3. METODOLOGI
3.4. Analisis
3.4.3. Uji mikrobiologi
Uji mikrobiologi dilakukan untuk mengetahui cemaran biologis pada bahan baku dan pindang ikan tongkol. Uji mikrobiologi terdiri dari pengujian
Total Plate Count (TPC), bakteri Escherichia coli, dan Salmonella.
(1) Pengujian Total Plate Count (TPC) atau penentuan angka lempeng total (ALT) pada produk perikanan (SNI 01-2332.3-2006).
a) Preparasi Contoh
Sampel diambil secara acak dan dipotong kecil – kecil hingga beratnya 300 gram, kemudian dimasukkan dalam wadah atau plastik steril. Selanjutnya ditambahkan 225 ml larutan Bufferfield’s phosphate buffered dan dihomogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran10-1, kemudian
dengan pipet steril diambil 1 ml homogenat diatas dan dimasukkan ke dalam 9 ml larutan bufferfield’s phosphate buffered untuk mendapatkan pengenceran 10-2. Pengenceran selanjutnya (10-3), dilakukan dengan mengambil 1 ml sampel dari pengenceran 10-2 dimasukkan kedalam 9 ml larutan bufferfield’s phosphate
buffered. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali.
Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk pengenceran 10-4, 10-5 dan seterusnya sesuai kondisi sampel.
b) Metode agar tuang/pour plate method
Sampel yang telah dienceran 10-1, 10-2 dan seterusnya, dipipet masing-masing 1 ml dan dimasukan ke dalam cawan petri steril. Prosedur tersebut dilakukan secara duplo untuk setiap pengenceran.
Media Plate Count Agar (PCA) yang telah didinginkan dalam waterbath hingga mencapai suhu 45 oC, dituangkan sebanyak 12-15 ml ke dalam masing-masing cawan yang sudah berisi sampel. Cawan yang telah terisi sampel dan media PCA digerakkan ke depan ke belakang ke kiri dan ke kanan supaya tercampur sempurna. Setelah agar menjadi padat, untuk penentuan mikroorganisme aerob cawan-cawan tersebut diinkubasi dalam posisi terbalik dalam inkubator selama 48 jam pada suhu 22 oC (psikrofilik), 35 oC(mesofilik), dan 45 oC (termofilik). Mikroorganisme anaerob ditentukan dengan
anaerobic jar, dengan cara cawan-cawan tersebut diinkubasikan dalam anaerobic jar dengan posisi terbalik dan dimasukkan ke dalam inkubator selama 48 jam
pada suhu 22 oC (psikrofilik), 35 oC (mesofilik), dan 45 oC (thermofilik).
Pengenceran yang digunakan dicatat dan dilakukan penghitungan jumlah total koloni. Jumlah koloni bakteri yang dihitung adalah cawan petri yang mengandung koloni bakteri antara 25 koloni-250 koloni dan bebas spreader.
(2) Pengujian Bakteri Escherichia coli (SNI 01-2332.1-2006)
Pengujian bakteri Escherichia coli dilakukan dalam beberapa tahap. Tahap uji tersebut adalah uji pendugaan, uji penegasan, uji morfologi, dan uji biokimia. a) Tahap analisis
Pengenceran 10-2 disiapkan dengan cara melarutkan 1 ml larutan 10-1 ke dalam 9 ml larutan pengencer Butterfield’s Phosphate Buffered. Pengenceran selanjutnya dilakukan sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh.
Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali. Sebanyak 1 ml larutan dipindahkan dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri atau 5 seri tabung
Lauryl Ttryptose Broth (LTB) yang berisi tabung durham. Tabung-tabung
tersebut diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 oC. Selanjutnya diperhatikan gas yang terbentuk setelah inkubasi 24 jam dan diinkubasikan kembali tabung-tabung negatif selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
b) Uji pendugaan Escherichia coli (presumptive Escherichia coli)
Setiap tabung LTB yang positif diinokulasi dengan jarum ose ke tabung yang berisi larutan EC Broth dan tabung durham. Selanjutnya tabung-tabung tersebut diinkubasi dalam waterbath sirculation selama 48 jam pada suhu 45 oC. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari cairan yang ada dalam tabung yang diinkubasi. Tabung-tabung tersebut diperiksa setelah 24 jam diinkubasi, untuk menguji timbulnya gas. Apabila tidak menghasilkan gas atau negatif, diinkubasi kembali sampai 48 jam. Tabung yang positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. Selanjutnya ditentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung-tabung EC yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nilainya dinyatakan sebagai “APM/g faecal coliform”. c) Uji penegasan Escherichia coli (confirmed Escherichia coli)
Tabung-tabung EC Broth positif diambil dan digoreskan ke LEMB agar dengan menggunakan jarum ose, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC. Koloni Escherichia coli akan memberikan ciri yang khas, yaitu terdapat warna hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik. Beberapa koloni (typical) Escherichia coli diambil dari masing-masing cawan LEMB dan digoreskan ke media PCA miring dengan jarum tanam, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC. Jika tidak ada koloni yang khas (typical), pindahkan satu atau lebih koloni yang tidak khas (typical) Escherichia coli ke media PCA miring.
d) Uji morfologi
Prosedur uji morfologi dilakukan dengan pewarnaan gram dari setiap koloni
24 jam. Dengan menggunakan mikroskop, bakteri Escherichia coli termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek atau coccus.
e) Uji biokimia 1. Produksi indol ( I )
Sebanyak satu ose koloni E. coli dari PCA miring yang diduga positif diambil dan dilakukan inokulasi kedalam tryptone Broth serta diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC. Uji Indol dilakukan dengan menambahkan 0,2 ml-0,3 ml pereaksi Kovacs. Reaksi menunjukkan positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif jika terbentuk cincin warna kuning.
2. Uji voges proskauer (VP)
Sebanyak satu ose koloni E. coli dari PCA miring yang diduga positif diambil dan dilakukan inokulasi kedalam MRVP Broth serta diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 0C. Dipindahkan 1 ml dari setiap MRVP Broth yang tumbuh ke tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm steril dan ditambahkan 0,6 ml larutan alpha naphtol dan 0,2 ml 40 % KOH, dan dikocok. Untuk mempercepat reaksi ditambahkan sedikit kristal kreatin. Selanjutnya dikocok kembali dan didiamkan selama 2 jam. Reaksi menunjukkan positif jika terbentuk warna merah muda eosin sampai merah mirah delima (ruby).
3. Uji methyl red (MR)
Media MRVP Broth di atas diinkubasi kembali selama 48 jam pada suhu 35 0C. Selanjutnya diambahkan 5 tetes indikator Methyl red pada setiap MRVP
Broth. Reaksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk warna
kuning.
4. Uji sitrat (C)
Sebanyak 1 ose dari PCA miring digoreskan ke permukaan simmon citrat
agar. diinkubasi selama 96 jam pada suhu 35 0C. Reaksi positif jika terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau.
5. Produksi gas dari laktosa
Sebanyak 1 ose dari PCA miring diinokulasikan kedalam LTB, dan diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 35 0C. Reaksi positif jika menghasilkan
gas pada tabung durham. Interpetasi hasil pengujian bakteri Escherichia coli dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Interpetasi Hasil Pengujian Bakteri Escherichia coli (SNI 01-2332.1-2006)
Kriteria Biotipe 1 Biotipe 2
Gas pada tabung LTB + +
Indol + -
MR + +
VP - -
Citrat - -
Uji Morfologi Gram negatif, bentuk batang pendek berspora
Gram negatif, bentuk batang pendek tidak berspora
(3) Pengujian Bakteri Salmonella (SNI –01-2332.2-2006)
Prinsip dasar uji bakteri Salmonella adalah dengan menumbuhkan terlebih dahulu koloni Salmonella dari sampel yang diuji pada media pengkayaan, kemudian dideteksi dengan menumbuhkannya pada media agar selektif. Koloni-koloni yang diduga Salmonella (suspected colonies) pada media selektif diisolasi dan dilanjutkan dengan konfirmasi melalui uji biokimia dan uji serologi untuk meyakinkan ada atau tidaknya bakteri Salmonella.
Sampel ditimbang sebanyak 25 g, kemudian dimasukkan ke dalam wadah atau plastik steril dan ditambahkan 225 ml larutan Lactose Broth. Sampel yang akan dianalisis dihomogenkan selama 2 menit dan dikocok hingga rata serta dikendurkan tutup wadah secukupnya. Selanjutnya sampel diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC. Sebanyak 0,1 ml larutan sampel dipindahkan ke dalam 10 ml Rappaport-Vassiliadis (RV) medium dan 1 ml larutan sampel ke dalam 10 ml Tetrathionate Broth (TTB). Selanjutnya 1 ml larutan sampel dipindahkan ke dalam masing-masing 10 ml TTB. RV medium diinkubasi selama 24 jam pada suhu 42 oC (Waterbath) dan inkubasi TTB selama 24 jam pada suhu 43 oC (Waterbath).
Tabung dikocok menggunakan vortex dan digoreskan TTB yang telah diinkubasi ke dalam media Hectoen Enteric (HE), Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) agar, dan Bismuth sulfite Agar (BSA). Media BSA disiapkan sehari sebelum digunakan untuk analisis, dan simpan di tempat gelap pada suhu ruang. Tahap berikutnya digoreskan ke dalam media yang sama dari RV Broth. Cawan
HE, XLD, dan BSA diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC, kemudian dilakukan pengamatan akan kemungkinan adanya koloni Salmonella.
Koloni Salmonella diambil 2 atau lebih dari masing-masing media agar selektif setelah 24 jam inkubasi. Kriteria koloni-koloni Salmonella yang khas (typical) pada masing-masing media adalah sebagai berikut :
1) HE Agar, koloni hijau kebiruan sampai biru dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur Salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.
2) XLD Agar, koloni merah jambu (pink) dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur Salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.
3) BSA, koloni coklat, abu-abu atau hitam, kadang-kadang metalik. Biasanya media di sekitar koloni pada awalnya berwarna cokelat, kemudian berubah menjadi hitam (halo effect) dengan semakin lamanya waktu inkubasi. Apabila koloni yang khas (typical) tumbuh pada BSA setelah 24 jam inkubasi, diambil 2 koloni atau lebih, kemudian diinkubasikan kembali media BSA selama 24 jam. Setelah 48 jam inkubasi, diambil 2 atau lebih koloni yang khas (typical) yang tumbuh pada media BSA. Pengambilan ini dilakukan jika hanya koloni yang tumbuh pada media BSA yang diinkubasi selama 24 jam memberi reaksi yang tidak sesuai pada Triple Sugar Iron (TSI) dan Lysine Iron Agar (LIA), yang menjadikan kultur ini dinyatakan sebagai bukan Salmonella.
Bagian tengah koloni diambil menggunakan jarum inokulasi steril dan digoreskan ke permukaan media TSI agar, dilanjutkan dengan menggoreskan jarum tersebut pada media LIA dengan cara menusuk agar tegak lebih dahulu, setelah itu goreskan pada media agar miring. Kedua media tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC dengan membiarkan tutup sedikit kendur untuk mencegah terbentuknya H2S. Pengamatan dilakukan untuk kengetahui adanya koloni salmonella.
Sebanyak satu ose dari media TSI diambil menggunakan jarum inokulasi steril, dimasukkan kedalam Indol, MR-VP, Simmon Citrat Agar, Dulcit, Lactose,
pada suhu 35 oC. Media indol yang telah diinkubasi 24 jam, dilanjutkan dengan uji KCN, malonat, dan uji indol menggunakan pereaksi Kovaks.
Pengujian Methyl Red dilakukan dengan memindahkan satu ml MR-VP Broth yang telah diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 °C ke dalam tabung reaksi steril dan diinkubasikan kembali MR-VP Broth selama 48 jam pada suhu 35°C. Sebanyak 0,6 ml alpha naphtol ditambahkan dan dikocok, ditambahkan lagi 0,2 ml larutan 40 % KOH dan kocok kembali. Kristal keratin ditambahkan sedikit untuk mempercepat reaksi dan hasilnya dapat diamati setelah 4 jam. Pengujian Methyl red (MR) ditambahkan 5-6 tetes indikator Methyl Red kedalam media MR-VP yang telah diinkubasi selama 96 jam. Umumnya, Salmonella memberikan reaksi positif, ditandai dengan terjadinya difusi warna merah pada media. Reaksi positif ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna menjadi merah muda eosin sampai merah delima (ruby) pada media. Terjadinya warna kuning menunjukan reaksi negatif. Salmonella memberikan reaksi VP negatif.
Uji serologi Polyvalent Flagellar (H) dapat dilakukan setelah uji biokimia. Sebanyak satu ose dari masing-masing TSI Agar yang memberikan reaksi negatif dipindahkan ke dalam 5 ml BHI Broth, dan diinkubasi selama 4-6 jam pada suhu sampai terlihat pertumbuhan. Sebanyak 2,5 ml larutan Formanilized Physiological
Saline ditambahkan ke dalam BHI Broth (untuk uji pada hari yang sama) atau
5 ml Trypticase Soy-Tryptose Broth (TSTB) dan inkubasi selama 24 jam pada suhu 35oC, 2,5 ml larutan Formanilized Physiological Saline ke dalam TSTB (untuk uji pada hari berikutnya).
Sebanyak 2 kultur dari TSI (contoh dan control) yang telah diberi
Formanilized Physiological Saline dan uji dengan Salmonella Polyvalent Flagellar (H) disiapkan, kemudian dimasukkan 0,5 ml larutan Salmonella Polyvalent Flagellar (H) antisera dalam tabung serologi 10 x 75 mm atau
13 x 100 mm. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml antigen yang akan diuji. Disiapkan kontrol saline dengan mencampur 0,5 ml Formanilized Physiological
Saline dengan 0,5 ml formalinized antigen. Inkubasi campuran tersebut dalam waterbath pada suhu 48-50 oC. Pengamatan dilakukan pada setiap interval waktu 15 menit dan diamati juga hasilnya selama 1 jam. Reaksi positif apabila terjadi penggumpalan dalam uji campuran dan tidak ada penggumpalan dalam kontrol.
Reaksi negatif apabila tidak ada penggumpalan dalam uji campuran dan tidak ada penggumpalan dalam kontrol.
Perlakuan terhadap kultur yang memberikan hasil uji serologi flagellar (H) negatif maka menunjukkan bahwa kultur tersebut adalah Salmonella. Penggumpalan flagellar (H) negatif mungkin disebabkan karena organisme non motil atau karena antigen flagellar tidak berkembang. Pembuatan kultur dilakukan dengan diinokulasi Motility Test Medium dalam petridish menggunakan koloni yang tumbuh pada TSI miring. Media diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC. Bila organisme berpindah sejauh 40 mm atau lebih maka dilakukan uji ulang dengan cara diinokulasi sejumlah pertumbuhan terjauh ke dalam Trypticase
Soy-Trytose Broth.
Pengulangan pengujian Polyvalent Flagellar (H) dilakukan apabila tidak terjadi pergerakan setelah 24 jam pertama, diinkubasikan kembali selama 24 jam pada suhu 35 oC, dan apabila masih tidak bergerak diinkubasi sampai 5 hari pada suhu 25 oC. Kultur yang tidak bergerak (non motile) pada semua uji diatas menunjukkan hasil uji yang negatif. Selanjutnya, bila kultur memberikan reaksi flagellar (H) negatif tetapi memberikan reaksi biokomia positif, maka kultur perlu untuk diuji serologi.
Uji serologi Polyvalent Somatic (O) dilakukan dengan mengambil 1 ose kultur dari TSI yang telah diinkubasi selama 24-48 jam dan diletakkan diatas gelas preparat. Gelas preparat yang telah diberi kultur ditetesi dengan larutan saline 0,85% steril dan diemulsikan. Koloni Antiserum dicampurkan sedikit demi sedikit dengan suspensi koloni sampai tercampur sempurna. Pembuatan kontrol dengan menggunakan larutan saline dan Antiserum. Hasil uji positif apabila terjadi penggumpalan pada larutan kultur dan tidak terjadi penggumpalan pada larutan kontrol, dan hasil uji negatif apabila tidak terjadi penggumpalan buih pada larutan kultur maupun larutan kontrol.
C
PROSES PENGUJIAN
SALMONELLA (2)
Positif Koloni Samonella ? YAmbil Koloni & Teteskan Serum Positif Koloni Samonella ? Y T T E D Positif Koloni Samonella ? Y
Ambil Koloni & Teteskan Serum Positif Koloni Samonella ? Y T T F Laporan Salmonella END