
- Daun dibersihkan dengan alkohol kemudian ditimbang
- Disiapkan larutan Nitrogen cair atau dengan deterjen
dilarutkan sebanyak 2 ml + 10 ml aquades.
- Daun dipotong kecil dan dimasukkan ke dalam mortar
kemudian di tambahkan 0,6 gr NaCl (garam) dan larutan sabun.
- Hasil saringan dipindahkan ke tabung mikro 50 ml
- Ditambah isopropanol dingin
- Diamati benang-benang DNA yang terbentuk
- Untuk ke tahap elektroforesis, gumpalan DNA dipisahkan
terlebih dari larutan dengan cara sentrifugasi
- Larutan disentrifuge pada kecepatan 4000rpm selama 10
menit
- Fase cair dibuang dan fase padat (pelet) dikeringkan
- Dikeringkan dan diberi 5µl buffer TE pH 8
- Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruangan (37C)
- Siap di lihat dengan alat elektroforesis
RINGKASAN
Kromosom merupakan suatu kumpulan benda yang halus terbentuk lurus /panjang seperti benang atau bengkok yang terdapat dalam nucleus yang berungsi dalam pemindahan sifat-sifat genetik suatu mahkluk hidup.
Memiliki Ukuran panjang komosom berkisar antara 0,2 sampai 50μ dan
diameter 0,2 sampai 20μ, Struktur kromosom mempunyai beberapa bagian-bagian yaitu Kromonema, Kromomer, Kromatid, Sentromer Lekukan sekunder, Telomer, Satelit. kromosom memiliki beberapa bentuk atau tipe berdasarkan letak sentromernya atau panjang lengan kromosom yaitu Metasentrik, Metasentrik, Akrosentrik, Telosentrik,
Deoxyribo Nucleic Acid (DNA) adalah suatu susunan atau polimer asam nukleat yang mengandung informasi genetik yang terdapat di dalam kromosom mahkluk hidup. DNA juga merupakan makro molekul yang berperan sangat penting dalam mewarisi sifat-sifat morfologi, anatomi, fisiologi maupun siat (psikologi) dari individu suatu makhluk hidup. Struktur DNA pertama kali di temukan oleh James Watson dan Francis Crik pada tahun 1953. Unit terkecil
pembentuk asam nukleat disebut “nukleotida” (Gambar 1.2 dan 1.3).
Nukleotida ini terdiri dari tiga unsur molekul sederhana yaitu Basa nitrogen, Gula pentosa, Asam fosfat H-PO.
Gen adalah suatu unit molekul DNA atau RNA berupa untaian yang mengandung informasi genetik yang terdiri dari asam-asam amino. Dan merupakan unit hereditas yang terkecil dari mahkluk
deoksiribonukleat (ADN). Gen berada di dalam kromosom yaitu bagian kromomer berbentuk manik-manik. Manik-manik ini berjejer lurus (linear) sepanjang kromosom. Letak gen pada sepasang kromosom disebut Lokus. Lokus ini bersifat tetap, jika terjadi mutasi hanya belaku pada susunan kimianya saja
Watson dan Crick menjelaskan bahwa replikasi DNA karena putusnya ikatan hidrogen yang menghubungkan pasangan-pasangan basa. Dengan terputusnya ikatan ini akan membentuk pita DNA komplementer. Proses replikasi DNA terjadi apa bila salah satu pita
dari double helix terbaca 5’ SAATASTAGA 3’ maka pita
komplementer (anti kodonnya) mereplikasi dengan 3’ GTTATGATST 5’. Ini yang di sebut pita poli nukleotida baru. Replikasi Kromosom sel
prokariotik seperti pada Escherhicia coli dimulai dari titik awal
replikasi (oriR) yang berlangsung ke dua arah menuju situs terminasi
yang terletak di tengah kromosom sirkuler (pasmid). Selama replikasi untaian ganda DNA dalam kedaaan terbuka. Replikasi Kromosom sel eukariotik contohnya pada jamur umumnya dimulai dari situs titik awal
replikasi otonom (ARS). Metode replikasi DNA dapat terjadi sebagai
berikut: Semi Konservatif, Konservatif,Diversif.
Tahapan pada proses ekstrak DNA adalah ekstraksi dan pelisisan sel secara dapat dilakukan secara mekanik maupun kimia melalui penggerusan serta penggunaan garam dan detergen. Ekstraksi DNA meliputi tahap lisis, presipitasi dan purifikasi
LATIHAN
1. Jelaskan struktur kromosom dan fungsi bagian-bagiannya 2. Jelaskan mengenai struktur DNA
3. Jelaskan proses replikasi DNA pada sel eukariotik 4. Uraikan cara melakukan ekstraksi DNA pada tanaman. 5. Jelaskan kegunaan dari ekstrak DNA.
BAB II
REKAYASA GENETIKA
Penemuan struktur DNA menjadi titik yang paling pokok dalam kemajuan bioteknologi modern karena dari sinilah manusia kemudian dapat menentukan bagaimana sifat dapat diubah dengan mengubah komposisi DNA, yang adalah suatu polimer bervariasi. Tahap-tahap penting berikutnya adalah serangkaian penemuan enzim restriksi (pemotong) DNA, regulasi (pengaturan ekspresi) DNA (diawali dari penemuan operon laktosa pada prokariota), perakitan teknik PCR, transformasi genetik, teknik peredaman gen (termasuk interferensi RNA), dan teknik mutasi terarah (seperti Tilling).
Sejalan dengan penemuan-penemuan penting itu,
perkembangan di bidang kerekayasaan genetika semakin berkembng pesat.
Penelitian yang memberikan kontribusi terbesar bagi
rekayasa genetika adalah penelitian terhadap transfer
(pemindahan) DNA bakteri dari suatu sel ke sel yang lain melalui lingkaran DNA kecil yang disebut Plasmid. Plasmid adalah gen yang melingkar yang terdapat dalam sel bakteri, tak terikat pada kromosom. Melalui teknik plasmid dalam rekayasa genetika tersebut, para ahli di bidang bioteknologi dapat mengembangkan tanaman transgenik yang resisten terhadap hama dan penyakit serta mendapatkan hasil ternak yang unggul. Pada BAB ini kita mempelajari mengenai defenisi, metode, teknik dan mekanisme dalam melakukan rekayasa genetika. BAB ini terdiri dari beberapa sub BAB yaitu;
A. Defenisi Rekayasa Genetika B. Teknik Rekayasa Genetika C. Vektor D. Primer
REKAYA
SA
GE
NE
TIK
A
A. Defenisi Rekayasa Genetika
Rekayasa Genetika adalah suatu teknik penyusunan DNA baru dengan mereka ulang suatu DNA organisme dengan cara menyisipkan suatu gen yang diinginkan ke dalam lingkungan
genetiknya. Rekayasa genetika juga dapat diartikan sebagai kegiatan
manipulasi gen untuk mendapatkan produk baru dengan cara membuat DNA Rekombinan melalui penyisipan gen. Sedangkan DNA
rekombinan adalah DNA yang urutannya telah direkombinasikan agar
memiliki sifat-sifat atau fungsi yang kita inginkan sehingga organisme penerimanya mengekspresikan sifat atau melakukan fungsi yang kita inginkan. Dengan keberasilan cara rekayasa genetik ini dianggap suatu jalan yang lebih cepat untuk mendapatkan suatu organisme unggul sehingga disebut kemajuan bioteknologi modern.
Rekayasa genetika diperkenalkan oleh Crick dan Watson pada tahun 1953 setelah mereka menemukan struktur DNA. Rekayasa genetika merupakan suatu rangkaian metode yang canggih dalam perincian tetapi sederhana dalam hal prinsip yang memungkinkan untuk dilakukan pengambilan gen atau sekelompok gen dari sebuah sel kemudian mencangkokkan gen tersebut pada sel lain dimana gen tersebut mengikat diri dengan gen atau sekelompok gen yang sudah ada dan bersama-sama menanggung reaksi biokimiawi penerima. Kita ketahui bahwa setiap makhluk hidup terdiri atas jutaan sel individu yang masing-masing sel tersebut mengandung satu set gen yang 41loning. Gen-gen tersebut berfungsi memberikan perintah-perintah biologi yang hanya mengeluarkan satu dari ribuan perintah-perintah yang diperlukan untuk membangun dan menjaga kelangsungan suatu makhluk hidup serta menentukan penampakan yang dimunculkan dalam bentuk fisik maupun siat dari suatu makhluk hidup.
Suatu organisme memiliki gen-gen yang tersusun atas deoxyribonucleic acid atau asam deoksiribonukleat (DNA). DNA merupakan molekul yang mengkode perintah-perintah biologi di dalam struktur kimianya. Struktur kimia DNA seperti sebuah rangkaian basa nitrogen dalam bentuk sekuen polimer yang berisi pesan-pesan 41loning. Surat-surat itu hanya memiliki empat huruf
menurut abjad 42loning (Adenin/A, Guanin/G, Timin/T, dan Cytosin/C) yang disebut nulkeotida. Setiap gen mengandung ribuan rantai basa yang tersusun menjadi sebuah rangkaian dimana gen tersebut berada dalam kromosom sebuah sel. DNA mudah diekstraksi dari sel-sel, dan kemajuan biologi molekuler sekarang memungkinkan ilmuwan untuk mengambil DNA suatu spesies dan kemudian menyusun konstruksi molekuler yang dapat disimpan di dalam laboratorium. DNA yang telah mengalami penyusunan molekuler tersebut disebut DNA rekombinan sedangkan gen yang diisolasi dengan metode tersebut dinamakan gen yang diklon. DNA rekombinan ini dapat dipindahkan ke makhluk hidup lain bahkan yang berbeda jenisnya. Hasil dari perpaduan tersebut menghasilkan makhluk hidup rekombinan yang memiliki kemampuan baru dalam melangsungkan proses hidup dan bersaing dengan makhluk hidup lainnya. Dengan kata lain makhluk hidup rekombinan memiliki sifat unggul bila dibandingkan dengan makhluk hidup asalnya.
Bioteknologi bukan merupakan hal baru bagi peradaban manusia karena pembuatan tempe, tape, kecap, dan tuak telah menunjukkan adanya pemanfaatan mikroba untuk mengubah bahan dasar menjadi bahan yang bernilai ekonomis dalam taraf sederhana atau tradisional. Bioteknologi tradisional bersifat sederhana dengan menggunakan jasad renik (mikroba) alami yang pada mulanya penggunaannya bersifat untung-untungan belum berdasarkan ilmiah. Sedangkan bioteknologi modern saat ini menggunakan organisme hasil rekayasa 42loning melalui perlakuan yang mengubah landasan penentu kemampuan hidup, yaitu mengubah tatanan gen yang menentukan sifat spesifik suatu organisme, sehingga proses pengubahan dapat berlangsung secara lebih efisien dan efektif. Selain itu dituntut pula untuk hasil yang lebih komersial. Pada awal perkembangannya metode perpindahan gen hanya dapat dilakukan antara satu jenis makhluk hidup, akan tetapi dikemudian hari gen dapat dipindahkan dari satu jenis ke jenis organisme lainnya dan teknik rekaraa genetik ini sangat cepat berkembang dengan pesat hingga sekarang.
Salah satu penelitian yang memberikan kontribusi terbesar bagi rekayasa genetika adalah penelitian terhadap transfer (pemindahan) DNA bakteri dari suatu sel ke sel yang lain melalui lingkaran DNA kecil yang disebut Plasmid. Plasmid adalah gen yang melingkar yang terdapat dalam sel bakteri, tak terikat pada kromosom. Melalui teknik plasmid dalam rekayasa genetika tersebut, para ahli di bidang bioteknologi dapat mengembangkan tanaman transgenik yang resisten terhadap hama dan penyakit.
Penemuan struktur DNA menjadi titik yang paling pokok karena dari sinilah orang kemudian dapat menentukan bagaimana sifat dapat diubah dengan mengubah komposisi DNA, yang adalah suatu
polimer bervariasi. Tahap-tahap penting berikutnya adalah
serangkaian penemuan enzim restriksi (pemotong) DNA, regulasi (pengaturan ekspresi) DNA (diawali dari penemuan operon laktosa pada prokariota), perakitan teknik PCR, transformasi genetik, teknik peredaman gen (termasuk interferensi RNA), dan teknik mutasi terarah (seperti Tilling). Sejalan dengan penemuan-penemuan penting itu, perkembangan di bidang biostatistika, bioinformatika dan robotika/automasi memainkan peranan penting dalam kemajuan dan efisiensi kerja bidang ini.
Dalam rekayasa genetika, ada kode etik yang melarang keras percobaan ini pada manusia. Akan tetapi, para ahli tidak selamanya bersikap kaku sebab berbagai penyakit fatal memang sulit disembuhkan kecuali dengan terapi genetik. Maka muncul pendapat tentang perlu adanya dispensasi. Dispensasi itu dikeluarkan oleh Komite Rekayasa Genetika dari Nasional Institute of Health (NIH) Amerika Serikat pada pertengahan tahun 1990.
B. Teknik Rekayasa Genetik
1. Prisip-prinsip Rekayasa Genetika
Dalam melakukan kegiatan pembuatan rekayasa genetika harus memperhatikan prinsip-prinsip kerja. Secara umum terdiri dari 5 prinsip yaitu;
3) Menyisipkan gen yang diinginkan kealat pembawa 4) Memasukan gen kedalam sel inang
5) Organisme siap diregenerasikan
Prinsip ini akan dibincang secara lengkap dalam tahap pelaksanaan rekayasa genetika.
2. Faktor Utama Rekayasa Genetika
Pada teknik rekayasa genetik proses penyisipan gen diperlukan tiga faktor utama yaitu:
a) Vektor, yaitu pembawa gen asing yang akandisisipkan,
biasanya berupa plasmid, yaitu lingkaran kecil DNA yang terdapat pada bakteri. Plasmid diambil dari bakteri dan disisipi dengan gen asing.
b) Bakteri, berperan dalam memperbanyak plasmid. Plasmid di
dalam tubuh bakteri akan mengalami replikasi atau
memperbanyak diri, makin banyak plasmid yang direplikasi makin banyak pula gen asing yang dicopy sehingga terjadi cloning gen.
c) Enzim, berperan untuk memotong dan menyambung plasmid.
Enzim ini disebut enzim endonuklease retriksi, enzim endonuklease retriksi yaitu enzim endonuklease yang dapat memotong DNA pada posisi dengan urutan basa nitrogen tertentu (Tabel. 2.1).
Tabel 2.1. Enzim- Enzim retriksi dan organisme asalnya
Syarat rekayasa genetik yang perlu diperhatikan adalah;
Gen yang direkayasa harus mengandung gen penanda yaitu gen yang diinginkan dan gen pelopor yaitu gen sebagai penerima.
Penyisipan gen ke pembawa yaitu vektor harus sesuai agar mudah difusikan ke organisme penerima.
Penggunaan sistem kultur yang sesuai yaitu pemilihan sel atau jaringan dari organisme yang bisa digenerasiakan menjadi organisme sempurna.
Pemindahan DNA harus dapat meminimalkan kerusakan pada saat pemindahan gen ke genom DNA organisme penerima
(host) atau sel inangnya.
Dicek kembali dengan menggunakan elektroresis apakah gen asing yang diinginkan tersebut sudah masuk ke genom DNA organisme penerima atau sel inang sehingga terjadi transformasi gen.
Organisme penerima siap atau sel inang siap dikembangbiakkan.
3. Tahap-tahap Rekayasa Genetika
Dalam melakukan kegiatan rekayasa gen pada suatu organisme untuk menghasilkan susunan gen baru meliputi beberapa tahap yaitu:
a) Isolasi Gen
Pemilihan gen yang diperlukan dan isolasi atau pengekstrakan DNA yang diinginkan merupakan prasyarat untuk memulai proses. Gen yang diinginkan akan ditransfer terisolasi dan digandakan dengan menggunakan PCR.
Sumber DNA dapat dikerjakan dengan 3 cara :
DNA dapat berasal dari total genomik organisme yang diinginkan.
DNA yang dibuat dari mRNA yang diisolasi, dari jaringan tertentu. Complementary DNA (cDNA) dibuat
dengan template mRNA tadi, menggunakan
enzim”reverse transciptase”.
Dapat juga dengan DNA yang dibuat secara invitro dari nukleotida dan enzim polymerase DNA.
b) Konstruksi Gen
Gen yang terisolasi perlu diperiksa untuk melihat ekspresi sekuen DNAnya. Setiap gen terdiri dari promotor, gen penanda dipilih dari terminator. Daerah promotor bertanggung jawab untuk transkripsi gen yang berakhir saat mencapai wilayah terminator. Gen penanda dipilih sebagai penanda resistensi dalam perubahan sel. Namun, gen tidak dapat berkembang biak sendiri, namun harus digabungkan dengan DNA asing atau vektor yang dalam prosesnya dilakukan dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi, enzim ligase dan
replikasi molekuler menggunakan enzim polimerase.
Pemotongan ini dilakukan dengan enzim endonuklease restriksi yang dapat memutuskan rantai DNA pada urutan-urutan yang spesifik untuk enzim tersebut.
c) Transformasi (Pemindahan melalui penyisipan gen)
Dalam metode transformasi atau pemindahan banyak digunakan bakteri (plsmid) sebagai vektor yang berperan dalam pengambilan dan penyisipan DNA asing. Setelah terintegrasi, DNA bereplikasi menggunakan sistem replikasi host resefiens dan menghasilkan banyak salinan dari dirinya sendiri. Vektor yang digunakan dapat berupa plasmid, bakteriofag, kosmid, maupun kromosom buatan (YAC), (BAC) yang mana bertugas menyambung gen yang telah di potong dengan enzim ligase, dan di sambungkan ke DNA vektor. Jika hasil pemotongan DNA dengan endonuklease restriksi itu ujungnya tumpul tidak dapat tersambung , maka perlu ditambahkan fragmen DNA.
Ada 3 cara, yaitu :
a. Penambahan ekor homopolimer
Adalah penambahan ekor homopolimer dilakukan dengan menggunakan enzim terminal transferase, sedangkan untuk menyambungnya di gunakan enzim ligase (Gambar 2.1).
Gambar 2.1. Proses penambahan ekor homopolimer b. Penambahan linker
Linker merupakan potongan DNA rantai ganda yang dibuat secara invitro dengan urutan nukleotida yang di tetapkan Molekul ini disambungkan pada ujung-ujung tumpul DNA
asing yang akan disisipkan dengan enzim ligase
Kemudian di perlukan enzim endonuklease restriksi tertentu yang telah di sesuaikan dengan pembuatan linker tersebut.
Setelah terbentuk sticky end, maka potongan DNA di sisipkan ke vektor yang telah di potong dengan endonuuklease restriksi yang sama (Gambar 2.2).
c. Penambahan adaptor
Setelah terbentuk sticky end, maka potongan DNA di sisipkan ke vektor yang telah di potong dengan endonuuklease restriksi yang sama (gambar 2.3).
Gambar 2.3. Proses penambahan ekor Adaptor. d) Seleksi dan konfirmasi
Probe DNA komplementer disisipkan dan dikonfirmasi menggunakan pemetaan DNA, teknik elektroforesis seperti Southern blotting dan Bioassays biasa digunakan. Jika gen sudah
yang diingin terbentuk maka organisme sasaran siap
Gambar 2.4. Pemotongan Enzim retriksi dari Escherichia coli
Enzim restriksi (endonuklease restriksi) mengenal sekuen pemotongan yang khas dan memotong DNA pada situs pemotongan yang khas pula. Selanjutnya disambung dengan menggunakan enzim ligase (gambar 2.4). Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi untuk menyambung dua ujung potongan DNA. Enzim ligase yang sering
digunakan adalah DNA ligase dari E. Coli dan DNA ligase dari Fage
T4 (Gambar 2.5)
Gambar 2.5. Penyambungan oleh enzim ligase 4. Metode Rekayasa Genetika
Dalam pelaksanaan metode dalam rekayasa genetik untuk organisme tumbuhan dan hewan ada perbedaan karena menyangkut struktur sel tumbuhan dan hewan berbeda. Berikut kita bahas satu persatu.
Metode Rekayasa Genetika Pada Hewan
Pada prinsipnya rekayasa genetika pada hewan cara kerjanya lebih kurang sama dengan rekayasa genetika tumbuhan, yaitu (1) Identifikasi gen yang diharapkan; (2) Pengenalan kode DNA terhadap gen yang diharapkan; (3) Pengaturan ekpresi gen yang sudah
direkayasa; dan (4) Pemantauan transmisi gen terhadap
keturunannya. Beberapa metode yang sering digunakan dalam teknik rekayasa genetika hewan meliputi pengunaan vektor, kloning, PCR (Polymerase Chain Reaction), dan seleksi, screening, serta analisis rekombinan. Adapun metode tersebut adalah sebagai berikut;
a). Penggunaan Vektor
Vektor merupakan molekul DNA yang membawa suatu DNA asing kedalam sel inang, dengan harapan sifat yang ada pada DNA asing tersebut dapat terekspresi dalam sel inang. Salah satu vektor yang bisa digunakan untuk membawa molekul DNA asing masuk ke
dalam sel inang adalah Plasmid. Plasmid digunakan untuk
melakukan rekayasa pada berbagai organisme yang tidak bisa diperoleh secara alami.
Plasmid digunakan sebagai vektor dalam rekayasa genetika. Dalam hal ini plasmid digunakan untuk membawa suatu rangkaian fragmen DNA asing masuk dalam sel inang dengan harapan plasmid rekombinan itu mengalami replikasi dan mengekspresikan sifat baru pada DNA asing tersebut, sehingga sifat yang diinginkan dapat diperoleh dari plasmid rekombinan tersebut.
b). Penggunaan Plasmid
Penggunaan plasmid untuk rekayasa genetika harus
disesuaikan kebutuhannya sebab ada berbagai macam plasmid yang digunakan. Proses penggunaan plasmid dalam rekayasa genetika melalui langkah-langkah sebagai berikut :
Penentuan terlebih dahulu jenis plasmid yang hendak digunakan sebab ada beberapa jenis plasmid seperti pBR 322
dan pUC19 yang bisa digunakan untuk prokariot dan plasmid Ti yang bisa digunakan untuk organisme eukariot.
Bila plasmid telah ditentukan maka selanjutnya adalah menentukan tempat pengenalan enzim restriksi (pemotongan) yang hendak digunakan sebagai tempat penyisipan DNA asing dan marker untuk menandai masuk tidaknya plasmid pada sel inang.
Apabila telah diketahui tempat pengenalan restriksi dan markernya maka langkah selanjutnya adalah menyiapkan enzim restriksi sebagai pemotong plasmid. Enzim yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing sehingga nanti keduanya bisa bersatu misal: EcoR1.
Langkah selanjutnya adalah plasmid dipotong dengan enzim restriksi yang sesuai pada daerah potongannya.
Plasmid siap disambungkan dengan DNA asing yang memiliki sifat tertentu, yang telah dipotong juga dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotong plasmid.
c). Restriksi sebagai Pemotong Plasmid
Untuk memotong plasmid digunakan enzim restriksi. Enzim restriksi adalah enzim yang digunakan untuk memotong DNA secara spesifik. Enzim restriksi disebut sebagai gunting biologi. Enzim ini diisolasi dari bakteri. Restriksi yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing agar urutan basanya bisa sesuai sehingga antara plasmid dan DNA asing yang disisipkan bisa bersatu. Prinsip kerja enzim restriksi adalah:
Enzim restriksi yang digunakan adalah enzim endonuklease restriksi. Enzim pemotong ini mengenali DNA pada situs kusus dan memotong pada situs tersebut.
Situs pengenalan enzim restriksi adalah daerah yang simetri dengan poliandrom, artinya bila kedua utas DNA tersebut masing-masing dibaca dengan arah yang sama akan memberikan urutan yang sama pula nukleotidanya.
Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan
yaitu ujung kohesif (sticky end) dan ujung rata (blunt end).
d). Enzim Ligase sebagai penyembung plasmid dengan DNA asing
Prinsip kerja enzim ligase sebagai berikut:
Enzim ligase menyambung dua ujung DNA yang semulanya terpotong
penyambungan dilakukan dengan cara menyambung 2 ujung
DNA melalui ikatan kovalen antara ujung 3’OH dari utas satu
dengan ujung 5’P dari utas yang lain
Penggunaan ligasi DNA ini mengkatalis ikatan fosfodiester antara kedua ujung DNA sehingga kedua fragmen DNA yang berupa potongan bisa bersatu menjadi satu.
e). Pembuatan Plasmid Rekombinan
Untuk menciptakan plasmid rekombinan yang mengandung sifat DNA asing yang diinginkan maka dilakukan penyambungan DNA asing engan plasmid yang ada. Plasmid rekombinan terbentuk sebagai sambungan antara plasmid dengan DNA asing, sehingga plasmid tersebut mengandung sifat tertentu yang telah disesuaikan dengan kebutuhan.
Prosedur pembuatan plasmid rekombinan adalah sebagai berikut: Menyiapkan bakteri yang mengandung DNA asing dengan sifat
tertentu.
Menyiapkan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor. Pemotongan DNA asing dengan sifat yang dibutuhkan dengan
enzim restriksi semisal dari E. Coli.
Pemotongan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor
dengan enzim restriksi yang sama yaitu E. Coli.
Hasil potongan DNA dengan sifat tertentu disambungkan pada plasmid dngan menggunakan enzim penyambung yaitu DNA ligase. DNA ligase akan mengikat ujung 3’OH dengan ujung 5’P dan membentuk ikatan fosfodiester sehingga plasmid dan DNA asing dengan sifat tertentu bisa bersatu.
Terbentuklah plasmid rekombinan yang membawa DNA asing dengan sifat tertentu tersebut. Plasmid ini siap ditransfer ke dalam sel inang untuk memperoleh organisme transgenik.
Gambar 2.6. Proses pembuatan enzim insulin dari bakteri
Metode Rekayasa Genetika Pada Tumbuhan
Teknologi pemindahan gen atau tranformasi gen untuk mendapatkan tanaman transgenik dapat dibedakan menjadi 2 yaitu: langsung dan tidak langsung. Contoh transfer gen secara langsung adalah perlakuan pada protoplasma tanaman dengan eletroforasi atau dengan poliethileneglikol (p), penembakan eksplan gen di vortex dengan karbit silikon. Teknik pemindahan gen secara tidak langsung
dilakukan dengan bantuan bakteri Agrobakterium tumecien.
Metode ini merupakan metode yang paling sering digunakan dalam tyransfomasi 56loning tanaman pertanian.Agrobacterium yang
digunakan yaitu: A. tumefaciens (Plasmid Ti) (Tumor inducing atau
penyebab tumor). Cara Kerja:
Kawasan T-DNA yang terdapat pada meristem sebagai stuktur transformasi dan
proses perpindahan dilakukan oleh bakteria melalui virulen dalam kromosom dengan cara melukakan jaringan.
Untuk lokus virulen plasmid Ti yaitu Vir A, VirB, VirD dan VirG yang terlibat
dalam proses perpindahan T-ADN, sedangkan VirC dan VirE bertindak sebagai peningkatan proses transformasi. Bahan fenolik bertindak sebagai pengesan dan pengatur dan
komponen pengesan diberi kode gen VirA dan komponen
pengatur diberi kode gen VirG.
Metode transfer DNA yang umum digunakan pada tanaman monokotil adalah elektroporasi dari protoplas, perlakuan peg pada protoplas memudahkan presifitasi DNA dan membuat kontak lebih baik dengan protoplas juga melindungi DNA plasmid mengalami degradasi dari enzim nuklease.
b) Metode Transpeksi (Transformasi Biolistik)
Metode Transpeksi yaitu suatu metode pemindahan gen ke dalam sel-sel atau jaringan melalui penggunaan mikroprojektil seperti tungsten dan emas yang dibungkus DNA.
Cara Kerja:
Sistem ini menggunakan alat penekan partikel dengan kecepatan tinggi menembus 56loning56 sel seterusnya disatukan ke dalam 56loning sel.
Cara ini adalah mudah dan cepat tidan tergantung kepada jaringan tanaman.
