MOLEKULAR KLONING
A. Tahapan Molekular Kloning
Proses dasar kloning adalah isolasi urutan DNA dari spesies apa pun dan penyisipan ke dalam DNA pembawa, yang disebut vektor, untuk diperbanyak di dalam spesies inang, yang biasanya berupa bakteri atau ragi. Klon-klon tersebut kemudian dapat digunakan untuk analisis genetik, untuk menghasilkan protein, untuk mutasi, dan banyak tujuan lainnya.
Secara teoritis prosedur dan mekanisme kloning terhadap makhluk hidup melalui empat (4) tahap yaitu isolasi fragmen DNA, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor, transformasi dan seleksi hasil cloning (Gambar 6.1)
Gambar 6.1 Tahapan teknologi Molekular Kloning
1. Isolasi fragmen DNA
Eksperimen kloning dimulai dengan mengidentifikasi bagian DNA yang menjadi target kloning. Seringkali, ini adalah gen lengkap. Metode yang paling umum untuk menyalin gen adalah dengan reaksi rantai polimerase (PCR). Isolasi fragmen DNA yang spesifik dapat dilakukan dengan metode PCR (polymerase chain reaction) yaitu teknik amplikasi fragmen DNA yang spesifik secara in vitro. Secara umum DNA yang digunakan untuk PCR adalah total DNA genom yang diekstraksi dari sel dan tidak
diamplikasi secara spesifik akan ditentukan oleh primer-primer yang tersusun dari nukleotida. Setelah DNA diamplifikasi, ujungnya disiapkan untuk ligasi dengan enzim restriksi. Enzim restriksi dipilih untuk kompatibilitasnya dengan vektor yang diinginkan. Segmen gen yang diamplifikasi kemudian diinkubasi dengan enzim restriksi untuk memotong ujungnya sehingga ada overhang yang sesuai untuk ligasi. Material yang diperlukan untuk proses PCR adalah DNA yang mengandung rangkaian urutan yang akan diperbanyak (duplikasi DNA) yaitu primer, DNA
polimerase dan campuran dari empat macam
deoksiribonukleotida-trifosfat (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) serta MgCl2.
Pada saat yang sama, vektor disiapkan untuk menerima DNA dengan ujung-ujung yang menggantung yang sama. Setelah vektor DNA disiapkan, vektor harus diperbanyak dengan bakteri. Proses menginduksi bakteri untuk mengambil vektor DNA disebut transformasi. Bakteri biasanya siap untuk transformasi dengan pembuatan sel kompeten dengan kalsium klorida. Vektor biasanya berisi gen lain yang berguna untuk kloning, seperti promotor dan gen untuk resistensi antibiotik yang dapat digunakan untuk seleksi.
2. Penyisipan fragmen DNA ke dalam vector
Proses penyisipan atau penyambungan molekul fragmen DNA dengan molekul DNA vektor disebut ligasi. Ligasi adalah proses menggabungkan dua bagian DNA dari sumber yang berbeda bersama melalui pembentukan ikatan kovalen. DNA ligase adalah enzim yang digunakan untuk mengkatalisasi reaksi ini. Ligasi DNA membutuhkan ATP. Selama ligasi, gen yang diamplifikasi untuk dikloning diinkubasi dengan vektor. Ujung masing-masing telah disiapkan dengan enzim restriksi untuk memiliki potongan-potongan saling melengkapi DNA beruntai tunggal. Asam nukleat pada bagian yang saling bergantungan ini berpasangan satu sama lain, dan enzim ligase digunakan untuk menutup celah antara asam nukleat.
Biasanya ligasi terjadi antara ujung gugus fosfat dengan gugus hidroksil. Ligasi antara fragmen DNA yang memiliki ujung lengket (cohesive ends) yang komplementer jauh lebih efesien dibandingkan dengan ujung tumpul (blunt ends). Efisiensi ligasi juga dipengaruhi oleh adanya deoksiadenosin tunggal pada ujung. Efisiensi ligasi dapat ditingkatkan, bila fragmen DNA yang memiliki deoksiadenosin tunggal pada ujung bertemu dengan vektor yang memiliki timidin pada ujung.
Vektor yang biasa digunakan adalah plasmid yang merupakan potongan DNA bundar tertutup yang ditemukan di luar genom sel bakteri; kadang-kadang disebut sebagai "DNA kromosom ekstra". Plasmid membutuhkan asal replikasi (ORI) sebelum dapat direplikasi oleh sel inang bakteri. Vektor Plasmid dapat dirancang dengan berbagai fitur: dapat membawa gen resistensi antibiotik, gen untuk reseptor, atau protein lainnya (Gambar 6.2). Plasmid mereplikasi secara terpisah dari genom organisme dan dapat direkayasa untuk menjadi vektor cloning.
Potongan DNA yang dikloning ke dalam vektor plasmid disebut sebagai "sisipan" atau DNA target. Plasmid ada yang mempunyai jumlah salinan tinggi (High-copy number) dan
low-copy number atau jumlah salinan rendah. Plasmid dengan
jumlah salinan tinggi sering direplikasi oleh inang bakteri, menciptakan banyak salinan dan dengan demikian amplikon sisipan yang diklon dalam jumlah yang banyak. Plasmid dengan jumlah salinan rendah direplikasi lebih lambat, sehingga sel inang bakteri tidak mengandung banyak salinan plasmid. Plasmid dengan jumlah salinan rendah kadang-kadang digunakan untuk mengkloning potongan-potongan DNA yang mengkode protein yang beracun bagi sel inang jika diekspresikan pada tingkat tinggi.
Gambar 6.2 Peta dari Vektor plasmid pGEM-3Z
Vektor pGEM-3Z (Gambar 6.2) berisi gen penanda untuk
resistensi ampisilin (Ampr). Sel-sel bakteri yang mengandung
plasmid ini akan resisten terhadap antibiotik ampisilin. Sel-sel bakteri yang tidak mengandung plasmid ini (anggap tidak mengandung sumber resistensi antibiotik lain) akan sensitif terhadap antibiotik amplicillin. Hanya sel-sel yang mempunyai gen resisten antibiotic yang akan tumbuh. Kanamycin dan Tetracycline adalah dua antibiotik lain yang biasanya digunakan untuk memilih keberadaan plasmid dalam sel inang bakteri.
Untuk plasmid yang ditunjukkan di atas, gen penanda adalah lac Z (gen beta-galactosidase). Jika vektor dan strain E. coli kompatibel dengan skrining biru/putih, yang memanfaatkan komplemen α intrakistronik untuk meregenerasi aktivitas β-galaktosidase, dapat menggunakan skrining biru/putih untuk memilih keberadaan DNA yang dimasukkan dalam vector.
3. Transformasi DNA
Transformasi adalah proses pemindahan molekul DNA donor dari lingkungan luar sel. Vektor kloning yang merupakan pembawa gen yang akan dikloning ditransformasi ke dalam sel inang. Transformasi dapat dilakukan secara alami maupun buatan. Pada proses transformasi alami, DNA yang berbentuk
untai ganda dan memiliki untaian basa spesifik terhadap protein membran masuk ke dalam bakteri melewati membran sel bakteri terhidrolisis. Pada transformasi buatan, sel bakteri dibuat menjadi sel kompeten secara paksa sehingga selubung sel bakteri bersifat permeabel dan memungkinkan DNA dapat berikatan dengan sel dan masuk ke dalam sitoplasma, kemudian berinteraksi dengan genom sel bakteri.
Sel kompeten adalah sel inang yang memiliki kompetensi untuk dimasuki vektor kloning. Perlakuan untuk memasukkan sel kompeten dapat dilakukan dengan menggunakan metode kejutan panas (heat shock) atau kejutan pulsa listrik (metode electroporation).
Ada dua metode utama untuk mengubah(transformasi) sel bakteri: sengatan panas dan elektroporasi. Sel-sel bakteri harus dibuat kompeten atau permeabel terhadap plasmid yang Anda inginkan untuk diperbanyak oleh sel. Untuk membuat sel yang kompeten untuk metode transformasi yang digunakan, sel bakteri ditumbuhkan ke fase logaritmik dan dipanen. Sel yang tumbuh secara eksponensial dapat dianggap kompeten lebih mudah daripada sel pada tahap pertumbuhan lainnya. Setelah panen, sel diperlakukan berbeda. Sel-sel yang kompeten secara kimiawi dibuat menggunakan serangkaian pencucian garam dingin untuk mengganggu membran sel, mempersiapkan sel untuk menerima DNA plasmid. Untuk sel-sel elektrokompeten, sel-sel tersebut didinginkan dan dicuci dengan air deionisasi dingin dan 10% gliserol. Lingkungan rendah garam penting ketika arus listrik terlibat.
Untuk memasukkan plasmid yang diinginkan ke dalam sel yang kompeten secara kimia, DNA plasmid dicampur dengan sel dingin dan diinkubasi di atas es untuk memungkinkan plasmid untuk melakukan kontak dekat dengan sel. Campuran sel plasmid kemudian dipanaskan sebentar hingga 45-50°C, memungkinkan DNA memasuki sel melalui membran yang rusak. Campuran
yang dipanaskan kemudian ditempatkan kembali di atas es untuk mempertahankan plasmid di dalam bakteri. Banyak sel tidak selamat dari perubahan suhu yang cepat tetapi cukup mempertahankan integritas untuk menjaga plasmid dan, ketika media ditambahkan, pulih dan membelah.
Untuk elektroporasi, sel-sel yang kompeten juga duduk di atas es dengan DNA plasmid. Namun, campuran sel plasmid terkena arus listrik, membuka pori-pori di membran sel sehingga plasmid dapat masuk ke dalam sel. Beberapa sel tidak selamat dari perawatan ini tetapi banyak yang dapat mereplikasi begitu media ditambahkan. Jika larutan DNA plasmid mengandung terlalu banyak garam di dalamnya, lengkung dapat terjadi, sehingga membahayakan transformasi.
Bergantung pada metode transformasi yang digunakan, sebuah plasmid dapat masuk ke dalam sel melalui lubang atau pori-pori di dinding sel bakteri yang diciptakan oleh pencucian garam dan perlakuan panas atau tanpa pencucian garam dan elektroporasi. Kedua metode ini memungkinkan pemulihan sel yang ditransformasi secara efisien menggunakan seleksi antibiotik untuk kepentingan plasmid.
Bakteri yang ditransformasi tumbuh dalam kultur. Diperlukan metode untuk memilih hanya bakteri yang telah mengambil dan mengekspresikan vektor DNA. Metode yang paling umum adalah melalui penggunaan gen untuk resistensi antibiotik, termasuk dalam vektor. Media pertumbuhan untuk bakteri mengandung antibiotik, sehingga kultur yang dihasilkan seharusnya hanya mengandung bakteri yang berhasil ditransformasi.
4. Seleksi Hasil Kloning
Penyeleksian koloni bakteri untuk mendapatkan kloning yang diinginkan dengan cara X-gal atau pemotongan dengan enzim restriksi. Seleksi dengan X-gal dapat digunakan untuk mengidentifikasi plasmid rekombinan dengan komplementasi.
Sedangkan pemotongan dengan enzim restriksi dapat digunakan untuk menyeleksi plasmid rekombinan hasil kloning. Hasil pemotongan tersebut dielektroforesis dan memperlihatkan pita fragmen DNA sisipan yang terpisah dari pita vektor kloning.
Aktivitas ini dideteksi oleh pelapisan bakteri yang
ditransformasi oleh plasmid pada lempeng yang mengandung isopropil β-D-thiogalactopyranoside (IPTG; penginduksi lac promoter) dan 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X- Gal; pewarna yang menghasilkan warna biru saat dihidrolisis oleh β-galactosidase). Ketika kerangka pembacaan α peptida
terganggu oleh penyisipan fragmen DNA asing atau
penghapusan sekuens vektor, komplemen α tidak terjadi, dan koloni bakteri tetap berwarna putih atau terkadang biru muda.
Jika berhasil memasukkan DNA target ke dalam plasmid menggunakan salah satu situs enzim restriksi di daerah, gen lacZ
tidak lagi memasok informasi yang diperlukan untuk
menghasilkan beta-galactosidase fungsional. Oleh karena itu sel bakteri yang mengandung plasmid dengan sisipan tidak akan dapat menghidrolisis substrat X-gal, dan mereka akan menghasilkan koloni putih (atau kadang-kadang biru muda).
Jika DNA target tidak berhasil dikloning ke dalam plasmid, plasmid memberikan informasi yang dibutuhkan sel inang bakteri untuk memproduksi beta-galactosidase, dan sel-sel akan dapat menghidrolisis substrat X-gal, dan akan menghasilkan koloni biru gelap. Plasmid kloning akan mengandung dua penanda: Penanda antibiotik yang hanya memungkinkan bakteri dengan plasmid tumbuh pada medium yang mengandung antibiotik yang sesuai, dan Marker kloning, seperti lacZ, yang memungkinkan membedakan plasmid dengan insert dari plasmid tanpa insert.
Jika ukuran asli dari plasmid yang belum dipotong adalah 3.0kb, dan menambahkan sisipan 0.75kb, akan dapat memverifikasi penambahan sisipan dengan menganalisis plasmid
yang tidak dipotong, memotong plasmid, plasmid yang dipotong
dengan memasukkan, dan memotong plasmid dengan
memasukkannya ke gel agarosa.