Penelitian ini terbagi menjadi dua tahap yaitu penelitian pendahuluan yang meliputi penghitungan ukuran tumbuhan antara lain panjang, lebar, dan tebal daun, serta panjang dan tebal tangkai. Penelitian utama meliputi analisis histologi, uji kandungan gizi, dan uji vitamin daun semanggi air (Marsilea crenata Presl).
3.3.1 Penelitian pendahuluan
Penelitian ini diawali dengan pengidentifikasian tanaman semanggi air yang dilakukan di laboratorium Identifikasi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, Bogor. Tanaman semanggi air yang didatangkan dari Surabaya yang tumbuh di persawahan dengan cara diambil dengan media tumbuhnya yaitu tanah dan sedikit air lalu dimasukkan ke dalam kantong plastik agar sampel tidak mudah layu.
Ketika sampai di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, IPB diukur panjang, dan lebar daun serta panjang dan tebal tangkai. Pengukuran panjang dan lebar daun, serta panjang tangkai dilakukan dengan penggaris stainless merk kenko. Pengukuran tebal tangkai menggunakan jangka sorong merk NSK. Setelah pengukuran selesai, tanaman semanggi air dibagi dua untuk analisis histologi dan uji proksimat serta vitamin. Untuk pengujian dilakukan preparasi berupa pembuangan batang dan akar yang diambil tangkai dan daunnya untuk dilakukan uji baik dalam keadaan segar maupun dikukus.
3.3.2 Penelitian utama
Penelitian utama tanaman semanggi terdiri dari lima tahap, yaitu analisis histologi, analisis proksimat serta analisis vitamin semanggi air segar dan kukus. Kerangka penelitian dapat dilihat pada Gambar 13.
Gambar 13. Kerangka penelitian utama 3.3.2.1 Analisis Histologi (Johansen 1940)
Analisis ini diawali dengan pembuatan preparat semanggi (Marsilea crenata) dan pengambilan foto objek pada mikroskop cahaya Olympus CH2O. Pembuatan preparat sendiri dimulai dengan fiksasi selama 24 jam dalam larutan FAA, setelah itu larutan fiksatif dibuang dan dicuci dengan etanol 50 % sebanyak 4 kali dengan waktu penggantian masing-masing selama 1 jam. Dehidrasi dan penjernihan dilakukan secara bertahap melalui perendaman dalam larutan seri Johansen I-VII.
Proses infiltrasi dilakukan dengan cara bahan dimasukkan dalam wadah berisi campuran TBA, minyak parafin, serta 1/3 parafin beku dan disimpan pada suhu kamar selama 1-4 jam yang dilanjutkan pengovenan pada suhu 58 oC selama 12 jam. Pergantian parafin dilakukan setiap 6 jam sekali sebanyak 3 kali pergantian. Proses penanaman dilakukan dengan penggantian parafin dan disimpan pada suhu ruang. Setelah proses penanaman selesai, dilakukan penyayatan dengan mikrotom Yamoto RV-240 putar setebal 10 μm. Hasil sayatan kemudian direkatkan pada gelas obyek yang telah diolesi albumin-gliserin dan
Semanggi air (Marsilea crenata presl)
Pengukuran
Preparasi
(Pembuangan batang dan akar) Analisis Histologi
Daun dan tangkai semanggi
Analisis Proksimat Pengukusan Analisis Vitamin
Analisis Vitamin Analisis Proksimat
Semanggi air (Marsilea crenata presl)
Preparasi
(Pembuangan batang dan akar)
Analisis Histologi Pengukuran
Daun dan tangkai semanggi
Analisis Proksimat Pengukusan Analisis Vitamin
ditetesi air. Gelas berisi pita parafin kemudian dipanaskan pada hot-plate dengan suhu 45 oC selama 3-5 jam.
Langkah selanjutnya adalah pewarnaan yang mana dilakukan dengan safranin 2 % dalam air dan fastgreen 0,5 % dalam etanol 95 %. Pada proses pewarnaan, gelas obyek direndam ke dalam larutan xilol 1 dan xilol 2 masing-masing selama 20 menit, dilanjutkan perendaman dalam etanol absolut 95 %, 70 %, 50 %, dan 30 % masing-masing 5 menit. Kemudian obyek dibilas dengan akuades dan dimasukkan ke dalam safranin 20 % selama satu hari. Tahap selanjutnya adalah gelas obyek dibilas ke dalam akuades dan dimasukkan ke etanol 30 %, 50 %, 70 %, 95 %, dan absolut masing-masing selama 5 menit. Setelah itu obyek dimasukkan ke dalam pewarna fast-green 0,5 % selama 30 menit. Gelas obyek kemudian direndam dalam xilol 1 dan xilol 2.
Penutupan dengan pemberian entellan atau Canada balsam setelah proses pewarnaan selesai dilakukan pada gelas obyek dan ditutup dengan gelas penutup. Setelah itu dilakukan pemberian label di sebelah kiri gelas obyek. Proses pemfotoan objek dilakukan dengan mikroskop cahaya merk Olympus DP12 dan kamera digital merk Olympus. Prosedur pembuatan preparat dapat dilihat pada Gambar 14.
Gambar 14. Proses pembuatan preparat 3.3.2.2 Analisis Proksimat
Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk mengetahui komposisi kimia yang ada pada suatu bahan. Analisis proksimat meliputi: analisis kadar air, abu, protein, lemak, dan karbohidrat. Analisis proksimat yang dilakukan meliputi uji kadar air dan uji kadar abu menggunakan metode oven, uji kadar lemak menggunakan metode sokhlet dan uji kadar protein mengggunakan metode kjeldahl serta uji kadar serat kasar.
(a). Analisis kadar air (AOAC 1995)
Prinsip dari analisis kadar air yaitu mengetahui kandungan atau jumlah kadar air yang terdapat pada suatu bahan. Tahapan analisis kadar air antara lain: pengeringan dimana cawan porselen di simpan dalam oven pada suhu 102-105 0C. Selanjutnya cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 30 menit) dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang hingga beratnya konstan. Setelah itu cawan dan daun semanggi seberat 5 gram ditimbang setelah terlebih dahulu dipotong kecil-kecil. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam oven dengan
Fiksasi
Pencucian
Dehidrasi dan Penjernihan
Infiltrasi
Penanaman
Penyayatan
Perekatan
Pewarnaan
Penutupan dan Pemberian Label
suhu 102-105 0C selama 3-5 jam kemudian dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang.
Perhitungan kadar air pada daun semanggi :
% Kadar air = B - C x 100 % B – A
Keterangan : A = Berat cawan kosong (gram)
B = Berat cawan dengan daun semanggi (gram) C = Berat cawan dengan daun semanggi setelah dikeringkan (gram).
(b). Analisis kadar abu (AOAC 1995)
Prinsip dari analisis kadar abu yaitu untuk mengetahui jumlah abu yang terdapat pada suatu bahan terkait dengan mineral dari bahan yang dianalisis. Tahapan pada analisis kadar abu yaitu cawan abu porselen dipijarkan dalam tungku pengabuan bersuhu sekitar 650 0C selama 1 jam. Cawan abu porselen tersebut didinginkan selama 30 menit. Setelah suhu tungku turun dilakukan penimbangan. Daun semanggi sebanyak 1-2 gram yang telah dipotong kecil-kecil dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam tungku secara bertahap hingga suhu 650 0C. Proses pengabuan dilakukan sampai abu berwarna putih. Setelah suhu tungku pengabuan turun menjadi sekitar 200 0C, cawan abu porselin didinginkan selama 30 menit dan ditimbang beratnya.
Perhitungan kadar abu pada daun semanggi :
% Kadar abu = C - A x 100 % B – A
Keterangan : A = Berat cawan abu porselen kosong (gram)
B = Berat cawan abu porselen dengan daun semanggi (gram)
C = Berat cawan abu porselen dengan daun semanggi setelah dikeringkan (gram).
(c). Analisis kadar protein (AOAC 1995)
Prinsip dari analisis protein, yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar ( crude protein ) pada suatu bahan. Tahapan yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi.
(1). Tahap destruksi
Tahap destruksi dilakukan dengan cara daun semanggi air ditimbang seberat 0,5 gram dan dimasukkan ke dalam tabung kjeltec. Satu butir kjeltab dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 ml H2SO4. Tabung yang berisi larutan 10 ml H2SO4 ini dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410 oC dan ditambahkan 10 ml air. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi bening.
(2). Tahap destilasi
Tahap ini dilakukan setelah tahap destruksi selesai dilakukan. Tahap destilasi sendiri terdiri dari 2 tahap, yaitu persiapan dan sampel. Tahap persiapan dilakukan dengan membuka kran air dan dilakukan pengecekan alkali serta air dalam tanki, tabung dan erlenmeyer berisi akuades kemudian diletakkan pada tempatnya. Tombol power pada kjeltec sistem ditekan lalu dilanjutkan dengan menekan tombol steam dan tungku beberapa lama sampai air di dalam tabung mendidih. Setelah itu steam dimatikan, tabung kjeltec dan erlenmeyer dikeluarkan dari alat kjeltec sistem. Tahap sampel dilakukan dengan meletakkan tabung yang berisi daun semanggi air yang sudah didestruksi ke dalam kjeltec sistem beserta erlenmeyer yang diberi asam borat. Destilasi dilakukan sampai volume larutan dalam erlenmeyer yang berisi asam borat mencapai 200 ml.
(3). Tahap titrasi
Titrasi merupakan tahap terakhir pada analisis kadar protein. Tahap ini dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan pada erlenmeyer berubah warna menjadi pink.
Perhitungan kadar protein pada daun semanggi :
% Nitrogen = (ml HCl daun semanggi – ml HCl blanko)x 0,1 N HClx14 x100 % mg daun semanggi
(d). Analisis kadar lemak (AOAC 1995)
Tahapan analisis kadar lemak antara lain yaitu daun semanggi air seberat 3 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring. Kertas saring tersebut dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak tersebut dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Saat itu juga tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet lalu dipanaskan pada suhu 40 0C dengan menggunakan pemanas listrik selama 16 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan ditampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak lalu labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 0C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W3).
Perhitungan kadar lemak pada daun semanggi % Kadar Lemak = W3 – W2 x 100 %
W1
Keterangan : W1 = Berat sampel daun semanggi (gram) W2 = Berat labu lemak tanpa lemak (gram) W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram)
(e) Analisis Kadar Serat Kasar (AOAC 1995)
Metode analisis kadar serat kasar yaitu sebanyak 1 gram sampel kering dilarutkan dengan 100 ml H2SO4 1,25 % dan dipanaskan hingga mendidih kemudian didestruksi selama 30 menit. Tahap selanjutnya adalah disaring menggunakan kertas saring Whatman (ф:10 cm) dan dengan bantuan corong Buchner. Residu hasil saringan dibilas dengan 20-30 ml air mendidih dan 25 ml air sebanyak 3 kali. Residu didekstrusi kembali dengan 100 ml NAOH 1,25 % selama 30 menit. Setelah itu disaring dengan cara seperti diatas dan dibilas berturut-turut dengan 25 ml H2SO4 1,25 %, 2,5 ml air sebanyak 3 kali, dan 25 ml alkohol. Residu beserta kertas saring dipindahkan ke cawan porselin dan dikeringkan dalam oven 130 oC selama 2 jam. Setelah dingin residu beserta cawan
porselin ditimbang (A), dan dimasukkan dalam tanur 600 oC selama 30 menit, lalu didinginkan dan ditimbang kembali (B).
Penghitungan kadar serat kasar pada daun semanggi
% Kadar serat kasar = bobot serat kasar x 100% bobot sampel kering
3.3.2.3 Analisis Vitamin
Analisis vitamin yang dilakukan meliputi uji kadar β karoten, vitamin C, dan total karoten, dari semanggi segar dan semanggi yang dikukus.
(a) Analisis vitamin C (Darryl M et al 1993)
Metode penetapan vitamin C dengan titrameter. Prinsip penetapan vitamin C yaitu melalui proses titrasi, larutan garam natrium dari 2,6 dichlorophenol indophenols (larutan dye) akan mengoksidasi vitamin C menjadi asam dehidroaskorbat. Sedangkan larutan dye menyebabkan larutan titrasi berwarna merah. Titik akhir titrasi tercapai bila membentuk warna jambu muda yang stabil selama 15 detik. Kadar vitamin C dihitung dengan membandingkan volume larutan dye yang diperlukan untuk titrasi contoh (bahan) terhadap volume larutan dye yang diperlukan untuk titrasi larutan standar.
(1) Pembuatan larutan contoh
Sampel ditimbang 10 g dan digerus dengan 10 g asam oksalat kristal di dalam mortar dengan alat penggerus. Kemudian campuran bahan dimasukan ke dalam labu ukur 250 ml, labu ukur diisi dengan air suling dan dikocok dan ditambahkan air suling hingga tanda tera. Setelah itu filtratnya disaring dan ditampung dalam Erlenmeyer bersih dan kering. Lalu dipipet 10 ml dan dimasukan ke dalam erlenmeyer 50 ml untuk ditritasi dengan larutan dye sampai warna merah jambu muda selama 15 detik.
(2) Pembuatan larutan vitamin C
Vitamin C murni ditimbang 0,02 g dan ditambah asam oksalat kristal. Kemudian dimasukan ke dalam labu ukur 100 ml dan diencerkan dengan air suling sampai tanda tera. Lalu dipipet 10 ml dan dimasukan ke dalam erlenmeyer
50 ml untuk ditritasi dengan larutan dye sampai warna merah jambu muda. Setelah itu ditunggu selama 15 detik samapi warna tidak berubah.
(3) Perhitungan
Vitamin C dalam mg per 100 g bahan = 100 x fp x v x E A
Keterangan : A = berat bahan (g) Fp = factor pengenceran
V = ml larutan dye yang digunakan E = akivalen vitamin C
(b) Analisis β karoten (Darryl M et al 1993)
Analisis β karoten menggunakan beberapa pereaksi, yaitu: hexan : aceton (1:1), KOH dalam methanol 5 %, hexan aceton, aquades, gas N2 dan Na2SO4. (1) Ekstraksi
Sampel kering yang sudah dihomogenisasikan ditimbang 2-5 gram, ditambah larutan hexan aceton, 3 x 10 ml lalu divortek selama 30 detik. Larutan pengekstrak dikoleksi dalam tabung reaksi gelap dan tertutup kemudian ditambah aquades 5 ml dan divortek kembali 30 detik sampai terpisah. Lapisan atas dipisahkan dan pelarutnya diuapkan dengan gas N2.
(2) Saponifikasi
Setelah semua pelarutnya hilang ditambahkan 15 ml KOH dalam methanol, head space dalam tabung diisi dengan gas N2 untuk menghindari oksidasi oleh O2 dan ditutup rapat. Kemudian dipanaskan dalam water bath 65 0C selama 30 menit dan didinginkan dengan air mengalir.
(3) Pengekstrakan kembali
Selanjutnya adalah penambahan air ke dalam tabung yang telah didinginkan sebanyak 5 ml, divortek 30 detik dan dicuci dengan hexan 3 x 15 ml. Hexan yang telah dikoleksi dicuci dengan air 3 x 3 ml lalu hexan disaring dengan Na2SO4 dan diuapkan dengan gas N2 serta dilarutkan dengan fase gerak HPLC.
Ekstrak yang berisi β karoten dapat dianalisis menggunakan HPLC. Sistem yang dianjurkan adalah sebagai berikut:
Fase gerak : acetonitril : diclorometan : metanol (70:20:10) Kolom : reverse phase C18
Kecepatan aliran : 1 ml/menit
Detektor : UV visible 460 nm Rekorder : 1 cm/menit
(b) Total karoten (Darryl M et al 1993)
Sampel kering yang sudah dihomogenisasikan ditimbang 2-5 gram, ditambah larutan hexan aceton, 3 x 10 ml lalu divortek selama 30 detik. Larutan pengekstrak dikoleksi dalam tabung reaksi gelap dan tertutup kemudian ditambah aquades 5 ml dan divortek kembali 30 detik sampai terpisah. Lapisan atas dipisahkan dan pelarutnya diuapkan dengan gas N2 serta dilarutkan dengan fase gerak HPLC.
Ekstrak yang berisi total karoten dapat dianalisis menggunakan HPLC. Sistem yang dianjurkan adalah sebagai berikut:
Fase gerak : acetonitril : diclorometan : metanol (70:20:10) Kolom : reverse phase C18
Kecepatan aliran : 1 ml/menit
Detektor : UV visible 460 nm Rekorder : 1 cm/menit