Penelitian berlangsung mulai bulan Februari hingga April 2010. Pembuatan jamu galohgor dilakukan di Pilot Plant, SEAFAST, IPB. Pemeliharaan dan perlakuan tikus dilaksanakan di Laboratorium Percobaan Hewan Shigeta IPB.
Analisis β-karoten jamu galohgor dilakukan di Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO). Analisis serum retinol, kadar β-karoten, kadar Zn dalam serum dilakukan di Laboratorium Biokimia Puslitbang Gizi dan Makanan Depkes Bogor. Analisis Kadar ferritin dan hematologi lengkap dilakukan di laboratorium klinik. Sedangkan pengamatan histopatologi dilakukan di laboratorium patologi Fakultas Kedokteran Hewan, IPB.
Bahan dan Alat Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bahan jamu diperoleh langsung dari desa Sukajadi, yang terdiri dari golongan tumbuhan obat yang berasal dari daun, akar, dan batang; golongan rempah-rempah; golongan temu-temuan dan golongan kacang-kacangan, sebagaimana pada Tabel 2.
Bahan-bahan untuk analisis: proximat pada jamu, kadar β-karoten pada jamu, kadar Zn, Fe, retinol, dan karoten pada darah. Serta bahan-bahan yang diperlukan untuk analisis hematologi darah. Eter untuk euthanasia, larutan neutral buffer formalin
10 % untuk fiksasi, kapas dan bahan-bahan untuk pembuatan sediaan histopatologi yaitu larutan Mayer’s Hematoxylin, larutan Eosin, Xylol, alkohol dengan konsentrasi bertingkat (70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %), larutan Lithium Carbonat, aquades, asam asetat 1 %, Schiff Reagent, air sulfit, larutan Mordant,
larutan Carrazi’s Hematoxylin, larutan Orange G 0,75 %, larutan Ponceau Xylidine Fuchsin, larutan Phosphotungstic Acid 2,5 %, Anilin Blue, dan Parafin.
23
Alat
Alat yang digunakan adalah alat-alat untuk membuat jamu seperti autoclave, blancher, drum dryer, penggilingan dan ayakan 60 mesh. Kandang pemeliharaan tikus beserta botol minum dan tempat makan tikus, alat untuk pengambilan darah, peralatan untuk membuat perlukaan pada tikus, alat-alat untuk analisis proximat pada jamu, analisis kadar Zn dan Fe pada jamu menggunakan AAS, analisis kadar
β-karoten menggunakan HPLC, analisis kadar retinol dan karoten serum menggunakan HPLC, serta peralatan untuk membuat sediaan histopatologi seperti mikrotom, alat dehidrasi, gelas objek dan gelas penutup. Untuk pengamatan histopatologi digunakan mikroskop dan videomikrometer.
Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus (Rattus sp.) betina dewasa galur Spraque-Dawley (SD) yang berumur 2 bulan dengan berat ± 200 gram. Tikus tersebut diperoleh dari Pusat Studi Biofarmaka LPPM IPB.
Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan ini merupakan rancangan acak lengkap dengan faktor perlakuan pemberian jamu dan kelompok hari. Sebanyak 24 ekor tikus dibagi secara acak ke dalam dua kelompok percobaan, yaitu kelompok kontrol dan kelompok perlakuan. Kelompok kontrol adalah kelompok yang tidak diberikan jamu. Sedangkan kelompok perlakuan adalah kelompok yang diberikan jamu. Kelompok kontrol dibagi menjadi 2 kelompok kecil, yaitu kelompok yang diberi perlukaan dan kelompok yang tidak diberi perlukaan. Begitu juga dengan kelompok perlakuan. Sehingga ada 4 kelompok perlakuan, yaitu kelompok kontrol tanpa perlukaan, kelompok kontrol dengan perlukaan, kelompok jamu tanpa perlukaan, dan kelompok jamu dengan perlukaan yang masing-masing sebanyak 6 ekor.
24
Percobaan Pembuatan Jamu
Penelitian diawali dengan pembuatan jamu dengan metode drum dryer; komposisi bahan sesuai dengan yang telah dilakukan dalam penelitian sebelumnya (Pajar, 2002). Dengan metode ini diperoleh jamu yang bertekstur lebih halus dibandingkan dengan metode tradisional, sehingga mudah untuk diberikan pada tikus pada saat pencekokan.
Tahapan pembuatan jamu yaitu, dilakukan inventarisasi terhadap bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan jamu. Jamu dibuat dengan menggunakan bahan sebanyak 56 campuran, yang semuanya merupakan bahan dari tumbuh-tumbuhan baik tanaman liar atau tanaman yang sudah dibudidayakan. Bagian tumbuhan yang digunakan terdiri dari bagian daun, buah, dan batang atau bagian tumbuhan secara keseluruhan. Komposisi jamu galohgor dapat dilihat pada Tabel 2.
Bahan-bahan yang berupa kacang-kacangan dan biji-bijian direndam dalam air mendidih selama 4 jam, ditiriskan, kemudian dihancurkan menggunakan
quencher. Sedangkan bahan-bahan yang berupa daun-daunan, rempah-rempah dan temu-temuan dicincang menggunakan chopper. Kemudian keduanya dicampur sehingga berbentuk pasta. Pasta tersebut dimasukkan kedalam drum dryer dengan volume 1 kilogram dengan suhu 80o
Tabel 2 Komposisi jamu galohgor
C selama 1 jam dan keluar dalam bentuk lempengan. Lempengan tersebut kemudian dihancurkan menggunakan blender
dan diayak menggunakan ayakan mekanis dengan ukuran 60 mess.
No. Nama Tradisional Nama Ilmiah Berat (g)
A. Tumbuhan Obat
(Herb Medicines) dari Bagian Daun, Akar, dan Batang
1. Antawali Tinospora cripsa mires 3,36
2. Babadotan Ageratum cony zades L 1,74
3. Beluntas Plucea indica Less 5,63
4. Kiranediuk Selaginella plana Hieron 3,33 5. Kiranelalap Selaginella wildenowii 1,33
Lanjutan Tabel 2 Komposisi jamu galohgor
25
6. Handeuleum Graptophylium pictum Griff 2,85
7. Harendong Astronia spectabilis BI 2,55
8. Hadas palasari 5,75
9. Jambu batu Psidium cujavillus 7,46
10 Alpukat Persea americana Miler 2,48
11. Jawerkotok Scutellaria discolor colebr 5,96
12. Jukut bau Hyptis suaveolus Poit 0,69
13. Kahitutan Paedoria foefida Linn 2,60
14. Karastula Chlorantus elatior R.Br 3,80
15. Kikarugrag Hyptis brevipes Poit 0,79
16. Kiremek daging Hemigraphie coclorata Hall 10,09
17. Kiremek tulang 3,62
18. Kiura Plantago major Linn 5,63
19. Kibeling Strobilanthes crispus L 2,01
20. Kicantung Gonia thalamus maerophyllus Ht 3,05
21. Kiclenceng 3,36
22. Kikanceh Ficus edelfelhi king 1,15
23. Kimulas Desmodium heteraphyllum Dc 3,36 24. Kumis kucing Orthosiphon aristatus miq 3,36 25. Mangkokan Micromelum pubescen. BI 6,67
26. Manglit Magnolia montana blume 2,19
27. Mereme Glochidion arborescens Bi 2,90
28. Memeniran Phyllanthua urinaria Lahan 2,94 29. Saga (daun) Abrus prekaterius Lahan 1,35 30. Sariawan usus Symplocos odoratissima chosy 0,21
31. Sembung Blumea balsamiera Dc 11,25
32. Seputuher 3,39
33. Sereh Piper betle L. 3,16
34. Siang Artemisia vulgaris L. 7,26
35. Singgugu Clerodendrum serratum Moon 4,26 36. Srikuning Nyctanthes arbor-tristis L. 3,77
37. Suruha 4,21
38. Tempuyung Soncuhus arvensis Linn 6,37
B. Rempah-rempah
(Spices)
1. Bawang merah Allium cepa Lahan 19,09
2. Kapulaga Amomun cardamomun Wild 50,00
3. Ketumbar Cariandrum saripun LINN 3,03
4. Lada Piper nigrom Lahan 1,31
5. Pala Myristica fragrans Hout 4,49
C. Temu-temuan
1. Panglaihideng Curcuma aeruginosa Roxb 7,57
2. Jahe Zingiber officinale Rosc 13,00
3. Kencur Kaempferia galanga L 7,08
4. Koneng Curcuma domestica Val 7,38
Lanjutan Tabel 2 Komposisi jamu galohgor
26
6. Lempuyang Zingiber zerambet SM 60,54
D. Biji-bijian
1. Jaat Psophocarpus tetrayonolobus Dc 21,30
2. Kacang ijo Phaseolus radiatus L 197,32
3. Kacang dadak Vigna sinensis ENDL 50,40
4. Kacang kedelai Glicine max 76,90
5. Kacang tanah Arachis hypogea LINN 39,70
6. Beras Oryiza sativa 122,36
7. Jagung Zea mays 500
Sumber : Pajar 2002 Pemeliharaan Tikus
Tikus dipelihara dalam kandang dari kotak plastik yang pada bagian atasnya diberi kawat kasa sebagai penutup sekaligus tempat pemberian pakan dan minum. Tiap kandang terdiri dari 2 ekor tikus dengan tiap tikus diberi penanda. Kecuali setelah mengalami perlukaan, tiap kandang terdiri atas 1 ekor tikus. Sebagai alas digunakan sekam yang berfungsi untuk menjaga suhu dan menyerap urine. Pakan yang diberikan yaitu pakan komersil dari PT INDOFEED dengan kandungan protein (18 %), lemak (4 %), serat (4 %), abu (11 %), dan metabolisme energi (2000 kkal). Pemberian pakan yang berbentuk pellet dan minum (aquadest) secara ad libitum. Sekam pada kandang tikus diganti 3 hari sekali.
Perlakuan pada tikus
Tikus kelompok kontrol dan tikus kelompok perlakuan sebelumnya mengalami proses adaptasi selama 10 hari. Selama proses adaptasi, semua tikus mengalami perlakuan yang sama. Semua tikus diberikan pakan standar dan air minum. Setelah 10 hari, masing-masing kelompok percobaan mengalami perlakuan sesuai kelompok masing-masing.
Tikus yang mengalami perlakuan jamu, pemberian jamu pada tikus dilakukan dengan cara melarutkan jamu dalam air dan dicekokan dengan menggunakan sonde (Smith dan Mangkoewidjojo 1988). Pencekokan jamu dilakukan satu kali sehari, yaitu pada pagi hari (jam 9-10 pagi) dengan dosis 0,37 g/kg berat badan. Selama pemberian jamu, semua tikus percobaan tetap diberikan pakan dan minum secara ad libitum. Tikus yang mendapatkan perlakuan perlukaan, akan dilakukan penyayatan setelah 3 hari pencekokan jamu. Sebelum
27
penyayatan, rambut di sekitar daerah sayatan dicukur hingga terlihat kulitnya (licin), lalu disayat sepanjang 0,5-1 cm pada bagian punggung secara aseptis.
Jenis dan Cara Pengumpulan Data Jenis Data
Data yang diambil adalah data primer yang meliputi data profil jamu dan
tikus. Pemeriksaan jamu meliputi penentuan kadar proximat, Zn, Fe, dan β -karoten. Adapun pemeriksaan tikus meliputi pengamatan berat badan tikus dari hari ke-0 sampai hari ke-12, penentuan kadar seng, zat besi dalam serum, penentuan kadar retinol serum, dan pengamatan proses penyembuhan luka pada tikus. Masing-masing data dikumpulkan dan dilakukan analisis untuk mendapatkan informasi yang diperlukan.
Cara Pengumpulan Data
Cara pengumpulan data untuk masing-masing data yaitu, pengamatan berat badan dilakukan dengan menimbang berat badan tikus setiap hari dari hari ke-0 sampai hari ke 12 dengan menggunakan timbangan tikus. Untuk pemeriksaan kadar seng, zat besi, dan kadar retinol serum dilakukan dengan mengambil darah pada hari-hari pengambilan darah kemudian sampel dikumpulkan dan disimpan di freezer sampai dilakukan pemeriksaan di laboratorium. Sedangkan pemeriksaan respon imunitas yang meliputi penentuan limfosit darah. Sehingga data yang akan dikumpulkan meliputi data jamu dan data tikus.
Kandungan Gizi Jamu. Pengamatan kandungan gizi jamu meliputi data kadar analisis proksimat. Analisis proksimat mencakup kandungan karbohidrat (metode by difference), kadar protein (metode semi mikro-Kjeldahl), kadar lemak (metode Soxhlet), kadar air (metode AOAC, 1995). Kadar mineral meliputi kadar seng (metode AAS), kadar zat besi (metode AAS). Komponen bioaktif
(kualitatif), dan kadar β-karoten (metode HPLC)
Pengamatan Tikus. Pengamatan tikus meliputi data berat badan, darah, dan histopatologi kulit. Berat badan tikus diukur setiap dua hari sekali. Analisis
28
darah meliputi analisis plasma darah dan serum darah. Plasma darah meliputi pengamatan gambaran darah yang yang meliputi jumlah eritrosit, leukosit, kadar hemoglobin (Hb), kadar hematokrit (Ht), Volume rataan darah merah (Mean Corpuscular Volume/MCV), dan rataan konsentrasi hemoglobin dalam darah merah (Mean Corpuscular Haemoglobin Concentration/MCHC). Sedangkan serum darah meliputi data kandungan seng dalam serum darah (metode AAS), kadar feritin dalam serum darah (Metode Elisa), kadar retinol (metode HPLC), kadar karoten (metode HPLC). Pengamatan tikus juga mencakup gambaran histopatologi kulit tikus yang mengalami penyayatan yang semuanya diamati pada hari ke-3, ke-7, dan ke-12 setelah perlukaan.
Pengambilan Darah Tikus. Pada hari pengambilan sampel hari ke-3, hari ke-7, dan hari ke-12 dilakukan pengambilan darah tikus. Tikus dianastesi dengan inhalasi menggunakan eter. Darah diambil secara langsung dari jantung sebanyak ± 5 ml, 1 ml dimasukkan ke dalam tabung yang berisi larutan antikoagulan EDTA untuk pemeriksaan hematologi darah. Sedangkan 4 ml dimasukkan ke dalam tabung yang tidak berisi EDTA, kemudian sampel darah disentrifuge pada 1800 x g selama 15 menit pada suhu 4 o
Pengambilan Kulit.. Adapun untuk pengambilan kulit dilakukan setelah tikus dianastesi dengan menggunakan larutan eter. Setelah daerah punggung yang akan diambil kulitnya dibersihkan dari bulu, kulit digunting sepanjang 1-1,5 cm
C untuk memperoleh serum darah, yang selanjutnya digunakan untuk analisis kadar Zn, feritin, retinol, dan karoten dalam serum.
2
Pembuatan Preparat Histopatologi. Sediaan kulit yang telah difiksasi menggunakan larutan Neutral Buffer Formalin (NBF) 10 % lalu dilakukan
trimming organ dan dimasukkan ke dalam cassette tissue dari plastik. Tahap selanjutnya dilakukan proses dehidrasi alkohol menggunakan konsentrasi alkohol yang bertingkat yaitu alkohol 70 %, 80 %, 90 %, alkohol absolut I, alkohol absolut II, kemudian dilakukan penjernihan menggunakan xylol I dan xylol II. dengan ketebalan ± 3 mm hingga mencapai sub cutan. Kulit yang diperoleh kemudian difiksasi dengan larutan neutal buffer formalin atau NBF 10 % dibiarkan pada suhu kamar selama 48 jam untuk selanjutnya dibuat sediaan histopatologi.
29
Proses pencetakan atau parafinisasi dilakukan menggunakan parafin I dan parafin II. Sediaan dimasukkan ke dalam alat pencetak yang berisi parafin setengah volume dan sediaan diletakkan ke arah vertikal dan horizontal sehingga potongan melintang melekat pada dasar parafin. Setelah mulai membeku, parafin ditambahkan kembali sehingga alat pencetak penuh dan dibiarkan sampai parafin mengeras.
Blok-blok parafin kemudian dipotong tipis setebal 5 mikrometer dengan menggunakan mikrotom. Hasil potongan yang berbentuk pita tersebut dibentangkan di atas air hangat yang bersuhu 46 oC dan langsung diangkat yang berguna untuk meregangkan potongan agar tidak berlipat atau menghilangkan lipatan akibat dari pemotongan. Sediaan tersebut kemudian diangkat dan diletakkan di atas gelas objek dan dikeringkan semalaman dalam inkubator bersuhu 60 o
Pengamatan Histopatologi. Pengamatan histopatologi menggunakan metode penghitungan menurut cara Low et al (2001) dengan menghitung jumlah sel yang diamati. Parameter yang digunakan adalah merapatnya lapis epidermis (re-epitelisasi), banyaknya sel-sel radang (makrofag, limfosit, dan neutrofil), pembentukan neokapiler dan sel-sel fibroblas yang ada dalam luka. Pengamatan histopatologi dilakukan menggunakan mikroskop cahaya.
C sehingga dapat dilakukan pewarnaan umum Hematoxylin Eosin
(HE) dan pewarnaan khusus Masson Trichrome (MT) untuk melihat jaringan fibroblas.
Rumus penghitungan % Re-epitelisasi:
Metode Pengukuran
Kadar zat besi jamu : Diukur dengan menggunakan Atomic Absorption Spectrofotometry (AAS)
Kadar seng jamu : Diukur dengan menggunakan Atomic
Absorption Spectrofotometry (AAS)
Kadar β-karoten : Diukur dengan menggunakan High Performance
30
Kadar retinol serum : Diukur dengan menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Kadar β-karoten serum : Diukur dengan menggunakan High Performance
Liquid Chromatography (HPLC)
Kadar feritin serum : Diukur dengan menggunakan metode ELISA (Enzime-linked immunoassays)
Kadar seng serum : Diukur dengan menggunakan Atomic Absorption Spectrofotometry (AAS)
Jumlah eritrosit : Dihitung dengan menggunakan hemocitometer Neubauer dan larutan Larutan Hayem
Jumlah leukosit : Dihitung dengan menggunakan hemocitometer Neubauer dan larutan Larutan Hayem
Kadar hemoglobin : Dihitung dengan menggunakan metode
cynomet-hemoglobin
Kadar hematokrit : Dihitung dengan mikrohematokrit menggunakan tabung hematokrit
Volume rataan sel darah merah (Mean Corpuscular Volume = MCV)
: Dihitung dengan membagi kadar hematokrit dengan jumlah sel darah merah dengan rumus sebagai berikut
Rataan konsentrasi hemoglobin dalam sel darah merah (Mean Corpuscular Haemoglobin Concentration= MCHC)
: Dihitung dengan membagi konsentrasi hemoglobin dengan hematokrit dengan rumus sebagai berikut:
31
Pengamatan histopatologi kulit.
: Diamati dengan membuat histopat kemudian dihitung jumlah neutrofil dan makrofag serta kolagen yang terbentuk.
Pengolahan dan Analisis Data
Data dianalisis dengan metode sidik ragam (ANOVA) menggunakan komputer dengan program SPSS for Window. Uji lanjutan Duncan Multiple Range Test (DMRT) dilakukan apabila analisis keragaman menunjukkan pengaruh yang nyata.
(Serum : Pemeriksaan Zn, Feritin, beta karoten, dan retinol) (Plasma: Pemeriksaan hematologi (Eritrosit, leukosit, Hb, Ht, MCV, MCHC) Gambar Skema penelitia 24 ekor tikus
Adaptasi selama 10 hari Hanya diberi pakan dan minum secara ad libitum
Diambil darah Darah
Kulit luka 6 ekor tikus 6 ekor tikus 6 ekor tikus Diambil darah 6 ekor tikus 12 ekor tikus 12 ekor tikus Diberi jamu 24 ekor tikus Setelah masa adaptasi
Tidak diberi jamu
Tidak dilukai Tidak dilukai Dilukai
Dilukai
Histopat Plasma
Serum Plasma serum Histopat
Kulit luka Plasma Serum Diambil darah Plasma Serum