Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli 2010-April 2011 di Kandang Hewan Laboratorium dan Laboratorium Histopatologi, Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi FKH IPB. Ekstraksi tanaman obat dilakukan di Laboratorium Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balitro). Uji tantang virus AI dilakukan di laboratorium Biosafety Level 3 (BSL3) milik PT. Vaksindo Satwa Nusantara, Cicadas, Gunung Putri, Bogor.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan digital, tabung steril, penggiling, gelas ukur, corong pisah, sentrifus, labu penyuling, inkubator, vorteks, penangas air, tabung erlenmeyer, blender, kapas, tissue, tabung kromatografi, dan tabung destruksi.
Bahan yang digunakan adalah Day Old Chick (DOC), Virus strain H5N1/NGK/2003, tanaman Sambiloto, Adas, Sirih Merah, metanol, etanol, aseton dingin, etil asetat, kloroform, akuades, hematoksilin dan eosin.
Metode Penelitian
Ekstraksi Tanaman obat dan Pembuatan Formula
Pembuatan ekstrak tanaman obat dan formula dari tanaman Sirih Merah, Adas, dan Sambiloto telah dilakukan di laboratorium Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balitro) Bogor, dari mulai penyediaan bahan baku maupun ekstraksinya.
Proses ekstraksi tanaman terstandar dan pembuatan formula, terlebih dahulu dilakukan pemanenan pada bagian tanaman yang akan dimanfaatkan. Sirih Merah dan Sambiloto diambil daunnya, sedangkan Adas yang dipanen adalah buahnya. Bagian tanaman yang telah diambil kemudian diekstrak dan setiap ekstrak dari
tiga jenis bagian itu kemudian dicampur sesuai dengan kadar masing-masing bahan aktif yaitu andrografolid, anetol, dan piperin. Konsentrasi bahan aktif yang dipakai dalam pembuatan formula yaitu 5%, 7.5%, dan 10%.
Pemeliharaan Hewan Coba
Sebanyak 32 ekor ayam day old chick (DOC) pedaging strain Cobb dipelihara di kandang percobaan Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Bobot badan rata-rata adalah 38 g, dibagi dalam 4 kelompok yang masing-masing kelompok berjumlah 8 ekor DOC dengan pemberian pakan dan minum ad libitum. Pada hari pertama, ayam diadaptasikan dengan pemberian air gula selama 3 jam, selanjutnya setiap kelompok ayam selain kontrol diberikan ekstrak tanaman obat dari umur 7 hari sampai umur 28 hari. Tujuan diberikannya tanaman obat pada umur 7-28 hari agar tanaman obat bisa di metabolisme secara optimal di dalam tubuh. Aplikasi tanaman obat dengan cara dicekok. Komposisi formula ekstrak tanaman obat, yaitu sebagai berikut :
Formula A : ekstrak etanol tanaman obat dengan konsentrasi andrografolid, piperin, dan anetol masing-masing setara 5.0% dalam formula Formula B : ekstrak etanol tanaman obat dengan konsentrasi andrografolid,
piperin, dan anetol masing-masing setara 7.5% dalam formula Formula C : ekstrak etanol tanaman obat dengan konsentrasi andrografolid,
piperin, dan anetol masing-masing setara 10% dalam formula Komposisi gabungan dari tanaman obat di atas diharapkan bisa bekerja secara sinergis. Pemberian pakan, penggantian air minum, dan pengukuran suhu dilakukan pada pagi dan sore hari. Pemberian Vaksin Newcastle Disease (ND) pada umur 4 hari dan pemberian vaksin Infectious Bursal Disease (IBD) pada umur 14 hari. Vaksin AI diberikan pada minggu ke-3 secara intranasal dengan dosis 106 EID50/0.1 mL/ekor. Ekstrak tanaman obat diberikan lagi selama satu minggu pasca vaksinasi lalu dilanjutkan dengan pemberian air minum biasa selama satu minggu atau hingga uji tantang dengan virus AI H5N1 pada umur lima minggu. Pada tahap akhir pemeliharaan, ayam dibawa ke fasilitas Biosafety Level 3 (BSL 3) milik PT. Vaksindo Satwa Nusantara di Cicadas, Gunung Putri, Bogor untuk uji tantang dengan virus AI.
Uji Tantang Virus
Ayam dibawa ke fasilitas Biosafety Level 3 (BSL 3) milik PT. Vaksindo Satwa Nusantara di Cicadas, Gunung Putri, Bogor untuk uji tantang dengan virus AI strain H5N1/NGK/2003 intranasal dengan dosis 106 EID50/0.1 mL/ekor. Selama tujuh hari setelah uji tantang, ayam diamati kematiannya, untuk memperoleh dan melihat data kematian ayam pasca tantang AI H5N1. Ayam yang masih tersisa pada hari terakhir pengamatan, dieutanasi dengan cara emboli udara secara intracardial.
Pengamatan Histopatologi
Setelah dilakukan uji tantang virus H5N1 di BSL3, ayam yang mati dinekropsi dan diambil organ limfoidnya untuk pembuatan sediaan histopatologi pada gelas objek dan dilakukan pewarnaan Haematoxyline Eosin (HE).
Pengamatan histopatologi organ limpa, bursa Fabricius, dan timus dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya, perbesaran 40 X 10 (40 kali objektif dan 10 kali okuler) pada 20 kali lapangan pandang. Evaluasi terhadap perubahan mikroskopis masing-masing organ dilakukan dengan mengamati perubahan lesio. Perubahan lesio tersebut bisa dijadikan sebagai data pendukung terhadap hasil penghitungan persentase organ limfoid, dari evaluasi tersebut dapat dilihat dan dibandingkan organ yang persentase sel limfoidnya kecil menunjukkan tingkat perubahan lesio yang parah atau sebaliknya. Preparat organ yang dievaluasi adalah limpa, timus, dan bursa Fabricius dari kelompok perlakuan kontrol negatif, kelompok I, II, dan III.
Perhitungan Persentase Organ Limfoid
Penghitungan persentase organ limfoid yaitu limpa, bursa Fabricius, dan timus dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya dan dilakukan pada bagian yang fungsional pada tiap-tiap organ. Analisis histopatologi dilakukan dengan menggunakan software macbiophotonics imageJ®. Bagian yang fungsional pada limpa adalah pulpa putih, pada bursa Fabricius adalah folikel limfoid, sedangkan pada timus adalah bagian korteks. Persentase organ limfoid limpa diketahui dengan cara menghitung persentase pulpa putihnya, dihitung
dengan cara mengukur luas pulpa putih yang nantinya dibandingkan dengan jumlah sel limfoid. Pulpa putih yang diambil sebanyak 5 bagian secara acak yang diharapkan mewakili seluruh bagian limpa.
Persentase organ limfoid bursa Fabricius diketahui dengan cara menghitung luas plika dan luas setiap folikel limfoid, lalu dibandingkan dan dikali 100%, maka diperoleh persentase bursa Fabricius, diambil dua buah plika dari setiap kelompok yang bisa mewakili seluruh bagian organ.
Persentase organ limfoid timus diketahui dengan cara menghitung luas lobus dibandingkan dengan luas korteks lalu dikali 100% agar diperoleh persentase dari timus, diambil 3 buah lobus timus yang diharapkan bisa mewakili persentase organ timus pada setiap kelompok.
Analisis Data
Data kematian dan performa broiler dianalisis secara deskriptif. Evaluasi data histopatologi organ limfoid dianalisa secara statistik menggunakan analisis sidik ragam atau dengan nama lain analysis of variant (ANOVA) digunakan untuk membandingkan perbedaan masing-masing individu dalam satu kelompok, dan dilanjutkan dengan uji Duncan untuk melihat perbedaan antar kelompok perlakuan.
