SEKUEN DNA
C. Cara Membaca Sekuen DNA 1. Pembacaan Sekuen DNA
3. Metode Sekuensing DNA
Sejalan dengan berkembangnya mesin-mesin sekuensing DNA automatis (automatic DNA sequencer), perkumpulan organisasi genetik telah memberikan perhatian dan dukungan dana bagi penentuan sekuens genom berbagai spesies organisme penting. Beberapa genom yang ukurannya sangat kecil seperti genom virus HIV dan fag λ telah disekuens seluruhnya. Genom sejumlah bakteri,
misalnya E. coli (4,6 x 106 pb), dan khamir Saccharomyces cerevisiae
(2,3 x 107 pb) juga telah selesai disekuens. Sementara itu, proyek
sekuensing genom tanaman Arabidopsis thaliana (6,4 x 107 pb) dan
nematoda Caenorhabditis elegans saat ini masih berlangsung. Proyek Genom Manusia (Human Genom Project), yang diluncurkan pada tahun 1990 dan sebenarnya diharapkan selesai pada tahun 2005, ternyata berakhir dua tahun lebih cepat daripada jadwal yang telah ditentukan.
Sekuens DNA menyandikan informasi yang diperlukan bagi makhluk hidup untuk melangsungkan hidup dan berkembang biak (Gambar 7.2). Dengan demikian, penentuan sekuens DNA berguna di dalam ilmu pengetahuan murni mengenai mengapa dan bagaimana makhluk hidup dapat hidup, selain berguna dalam penerapan praktek. Hal ini karena DNA merupakan ciri kunci makhluk hidup, pengetahuan sekuen DNA dapat berguna dalam berbagai jenis penelitian biologi. Sebagai contoh, dalam ilmu pengobatan sekuen DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatan penyakit genetik. Demikian pula halnya pada penelitian agen penyebab penyakit (patogen) dapat membuka jalan bagi pengobatan penyakit menular. Bidang Bioteknologi dapat pula memanfaatkan sekuensing DNA, merupakan bidang yang berkembang pesat dan berpotensi menghasilkan banyak barang dan jasa berguna. Pengetahuan akan sekuen DNA berguna untuk mengetahui sekuens asam amino yang disandikan oleh gen.
Seiring dengan perkembangannya, kini terdapat beberapa macam metode sekuensing terminasi rantai yang berbeda satu sama lain terutama dalam hal pendeteksian fragmen DNA hasil reaksi sekuensing. Ada 3 motode dalam pembuatan sekuen DNA.
1). Metode Maxam-Gilbert (Chemical Reaction)
Metode sekuensing DNA Maxam-Gilbert disebut metode
Chemical Reaction yang dicetuskan Allan Maxam dan Walter Gilbert
dari Harvard University di Cambridge, Massachusetts, Amerika Serikat. Metode ini cukup populer karena dapat langsung menggunakan DNA hasil pemurnian,. Metode ini memiliki kerumitan teknis dan menggunakan bahan kimia berbahaya, dan kesulitan dalam scale-up. Cara kerjanya adalah sebagai berikut;
Gambar 7.3. Gel sekuensing metode Sanger yang telah dilabel radioaktif.
Metode Maxam Gilbert menggunakan senyawa kimia radioaktif yang berbahaya dan melibatkan peristiwa reaksi kimia, sehingga sekarang ini sudah kurang diminati oleh para peneliti di bidang
genetic enginering.
2). Metode Sanger (Terminasi Rantai)
Metode Sanger dikembangkan oleh Frederick Sanger dan rekan-rekannya. Dewasa ini, hampir semua usaha sekuensing DNA
Ekstraksi double-stranded DNA
Labelling dengan radioaktif
Elektroforesis menyamping dengan denaturasi oleh gel Acrylamide
dilakukan dengan menggunakan metode terminasi rantai. Teknik tersebut melibatkan terminasi atau penghentian reaksi sintesis DNA
in vitro yang spesifik untuk sekuen tertentu menggunakan substrat
nukleotida yang telah dimodifikasi. metode ini memerlukan kloning untuk membentuk DNA untai tunggal.
Pada metode ini perpanjangan atau ekstensi rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang disebut primer yang komplementer terhadap DNA pada daerah situs tersebut. Primer tersebut diperpanjang menggunakan DNA polimerase, enzim yang mereplikasi DNA. Bersama dengan primer dan DNA polimerase, diikutsertakan pula empat jenis basa deoksinukleotida (satuan pembentuk DNA), juga nukleotida pemutus atau penghenti rantai (terminator rantai)
dalam konsentrasi rendah (biasanya di-deoksinukleotida).
Penggabungan nukleotida pemutus rantai tersebut secara terbatas kepada rantai DNA oleh polimerase DNA menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA tempat nukleotida tertentu tersebut tergabungkan. Fragmen-fragmen
DNA tersebut lalu dipisahkan menurut ukurannya dengan
elektroforesis gel poliakrilamida, atau sekarang semakin lazim dengan elektroforesis menggunakan tabung gelas berjari-jari kecil (pipa kapiler) yang diisi dengan polimer kental.
3). Metode Sanger asli (sekuensing dye terminator)
Pada metode sekuensing dye terminator atau Sanger asli urutan nukleotida DNA tertentu dapat disimpulkan dengan membuat secara paralel empat reaksi perpanjangan rantai menggunakan salah satu dari empat jenis basa pemutus rantai pada masing-masing reaksi. Fragmen-fragmen DNA yang kemudian terbentuk dideteksi dengan menandai (labelling) primer yang digunakan dengan fosforradioaktif sebelum reaksi sekuensing dilangsungkan. Keempat hasil reaksi tersebut kemudian dielektroforesis pada empat lajur yang saling bersebelahan pada gel poliakrilamida. Hasil pengembangan metode ini menggunakan empat macam primer yang ditandai dengan pewarna berpendar (fluorescent dye). Hal ini memiliki kelebihan
karena tidak menggunakan bahan radioaktif; selain menambah keamanan dan kecepatan, keempat hasil reaksi dapat dicampur dan dielektroforesis pada satu lajur pada gel.
Jumlah kapiler pada mesin ini bervariasi, mulai dari 1, 4, 16, 48 hingga 96 kapiler dalam satu mesin, semakin banyak jumlah kapiler, semakin banyak pula jumlah sampel DNA yang bisa ditentukan urutan basanya. Hasil pembacaan mesin sequencer disebut electropherogram, yaitu peak-peak berwarna yang menunjukkan urutan basa DNA-nya. Electropherogram. Dapat dilihat pada gambar 7.4.
Gambar 7.4. Contoh hasil bacaan suatu sekuensing metode dye
terminator.
Cara pelabelan primer adalah dengan melabel pemutus rantainya, lazim disebut metode sekuensing dye terminator. Keunggulan cara ini adalah bahwa seluruh proses sekuensing dapat dilakukan dalam satu reaksi, dibandingkan dengan empat reaksi terpisah yang diperlukan pada penggunaan primer berlabel. Pada cara tersebut, masing-masing dideoksinukleotida pemutus rantai ditandai dengan pewarna fluoresens, yang berpendar pada panjang gelombang yang berbeda-beda. Cara ini lebih mudah dan lebih cepat
dibandingkan penggunaan primer berwarna, namun dapat
menimbulkan ketidaksamaan tinggi kurva atau puncak (peak) yang disebabkan oleh ketidaksamaan penggabungan pemutus rantai berwarna berukuran besar pada pertumbuhan DNA (ketidaksamaan
dapat dikurangi secara nyata dengan penggunaan macam-macam enzim dan pewarnabaru yang meminimalkan perbedaan dalam penggabungan. Metode ini kini digunakan pada sebagian besar usaha reaksi sekuensing karena lebih sederhana dan lebih murah.
Primer-primer yang digunakan tidak perlu dilabel secara terpisah
(yang bisa jadi cukup mahal untuk primer yang dibuat untuk sekali pakai), walaupun hal tersebut tidak terlalu bermasalah dalam penggunaan universal primer.
Selanjutnya metode dengan menggunakan mesin sekuen DNA yang memiliki beberapa jenis. Kecanggihan mesin-mesin ini sebagai wujud kemajuan teknologi dalam mendapatkan seatu hasil sekuen DNA yang cepat, panjang dan akurat. Adapun jenis-jenis tersebut adalah;
4). Metode Automatisasi dan penyiapan sampel
Mesin sekuensing DNA automatis modern mampu mengurutkan 384 sampel berlabel fluoresens sekaligus dalam sekali batch (elektroforesis) yang dapat dilakukan sampai 24 kali sehari. Hal tersebut hanya mencakup proses pemisahan dan proses pembacaan kurva; reaksi sekuensing, pembersihan, dan pelarutan ulang dalam larutan penyangga yang sesuai harus dilakukan secara terpisah.
Untuk memperoleh hasil reaksi berlabel yang dapat dideteksi dari DNA cetakan, metode "sekuensing daur" (cycle sequencing) paling lazim dilakukan. Dalam metode ini dilakukan berturut-turut penempelan primer (primer annealing), ekstensi oleh polimerase DNA, dan denaturasi (peleburan atau melting) untai-untai DNA cetakan secara berulang-ulang (25–40 putaran). Kelebihan utama sekuensing daur adalah lebih efisiennya penggunaan pereaksi sekuensing yang mahal (BigDye) dan mampunya mengurutkan templat dengan struktur sekunder tertentu seperti hairpin loop atau daerah kaya-GC. Setiap tahap pada sekuensing daur ditempuh dengan mengubah temperatur reaksi menggunakan mesin pendaur panas (thermal cycler) PCR.
Cara tersebut didasarkan pada fakta bahwa dua untai DNA yang
komplementer akan saling menempel (berhibridisasi) pada
temperatur rendah dan berpisah (terdenaturasi) pada temperatur tinggi. Hal penting lain yang memungkinkan cara tersebut adalah penggunaan enzim DNA polimerase dari organisme termofilik (organisme yang hidup di lingkungan bertemperatur tinggi), yang tidak mudah terurai pada temperatur tinggi yang digunakan pada cara tersebut (>95 °C).
5). Metode Pyrosequencing
Pyrosequencing adalah metode pemetaan DNA yang
berdasarkan deteksi terhadap pirofosfat (PPi) yang dilepaskan selama sintesis DNA. Teknik ini memanfaatkan reaksi enzimatik yang dikatalisis oleh ATP sulfurilase dan luciferase untuk pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahan nukleotida.
6). Metode Illumina (Solexa)
Metode sekuensing ini ditemukan oleh perusahaan Illumina. Sekuensing Illumina menggunakan primer yang akan berkomplemen dengan adaptor yang telah disediakan oleh perusahaan pada sebuah plat. Proses sekuensing ini menggunakan teknik bridge PCR, yaitu terbentuknya jembatan pada saat elongasi. Nukleotida penghenti akan diberikan dan pendaranan fluoresens akan direkam oleh kamera.
Metode sekuensing DNA yang kini ada hanya dapat merunut sepotong pendek DNA sekaligus. Contohnya, mesin sekuensing modern yang menggunakan metode Sanger hanya dapat mencakup paling banyak sekitar 1000 pasang basa setiap sekuensing. Keterbatasan ini disebabkan oleh probabilitas terminasi rantai yang menurun secara geometris seiring dengan bertambahnya panjang rantai, selain keterbatasan fisik ukuran dan resolusi gel.
Sekuens DNA dengan ukuran jauh lebih besar kerap kali
dibutuhkan. Sebagai contoh, genom bakteri sederhana dapat
mengandung jutaan pasang basa, sedangkan genom manusia terdiri atas lebih dari 3 miliar pasang basa.Berbagai strategi telah
dikembangkan untuk sekuensing DNA skala besar, termasuk strategi
primer walking dan shotgun sequencing. Kedua strategi tersebut
melibatkan pembacaan banyak bagian DNA dengan metode Sanger dan selanjutnya menyusun hasil pembacaan tersebut menjadi sekuens yang runut. Masing-masing strategi memiliki kelemahan sendiri dalam hal kecepatan dan ketepatan; sebagai contoh, metode
shotgun sequencing merupakan metode yang paling praktis untuk
sekuensing genom ukuran besar, namun proses penyusunannya rumit dan rentan kesalahan.
Data sekuen bermutu tinggi lebih mudah didapatkan bila DNA bersangkutan dimurnikan dari pencemar yang mungkin terdapat pada sampel dan diamplifikasi.Hal ini dapat dilakukan dengan metode reaksi berantai polimerase bila primer yang dibutuhkan untuk mencakup seluruh daerah yang diinginkan cukup praktis dibuat.Cara lainnya adalah dengan kloning DNA sampel menggunakan vektor bakteri, yaitu memanfaatkan bakteri untuk "menumbuhkan" salinan DNA yang diinginkan sebanyak beberapa ribu pasang basa sekaligus.Biasanya proyek-proyek sekuensing DNA skala besar memiliki persediaan pustaka hasil kloning semacam itu.