METODOLOGI PENELITIAN
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah 16 box plastik dimodifikasi ukuran panjang 34.5 cm, lebar 28 cm, dan tinggi 12 cm sebagai kandang, tutup kawat, sonde lambung, alas kandang berupa kain perca yang dicuci setiap hari, tempat pakan, botol minum, sonde lambung, syringe 1 ml, jarum pentul, sterofoam, tissu, scalpel, gunting, pinset, silet, pot plastik, object glass, spidol, label, dispenser, sarung tangan, sikat, timbangan digital, tissue cassete, Sakura® automatic tissue processor, inkubator, mikrotom, tali kenur, talenan, waterbath, mikroskop cahaya, digital electronic eyepiece camera beserta satu set komputer, dan perangkat lunak Image J®.
Hewan coba yang digunakan untuk penelitian ini yaitu mencit (Mus musculus) dewasa siap kawin berumur 4 minggu sebanyak 72 ekor dengan perbandingan 36 ekor jantan dan 36 ekor betina dengan bobot rata-rata mencit jantan 16.5 gram dan mencit betina 15.8 gram. Sedangkan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak minyak jintan hitam siap pakai komersial, campuran ekstrak minyak jintan hitam dengan madu sediaan liquid siap pakai komersial dengan rasio 1:20, pakan, air mineral isi ulang, desinfektan (Bayclin® dan detergen), anthelmintik Albendazole 5%, antibiotik Clavamox® 25mg/ml, antiprotozoa Flagyl® (bahan aktif Metronidazole), Buffer Neutral Formalin (BNF 10%), xylol, alkohol bertingkat, parafin, Mayer’s Hematoxilin-Eosin, lithium karbonat, dan pewarna Giemsa.
3.3 Metode
3.3.1 Preparasi Hewan Coba
Penelitian ini menggunakan 72 ekor mencit yang diperoleh dari peternakan FKH-IPB dengan perbandingan 36 ekor jantan dan 36 ekor betina. Mencit dipelihara di dalam box yang diberi alas kain selama 2 bulan. Penelitian ini terbagi menjadi tiga tahap, yaitu masa persiapan pemeliharaan, masa perlakuan, dan masa pengamatan jaringan histopatologi sumsum tulang dan ulas darah.
Mencit yang baru datang diistirahatkan selama dua hari untuk beradaptasi dengan kandang. Setelah itu, mencit dicekok dengan anthelmintik single dose dengan dosis 10 mg/kg BB. Kemudian selama lima hari berturut-turut setelah itu, mencit dicekok dengan antibiotik dengan dosis 0.001 mg/kg BB. Terakhir, mencit dicekok dengan antiprotozoa selama lima hari berturut-turut dengan dosis 0.03 mg/kg BB. Selama masa pemeliharaan dan perlakuan, mencit diberi pakan sebanyak 5 gram/ekor/hari dan air minum secara ad libitum.
3.3.2 Kandang Hewan Coba
Box modifikasi (dipasang tempat pakan dan minum) yang digunakan sebagai kandang dibersihkan setiap hari dengan menggunakan Bayclin® dan dijemur hingga kering dan diberi alas kain. Mencit dibagi menjadi 4 kelompok perlakuan. Mencit jantan dan betina ditempatkan dalam kandang yang terpisah.
Gambar 12 Kandang hewan coba.
3.3.3 Pakan dan Minum
Mencit diberi pakan berupa pelet komersial sebanyak 5 gram/ekor/hari dan minum air mineral isi ulang secara ad libitum. Botol minum dibersihkan dan diganti dengan air mineral yang baru setiap 3 hari sekali.
23
3.3.4 Kelompok Perlakuan
Mencit jantan dan mencit betina pada masa perlakuan masing-masing dibagi menjadi 4 kelompok. Setiap kelompok terdiri dari 9 ekor mencit. Kelompok pertama merupakan kelompok kontrol negatif yang tidak diberi perlakuan, tetapi dicekok dengan aquadest sebanyak 0.1 ml/ekor/hari. Kelompok kedua merupakan kelompok preventif yang dicekok dengan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.1 ml/ekor/hari. Kelompok ketiga merupakan kelompok kuratif yang dicekok dengan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.2 ml/ekor/hari. Kelompok keempat merupakan kelompok yang dicekok dengan campuran ekstrak minyak jintan hitam dengan madu sebanyak 0.3 ml/ekor/hari. Dosis pemberian yang digunakan berasal dari dosis anjuran yang terdapat pada label sediaan komersial yang telah dikonversikan sesuai bobot badan mencit. Masa perlakuan ini berlangsung selama 2 bulan karena pemberian terapi herbal memerlukan waktu yang lebih panjang sampai munculnya tanda klinis atau efek setelah pemberian terapi.
Gambar 13 (A) Posisi handling atau memegang, (B) posisi pencekokan, (C) proses pencekokan pada mencit.
3.3.5 Nekropsi dan Pengambilan Sampel Darah dan Organ
Setelah masa perlakuan berakhir, kemudian dilakukan penarikan ekor dan penekanan leher serta menariknya ke arah anterior (dislokasio atlanto-occipitalis) pada mencit. Setelah mencit tersebut mati, kemudian dinekropsi untuk pengambilan organ dan sampel darah dari jantung. Organ yang diambil dijadikan sebagai preparat histopatologi dan sampel darah yang dibuat sediaan ulas darah
kemudian dapat menjadi bukti ilmiah mengenai khasiat dari jintan hitam (Nigella sativa).
Sediaan ulas darah dibuat dengan mengambil sampel darah langsung dari jantung mencit saat dinekropsi menggunakan syringe 1 ml. Sebanyak 2 buah object glass bersih disiapkan dan sampel darah diteteskan di atas object glass pertama kira-kira 2 cm dari ujung. Sedangkan object glass kedua diletakkan di depan tetesan darah membentuk sudut 30ºC. Kemudian object glass kedua digeser mendekati tetesan darah dengan tetap membentuk sudut 30ºC sampai menyinggung tetesan darah sehingga darah menyebar sepanjang sudut antara kedua object glass. Segera setelah darah menyebar, dengan hati-hati dan tanpa mengangkat object glass ditarik atau didorong menjauhi tetesan darah ke permukaan object glass yang lebih luas, sehingga akan terbentuk preparat ulas darah yang tipis. Setelah preparat tersebut dikeringudarakan kemudian difiksasi ke dalam cawan berisi metil alkohol (methanol) dan didiamkan selama 3-5 menit lalu diangkat dan dikeringudarakan kembali.
Gambar 14 Pembuatan Preparat Ulas Darah
(sumber: Experimental Biosciences 2005).
Awal proses pembuatan preparat histopatologi tulang, pertama-tama mencit yang telah diambil bagian dari os femur kemudian diawetkan dalam larutan BNF 10%. Setelah larutan berpenetrasi sempurna ke dalam organ (kurang lebih 1 minggu), langkah selanjutnya adalah trimming yaitu membersihkan organ dari sisa otot yang masih melekat dan kemudian direndam selama 2 hari ke dalam larutan asam nitrat 5% untuk proses dekalsifikasi hingga tulang menjadi lunak
25
seperti jaringan dan dapat dipotong. Tulang yang telah lunak tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tissue basket untuk diproses dehidrasi di dalam mesin automatic tissue processor.
3.3.6 Pewarnaan Preparat Ulas Darah
Preparat ulas darah yang telah difiksasi dalam metil alkohol (methanol) dan dikeringudarakan, kemudian dimasukkan ke dalam cawan berisi larutan pewarna Giemsa selama 30 menit kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringudarakan dan tepi preparat dilap menggunakan tissu. Preparat ulas darah siap diamati di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 100× lensa obyektif dan 10× lensa okuler.
3.3.7 Pembuatan dan Pewarnaan Preparat Histopatologi Tulang
Bagian dari os femur yang telah didekalsifikasi dalam larutan asam nitrat 5% selama 2 hari kemudian dimasukkan ke dalam tissue cassete dan difiksasi kembali dalam larutan BNF 10% selama 2 hari. Setelah itu dilakukan proses dehidrasi dengan cara merendam sediaan tersebut berturut-turut ke dalam alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90%, alkohol 96%, alkohol absolut I, alkohol absolut II, dan alkohol absolut III masing-masing selama 2 jam. Kemudian dilakukan proses clearing dalam cairan xylol I, xylol II, dan xylol III selama masing-masing 40 menit. Proses selanjutnya adalah embedding ke dalam parafin I, parafin II, parafin III, dan parafin IV masing-masing selama 30 menit. Masing-masing proses perendaman tersebut berjalan secara otomatis dalam tissue processor, kemudian dibuat blok parafin.
Setelah itu, jaringan dipotong dengan ketebalan 5 µm dengan menggunakan mikrotom. Hasil potongan mikrotom berbentuk pita (ribbon), diletakkan di atas permukaan air hangat (45ºC) dalam waterbath dengan tujuan untuk menghilangkan lipatan akibat pemotongan. Setelah itu, sediaan diangkat dari permukaan air dengan object glass. Kemudian sediaan dikeringkan di dalam inkubator suhu 60ºC selama satu malam. Setelah itu, dilakukan proses deparafinisasi dan rehidrasi, kemudian diwarnai dengan pewarnaan Mayer’s
Hematoxilin selama 8 menit, dibilas dengan air mengalir, dicuci dengan lithium karbonat selama 15-30 detik, dibilas dengan air, kemudian diwarnai dengan
pewarna Eosin selama 2 menit. Setelah itu, sediaan dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan warna Eosin yang berlebih sebelum dikeringkan. Setelah ditetesi dengan perekat permount, sediaan kemudian ditutup dengan cover glass, dan dibiarkan kering sesuai dengan metode bagian Patologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Preparat histopatologi siap diamati di bawah mikroskop cahaya.
3.3.8 Pengamatan Diferensiasi Leukosit Sediaan Ulas Darah
Gambaran diferensiasi leukosit dapat dilihat dengan melakukan pengamatan pada preparat ulas darah yang telah diberi pewarnaan Giemsa menggunakan metode Image J®. Dari preparat ulas darah dibuat foto dengan perbesaran 1000× dengan diberi minyak emersi. Dari setiap sampel yang difoto diamati dan dihitung kelompok leukosit sampai sebanyak 100 sel. Untuk setiap 100 sel leukosit yang ditemukan dihitung dan dikelompokkan kedalam jenis limfosit, monosit, neutrofil, eosinofil, dan basofil. Untuk setiap preparat dilakukan pengulangan sebanyak 5× dan dilakukan penghitungan akhir dengan menghitung rataan dari kelima ulangan. Dari data hasil diferensiasi leukosit setiap kelompok perlakuan kemudian dibandingkan secara statistik.
3.3.9 Pengamatan Preparat Histopatologi Sumsum Tulang
Sumsum tulang diperiksa terhadap luas jaringan sumsum tulang menggunakan metode Image J®. Dari preparat histopatologi tulang dibuat foto dengan perbesaran 40×. Setiap sampel difoto hingga 5× ulangan dan diukur luasannya. Dari hasil pengukuran akan diperoleh luasan sumsum tulang dan luasan rongga tulang. Kemudian dihitung persen kepadatan sumsum tulangnya terhadap rongga tulang tersebut lalu dilakukan penghitungan akhir dengan menghitung rataan persen kepadatan dari kelima ulangan. Dari data hasil persen kepadatan sumsum tulang tiap kelompok perlakuan kemudian dibandingkan secara statistik.
3.3.10 Analisis Data
Hasil pengamatan berupa data yang kemudian dianalisis secara statistik menggunakan metode one way ANOVA kemudian diuji lanjutan dengan metode Duncan.
27