BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Mutasi Iradiasi dan induksi kalus embriogenik
Mutasi iradiasi sinar gamma yang dilakukan pada embrio muda dengan taraf dosis 0, 250, 500, 750 dan 1000 rad memperlihatkan pengaruh yang berbeda terhadap persentase embrio yang hidup sejak umur 7 hari, 30 hari dan 60 hari setelah iradiasi (Gambar 4). Hasil pengamatan menunjukkan bahwa mutasi iradiasi sinar gamma yang dilakukan pada embrio muda dengan taraf dosis berbeda ini dapat menurunkan persentase embrio yang hidup. Dosis iradiasi yang paling tinggi yaitu 1000 rad pada umur 30 hari setelah iradiasi menyebabkan kematian sebagian besar eksplannya, sehingga persentase embrio yang hidup paling rendah dibandingkan dengan dosis iradiasi yang lebih rendah. Namun penurunan persentase embrio yang hidup sejak 30 hari setelah iradiasi tidak menunjukkan penurunan yang signifikan. Hal ini mengindikasikan bahwa pengaruh iradiasi sinar gamma terhadap persentase eksplan yang hidup tidak menunjukkan perbedaan yang berarti pada umur eksplan sejak 30 hari setelah iradiasi.
0 20 40 60 80 100 7 30 60 Hari sth iradiasi (hst) Em brio h idup (%) 0 rad250 rad 500 rad 750 rad 1000 rad
Gambar 4 Persentase embrio yang hidup pada berbagai tingkatan dosis iradiasi sinar gamma umur 7, 30 dan 60 hari setelah iradiasi.
Pada Tabel 1 menunjukkan bahwa perlakuan dosis iradiasi dan jenis media memberikan pengaruh yang berbeda terhadap pertambahan diameter kalus. Diameter kalus pada dosis iradiasi 250 rad yang dikulturkan di media MS + VB5 + 2,4-D 0,5
mg/l + BAP 0,1 mg/l menunjukkan nilai diameter kalus yang paling besar (0.95 cm) walaupun hasilnya tidak berbeda nyata dengan media MS + VB5 + 2,4-D 0,5 mg/l + BAP 0,05 mg/l (0.94 cm). Diameter kalus terkecil 0.35 cm diperoleh dari dosis iradiasi 1000 rad meskipun dikulturkan pada media MS + VB5 + 2,4-D 0,5mg/l + BAP 0,1 mg/l.
Tabel 1 Pengaruh dosis iradiasi sinar gamma dan jenis media terhadap diameter kalus, jumlah bakal tunas dan warna kalus
Perlakuan Dosis iradiasi (Rad) Jenis Media Diameter kalus (cm) JBT/ Kalus Warna kalus
0 MS VB5 2.4D 0,5 BAP 0,15 0.46 abcd 0/4 Putih MS VB5 2,4D 0,5 BAP 0,1 0.39 ab 1/1 Putih
MS VB5 2,4D 0,5 BAP 0,05 0.40 abc 2/1 Putih kecoklatan MS VB5 NAA 5 K0,5 0.38 ab 4/2 Putih, remah 250 MS VB5 2.4D 0,5 BAP 0,15 0.80 fg 4/1 Putih remah
MS VB5 2,4D 0,5 BAP 0,1 0.95 g 21/3 Putih, remah MS VB5 2,4D 0,5 BAP 0,05 0.94 g 1/1 Putih
MS VB5 NAA 5 K0,5 0.63 cdef 1/1 Putih kehijauan 500 MS VB5 2.4D 0,5 BAP 0,15 0.60 bcdef 5/2 Putih kehijauan
MS VB5 2,4D 0,5 BAP 0,1 0.50 abcd 0/4 Putih MS VB5 2,4D 0,5 BAP 0,05 0.80 fg 0/4 Putih
MS VB5 NAA 5 K0,5 0.83 fg 5/1 Putih kehijauan remah 750 MS VB5 2.4D 0,5 BAP 0,15 0.60 bcdef 0/4 Putih
MS VB5 2,4D 0,5 BAP 0,1 0.75 efg 3/1 Bening, remah MS VB5 2,4D 0,5 BAP 0,05 0.55 abcde 4/2 Putih, remah MS VB5 NAA5 K0,5 0.80 fg 3/1 Putih, kehijauan 1000 MS VB5 2.4D 0,5 BAP 0,15 0.65 def 5/2 Putih, remah
MS VB5 2,4D 0,5 BAP 0,1 0.35 a 0/4 Putih Kecoklatan MS VB5 2,4D 0,5 BAP 0,05 0.60 bcdef 0/4 Putih
MS VB5 NAA 5 K0,5 0.55 abcde 0/4 Putih
Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata pada uji Duncan taraf 5%.
2,4 Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D) ; Benzil Adenin Purin (BAP) ; Napthalene Acetic Acid (NAA) danKinetin(K) dalam satuan mg/l. JBT = jumlah bakal tunas. Hasil percobaan ini mengindikasikan bahwa perlakuan iradiasi dengan dosis yang lebih rendah dan dikulturkan pada media dengan rasio auksin dan sitokinin yang seimbang dapat meningkatkan daya aktifitas dalam memacu pembelahan sel. Pembelahan sel secara terus menerus tanpa diikuti pembesaran dan pemanjangan sel akan menyebabkan terbentuknya kalus (Krikorian, 2004). Namun jika dosis iradiasi
sinar gamma ditingkatkan walaupun dikulturkan pada media yang mengandung rasio auksin dan sitokinin yang cukup seimbang, formulasi ini tidak dapat menginduksi dan meningkatkan pertumbuhan sel-sel pada kalus. Peningkatan dosis iradiasi pada embrio muda ternyata dapat menurunkan kemampuan pertumbuhan sel-selnya dalam membentuk kalus. Charbaji dan Nabulsi (1999), mengungkapkan bahwa iradiasi sinar gamma dapat menghambat pembelahan dan pertambahan jumlah sel. Kalus yang mengalami kerusakan sel dapat mematikan selnya serta menurunkan kemampuan regenerasinya (Biswas,et al. 2002).
Pada Tabel 1 juga tampak jumlah induksi bakal tunas pada kalus embrio mutan memberikan hasil yang lebih banyak dibandingkan dengan kalus embrio yang tidak diiradiasi. Jumlah bakal tunas terbanyak adalah 21 bakal tunas dari kalus embrio mutan 250 rad pada media MS + VB5 +2,4-D 0,5 mg/l + BAP 0,1 mg/l. Hasil ini mendukung hasil penelitian Triatminingsih dan Karsinah (2004) pada jeruk JC, dimana induksi tunas terbanyak juga terbentuk pada media MS yang dikombinasikan dengan 2,4-D dan BAP 0,1 mg/l. Menurut Ling and Iwamasa (1997), bahwa peningkatan BAP pada batas tertentu dapat memacu kecepatan proliferasi kalus.
Secara keseluruhan jumlah induksi bakal tunas adalah dari kalus embrio yang tidak diiradiasi (7 bakal tunas), embrio mutan 250 rad (27 bakal tunas), embrio mutan 500 rad dan 750 rad (masing-masing10 bakal tunas) dan 1000 rad (5 bakal tunas). Hasil ini mengindikasikan bahwa sampai dosis iradiasi sinar gamma 750 rad kemampuan regenerasi eksplan masih baik, tetapi pada dosis 1000 rad terjadi kerusakan dan penurunan kemampuan regenerasinya. Hasil ini sejalan dengan penelitian Kosmiatin (2007), dimana dengan perlakuan dosis iradiasi yang sama pada kalus jeruk, menunjukkan peningkatan kemampuan regenerasi sampai dosis 750 rad dan terjadi penurunan kemampuan regenerasi pada dosis yang lebih tinggi yaitu 1000 rad.
Pembentukan dan pertumbuhan kalus yang lebih baik dihasilkan dari media MS yang dikombinasikan dengan 2.4-D sebanyak 0,5 mg/l dan BAP 0,05 – 0,15 mg/l, dimana semua embrio yang dikulturkan pada kombinasi media tersebut dapat membentuk kalus 100% (Gambar 5). Hasil ini mendukung hasil penelitian Triatminingsih et al (2003), dimana kalus proembrio jeruk dapat terbentuk pada media MS yang diperkaya dengan 2.4-D sebanyak 0.05 mg/l dan BAP 0.05 -0.1 mg/l.
Gambar 5 Pembentukan dan pertumbuhan kalus embriogenik pada beberapa jenis media
Secara umum, induksi kalus embriogenik dari embrio yang diiradiasi (embrio mutan) dan yang tidak diiradiasi setelah dikulturkan pada berbagai formulasi media perlakuan menunjukkan pembentukan kalus yang hampir sama (Gambar 6). Hasil pengamatan secara visual terlihat bahwa kalus yang terbentuk dari embrio mutan maupun embrio yang tidak diiradiasi umumnya berwarna putih hingga putih kekuningan, remah, jika terinduksi bakal tunasnya nampak kalus berwarna putih kehijauan (membentuk spot-spot warna hijau).
A. MS+VB5+2.4-D 0,5+BAP 0,15
C. MS+VB5+2.4-D 0,5+BAP 0,05
B. MS+VB5+2.4-D 0,5+BAP 0,1
Gambar 6 Pembentukan kalus : (A) embrio mutan ; (B) embrio yang tidak diiradiasi (C) Embrio yang terinduksi bakal tunas dan (D) Embrio yang tidak membentuk kalus
2. Seleksi In vitro pada media Al dan pH rendah
Hasil seleksiIn vitro pada media yang mengandung AlCl3.6H20 dengan pH 4 (asam) terlihat bahwa kalus yang berasal dari embrio mutan 250, 500 dan 750 rad yang diseleksi pada media seleksi AlCl3.6H20 250 ppm menunjukkan persentase kalus yang hidup paling tinggi (100%) dibanding dengan kalus yang berasal dari embrio yang tidak diiradiasi. Sedangkan untuk embrio mutan 1000 rad menunjukkan tingkat kehidupan kalus yang paling rendah walaupun dikulturkan pada media perlakuan dengan dosis AlCl3.6H20 yang paling rendah (Gambar 7). Hasil ini diduga
A
C
B
bahwa dosis iradiasi yang tinggi dapat menyebabkan kerusakan sel-sel dan mengakibatkan kematian sel-sel jaringan sehingga sel-sel tidak dapat bertahan pada perlakuan Al.
Media seleksi Al juga memberikan pengaruh yang berbeda terhadap persentase kalus yang hidup baik pada embrio mutan maupun embrio yang tidak diiradiasi. Makin tinggi konsentrasi Al, cenderung menurunkan persentase kalus yang hidup. Menurut Sutjahjo (2006), bahwa kalus-kalus yang tidak tenggang pada konsentrasi Al yang tinggi akan mengalami kematian sejak dini.
0 20 40 60 80 100 0 250 500 750 1000 Konsentrasi AlCl3.6H2O (ppm) Kalu s h idu p (%) 0 rad 250 rad 500 rad 750 rad 1000 rad
Gambar 7 Persentase kalus yang hidup pada beberapa media seleksi Al, 4 MSP
Pada Tabel 2, menunjukkan perlakuan dosis iradiasi dan jenis media seleksi Al berpengaruh nyata terhadap pertambahan diameter kalus. Diameter kalus terbesar (1.30 cm) diperoleh dari embrio mutan 750 rad pada media seleksi AlCl3.6H20 750 ppm. Sedangkan diameter kalus terkecil (0.45 cm) diperoleh dari embrio mutan 500 rad pada media tanpa AlCl3.6H20 (kontrol) yang hasilnya tidak berbeda nyata dengan embrio yang tidak diiradiasi pada media seleksi AlCl3.6H20 taraf 250, 500 dan 1000 ppm. Hal ini diduga bahwa embrio mutan 750 rad memiliki ketahanan yang lebih baik terhadap cekaman Al. Menurut Soedjono (2003), pengaruh induksi mutasi dapat menghasilkan tanaman mutan yang memiliki daya tahan yang lebih baik terhadap cekaman biotik maupun abiotik.
Tabel 2 Pengaruh dosis iradiasi sinar gamma dan media seleksi Al terhadap diameter kalus, jumlah tunas dan visual biakan kalus
Perlakuan Dosis iradiasi (Rad) Media Seleksi Al Diameter kalus (cm) Jumlah tunas Visual biakan kalus 0 A 0.90 bcdefg 0 kalus putih
B 0.48 ab 0 kalus kecoklatan C 0.50 ab 1 kalus putih kekuningan D 0.55 abc 1 kalus kekuningan
E 0.48 ab 0 kalus kompak warna putih 250 A 0.95 cdefg 0 kalus putih remah
B 0.75 abcdef 0 kalus kuning, berkeping hijau C 0.55 abc 0 kalus kecoklatan
D 0.89 bcdefg 1 kalus kuning kecoklatan E 0.88 bcdef 0 kalus putih kekuningan 500 A 0.45 a 0 kalus putih kekuningan B 0.85 abcdef 1 kalus putih kekuningan C 0.95 cdefg 0 kalus kekuningan D 0.73 abcdef 0 kalus kecoklatan E 1.05 efg 0 kalus kecoklatan 750 A 1.10 fg 0 kalus putih remah
B 0.88 bcdef 1 kalus putih kekuningan C 1.03 defg 1 kalus putih kekuningan D 1.30 g 1 kalus bulat besar , kompak E 1.00 defg 1 kalus kuning kecoklatan 1000 A 0.78 abcdef 0 kalus putih kecoklatan
B 0.60 abcd 0 kalus putih kecoklatan C 0.63 abcde 1 kalus kuning kecoklatan D 0.90 bcdefg 1 kalus kuning kecoklatan E 0.95 cdefg 0 kalus kehijauan, kompak
Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata pada uji Duncan taraf 5%.
Media A = MS md tanpa AlCl3.6H20 ; B = MS md + AlCl3.6H20 250 ppm ; C = MS md + AlCl3.6H20 500 ppm ; D = MS md + AlCl3.6H20 750 ppm ; E = MS md + AlCl3.6H20 1000 ppm . MS md = MS yang dimodifikasi
Pembentukan tunas pada media seleksi Al juga menunjukkan respon yang berbeda. Jumlah tunas paling banyak (4 tunas) dihasilkan dari embrio mutan 750 rad. Sedangkan embrio yang tidak diiradiasi dan embrio mutan 1000 rad masing-masing terbentuk 2 tunas, untuk embrio mutan 250 rad hasilnya sama dengan embrio mutan 500 rad yaitu masing-masing terbentuk 1 tunas. Hal ini mengindikasikan bahwa kemampuan beregenerasi kalus untuk membentuk tunas pada media seleksi Al juga dipengaruhi oleh dosis iradiasi.
Secara visual perubahan warna kalus pada saat diseleksi dengan Al dan pH rendah juga berbeda-beda, umumnya berwarna putih kekuningan hingga kecoklatan (Gambar 8).
Gambar 8 Respon pertumbuhan kalus pada beberapa media seleksi Al
C. AlCl3.6H2O 500 ppm
D. AlCl3.6H2O 750 ppm E. AlCl3.6H2O 1000 ppm
Secara umum kalus melakukan mekanisme pertahanan terhadap cekaman, salah satunya dengan pembentukan senyawa fenol yang biasanya diikuti dengan perubahan warna kalus menjadi coklat (George dan Sherrington, 1984). Menurut Mariskaet al, (2004), Respon yang berbeda pada kalus yang diseleksi Al bergantung pada ketahanan masing-masing sel terhadap komponen seleksi serta taraf konsentrasi Al. Sel-sel yang tidak mempunyai sifat ketahanan berwarna hitam serta tidak mampu tumbuh, sedangkan sel-sel yang tahan tetap tumbuh dan berwarna hijau.
Hasil penelitian juga memperlihatkan pertumbuhan kalus yang diseleksi pada media seleksi Al yang lebih tinggi cenderung menghasilkan kalus non embriogenik, akibatnya hanya diperoleh sedikit kalus yang embriogenik. Menurut Paterson dan Smith (1991), karakteristik kalus yang embriogenik adalah kalus yang berwarna putih hingga kekuningan, mengkilat dan remah sehingga mudah dipisahkan membentuk fragmen. Kalus yang masih bersifat embriogenik dalam media seleksi Al memungkinkan dapat diregenerasikan menjadi tanaman lengkap, sehingga regeneran yang dihasilkan dari kalus tersebut diharapkan dapat membawa sifat yang toleran terhadap cekaman Al dan pH masam.
Percobaan 3. Regenerasi kalus terseleksi AlCl3.6H2O
Percobaan regenerasi kalus terseleksi Al (hasil percobaan 2), pada media regenerasi MS + VMW + BAP 3 mg/l + Ekstrak malt 500 mg/l, menunjukkan respon jumlah kalus beregenerasi yang berbeda. Pada Tabel 3 terlihat bahwa kalus yang diregenerasikan tidak semuanya dapat beregenerasi. Hal ini kemungkinan disebabkan karena terjadinya dediferensiasi dimana masa sel terus membelah dan tidak terorganisasi. Kemungkinan lain kalus telah mengalami kerusakan atau penurunan kemampuan regenerasi karena pengaruh perlakuan iradiasi dan seleksi Al (Biswaset al, 2002). Menurut Purnamaningsih dan Mariska (2003) kesulitan yang sering dihadapi dalam seleksiin vitro adalah sulitnya meregenerasikan massa sel yang tahan Al dan pH rendah, padahal regenerasi tanaman sangat penting untuk pembuatan klon yang mampu mempertahankan susunan genetik sehingga diperoleh tanaman yang tahan pada cekaman Al dan pH rendah.
Pada Tabel 3 juga menunjukkan bahwa kalus yang dapat beregenerasi paling banyak diperoleh dari kalus embrio mutan 250 rad dan kalus embrio yang tidak
diiradiasi masing-masing 7 kalus. Dari kalus embrio mutan 750 rad sebanyak 6 kalus, kalus embrio mutan 500 rad sebanyak 5 kalus dan jumlah kalus beregenerasi paling sedikit diperoleh dari kalus embrio mutan 1000 rad sebanyak 3 kalus. Hasil ini mengindikasikan bahwa kalus dari embrio yang diiradiasi dengan dosis yang lebih rendah (sampai 750 rad) masih memiliki kemampuan beregenerasi yang lebih baik sedangkan dosis iradiasi yang tinggi akan mematikan bahan yang dimutasi atau mengakibatkan sterilitas (Soedjono, 2003).
Tabel 3 Jumlah kalus beregenerasi pada media regenerasi MS + VMW + BAP 3 mg/l + Ekstrak malt 500 mg/l
Perlakuan Awal Jumlah Jumlah Kalus
Dosis Iradiasi (Rad)
Media Seleksi Al Kalus Beregenerasi
0 MS md tanpaAlCl3.6H2O 2 0 MS md + AlCl3.6H2O 250 ppm 2 0 MS md + AlCl3.6H2O 500 ppm 6 5 MS md + AlCl3.6H2O 750 ppm 3 2 MS md + AlCl3.6H2O 1000 ppm 2 0 250 MS md tanpaAlCl3.6H2O 2 1 MS md + AlCl3.6H2O 250 ppm 3 2 MS md + AlCl3.6H2O 500 ppm 3 0 MS md + AlCl3.6H2O 750 ppm 3 2 MS md + AlCl3.6H2O 1000 ppm 2 2 500 MS md tanpaAlCl3.6H2O 3 0 MS md + AlCl3.6H2O 250 ppm 3 1 MS md + AlCl3.6H2O 500 ppm 2 2 MS md + AlCl3.6H2O 750 ppm 2 0 MS md + AlCl3.6H2O 1000 ppm 2 2 750 MS md tanpaAlCl3.6H2O 2 2 MS md + AlCl3.6H2O 250 ppm 3 2 MS md + AlCl3.6H2O 500 ppm 2 0 MS md + AlCl3.6H2O 750 ppm 4 1 MS md + AlCl3.6H2O 1000 ppm 2 1 1000 MS md tanpaAlCl3.6H2O 3 0 MS md + AlCl3.6H2O 250 ppm 3 0 MS md + AlCl3.6H2O 500 ppm 2 1 MS md + AlCl3.6H2O 750 ppm 2 2 MS md + AlCl3.6H2O 1000 ppm 2 0
Kalus-kalus yang dapat beregenerasi disubkultur kembali pada media yang sama untuk menghasilkan tunas. Hasilnya menunjukkan bahwa kalus-kalus yang beregenerasi semuanya dapat menghasilkan tunas. Menurut Husni (2007), formulasi media yang digunakan pada percobaan ini merupakan media yang terbaik untuk regenerasi jeruk siam.
Tabel 4 Jumlah tunas dan Rerata tinggi tunas pada media regenerasi MS + VMW + BAP 3 mg/l + Ekstrak malt 500 mg/l setelah 4 kali subkultur
Perlakuan Awal JT/ JKB Rerata Visual pertumbuhan Iradiasi
(Rad)
Media Seleksi Al TT (cm)
tunas
0 MS md + AlCl3.6H2O 500 ppm 5/5 0.40 Hijau, tidak berkelompok
MS md + AlCl3.6H2O 750 ppm 2/2 0.35 Hijau, tidak berkelompok
250 MS md tanpa AlCl3.6H2O 6/1 0.35 Hijau, berkelompok
MS md + AlCl3.6H2O 250 ppm 6/2 0.45 Hijau, berkelompok
MS md + AlCl3.6H2O 750 ppm 3/2 0.47 Hijau, tidak berkelompok
MS md +AlCl3.6H2O 1000ppm 10/2 0.45 Hijau, berkelompok
500 MS md + AlCl3.6H2O 250 ppm 1/1 0.40 Hijau, tidak berkelompok
MS md + AlCl3.6H2O 500 ppm 10/2 1.00 Hijau, berkelompok
MS md +AlCl3.6H2O 1000ppm 4/2 0.35 Hijau, tidak berkelompok
750 MS md tanpa AlCl3.6H2O 2/2 1.00 Hijau, tidak berkelompok
MS md + AlCl3.6H2O 250 ppm 6/2 1.00 Hijau, tidak berkelompok
MS md + AlCl3.6H2O 750 ppm 1/1 0.37 Hijau, tidak berkelompok
MS md +AlCl3.6H2O 1000ppm 2/1 0.47 Hijau, tidak berkelompok
1000 MS md + AlCl3.6H2O 500 ppm 20/1 0.45 Hijau, berkelompok
MS md + AlCl3.6H2O 750 ppm 2/2 1.00 Hijau, tidak berkelompok
Keterangan : MS md = MS modifikasi ; JT = jumlah tunas ; JKB = jumlah kalus beregenerasi ; TT = tinggi tunas
Pada Tabel 4 menunjukkan jumlah tunas terbanyak 20 tunas per kalus dihasilkan dari embrio mutan 1000 rad yang terseleksi pada media seleksi AlCl3.6H2O 500 ppm, namun tunas yang dihasilkan kecil-kecil dan berkelompok. Hal ini diduga bahwa media regenerasi MS yang mengandung rasio sitokinin yang cukup dapat
memacu pertumbuhan kalus-kalus mutan dan kalus yang tidak diiradiasi untuk membentuk tunas. Pemberian sitokinin dengan konsentrasi yang cukup tinggi akan menyebabkan terjadinya pemanjangan dan pembesaran sel yang lebih mengarah pada terbentuknya tunas (Gaba, 2002). Hasil penelitian Triatminingsih dan Karsinah (2004), ekstrak malt yang ditambahkan pada media regenerasi dapat meningkatkan jumlah tunas jeruk JC yang terbentuk.
Sementara rerata tinggi tunas dari kalus yang diregenerasikan pada media MS + VMW + BAP 3 mg/l + Ekstrak malt 500 mg/l paling tinggi 1.00 cm masing-masing dihasilkan dari embrio mutan 500 rad pada perlakuan AlCl3.6H2O500 ppm, embrio mutan 750 rad pada perlakuan AlCl3.6H2O0 ppm dan 250 ppm serta embrio mutan 1000 rad pada perlakuanAlCl3.6H2O750 ppm.
Tabel 5 Jumlah daun dan jumlah akar yang terbentuk pada media regenerasi MS + VMW + BAP 3 mg/l + Ekstrak malt 500 mg/l setelah 4 kali subkultur
Perlakuan Awal JD/ JT Jumlah Visual pertumbuhan Iradiasi
(Rad)
Media Seleksi Al akar Varian jeruk 0 MS md + AlCl3.6H2O 500 ppm 12/5 2 Abnormal
MS md + AlCl3.6H2O 750 ppm 2/2 0 Abnormal
250 MS md tanpa AlCl3.6H2O 4/6 0 Abnormal
MS md + AlCl3.6H2O 250 ppm 4/6 0 Abnormal MS md + AlCl3.6H2O 750 ppm 3/3 0 Normal MS md +AlCl3.6H2O 1000ppm 5/10 0 Abnormal 500 MS md + AlCl3.6H2O 250 ppm 2/1 0 Abnormal MS md + AlCl3.6H2O 500 ppm 10/10 2 50% normal MS md +AlCl3.6H2O 1000ppm 2/4 0 Abnormal
750 MS md tanpa AlCl3.6H2O 2/2 2 Normal
MS md + AlCl3.6H2O 250 ppm 6/6 2 Normal
MS md + AlCl3.6H2O 750 ppm 2/1 0 Abnormal
MS md +AlCl3.6H2O 1000ppm 2/2 1 Abnormal
1000 MS md + AlCl3.6H2O 500 ppm 10/20 0 50% normal
MS md + AlCl3.6H2O 750 ppm 0/2 0 Abnormal
Pada Tabel 5, jumlah daun yang terbentuk dari masing-masing tunas menunjukkan respon yang berbeda, rata-rata 1-2 daun yang terbentuk per tunas. Selain membentuk daun dan tunas, beberapa varian jeruk sudah terinduksi akarnya. Jumlah akar yang terbentuk umumnya dihasilkan dari varian terseleksi Al dengan konsentrasi AlCl3.6H2O yang lebih rendah ( 500 ppm) dengan rata-rata panjang akar yang terbentuk berkisar 0,5 – 1,0 cm. Hal ini mengindikasikan bahwa varian jeruk tersebut toleran terhadap cekaman Al yang diberikan. Menurut Samuelet al., (1997) salah satu kriteria tanaman yang toleran terhadap cekaman Al yaitu akar mampu untuk tumbuh terus dan ujung akarnya tidak mengalami kerusakan.
Pada Tabel 5 juga menunjukkan beberapa varian jeruk yang lain tidak terinduksi akarnya dan cenderung menunjukkan pertumbuhan yang abnormal. Hal ini mengindikasikan terjadinya penurunan kemampuan regenerasi dan menunjukkan respon morfologi akibat cekaman Al. Menurut Sutjahjo (2006), pada tanaman yang diberi cekaman Al, gejala yang umum dapat dilihat yaitu terjadinya penghambatan pertumbuhan akar akibat pengaruh keracunan Al. Hasil penelitian Sivaguru et al (2003), menunjukkan bahwa perlakuan Al pada tanaman arabidopsi (ecotype Landsberg-O) dapat menghambat 50% pertumbuhan akarnya, ujung akar dan akar cabang menebal sehingga serapan dan translokasi unsur-unsur hara terganggu. Hasil penelitian Yamamoto et al., (1992) mendapatkan bahwa toksisitas Al selain mengakibatkan tanaman kekurangan nutrien juga mengubah struktur dan fungsi dari membran plasma dan menghalangi pembelahan sel pada ujung-ujung akar. Pada akhirnya tanaman akan mengurangi sistem perakarannya dan menunjukkan berbagai gejala kekurangan nutrien akibat keracunan Al (MacDiarmid dan Gardner, 1996).
Secara visual, pertumbuhan tunas yang paling baik dihasilkan dari embrio mutan 750 rad yang terseleksi AlCl3.6H2O pada konsentrasi 0 dan 250 ppm, tunas yang dihasilkan hijau, normal dan sudah terinduksi akarnya. Sedangkan dari embrio mutan yang sama dengan konsentrasi Al yang lebih tinggi menghasilkan tunas yang abnormal (Gambar 9). Hasil ini mengindikasikan bahwa embrio mutan 750 rad yang diseleksi pada media seleksi Al yang lebih rendah (AlCl3.6H2O 250 ppm) kemampuan beregenerasinya lebih baik. Hasil ini mendukung hasil penelitian Van Sin Janet al (1997), yang menunjukkan penurunan kemampuan beregenerasi padi melalui jalur embriogenesis somatik sejalan dengan meningkatnya konsentrasi Al.
Gambar 9 Pertumbuhan tunas embrio mutan 750 rad yang terseleksi Al pada konsentrasi (A) AlCl3.6H2O 0 ppm ; (B) AlCl3.6H2O 250 ppm ; dan (C) AlCl3.6H2O 1000 ppm.
Embrio mutan 750 rad yang terseleksi pada media seleksi Al yang lebih rendah (AlCl3.6H2O 250 ppm) juga memperlihatkan pertumbuhan yang lebih baik dibanding dengan embrio yang tidak diiradiasi dan embrio mutan lainnya (Gambar 10). Hasil penelitian Yuliasti (2007), pada tanaman kedelai menunjukkan bahwa penambahan konsentrasi Al dapat menghambat pertumbuhan tanamannya.
A B
Gambar 10 Pertumbuhan tunas embrio yang tidak diiradiasi dan embrio mutan yang terseleksiAlCl3.6H2O500 ppm
Analisis jumlah kromosom pada beberapa varian yang terseleksi Al menunjukkan jumlah kromosom yang sama dengan kromosom individu normalnya yaitu 18 (Gambar 11). Hal ini menunjukkan bahwa tidak terjadi mutasi jumlah kromosom akibat mutasi iradiasi sinar gamma dan seleksiIn vitro pada media seleksi Al, tetapi kemungkinan terjadi mutasi titik sehingga perubahan yang terjadi pada varian jeruk JC dapat meningkatkan ketahanan terhadap Al dan pH rendah. Menurut Taiz dan Zeiger (2002), Peningkatan ini kemungkinan disebabkan perubahan ekspresi gen pada kultur. Perubahan susunan ekspresi gen akan mengakibatkan perubahan fenotip tanaman (Kadir, 2007).
A. Tunas embrio yang tidak diiradiasi B. Tunas embrio mutan 500 rad
Gambar 11 Hasil analisis kromosom varian dari embrio yang tidak diiradiasi dan embrio mutan yang terseleksi Al
Menurut Duncan (1997), iradiasi sinar gamma dapat menyebabkan ketidakseimbangan fungsi fisiologis tanaman. Iradiasi sinar gamma dapat merusak DNA sehingga menyebabkan terjadinya perubahan ekspresi gen. Semakin tinggi dosis iradiasi sinar gamma, semakin meningkatkan efek kerusakan pada DNA, bahkan
A. 0 rad AlCl3.6H2O 500 ppm
C. 750 rad AlCl3.6H2O 0 ppm
B. 500 rad AlCl3.6H2O 500 ppm
D. 750 rad AlCl3.6H2O 250 ppm
dosis tertentu dapat mengakibatkan perubahan struktur kromosom atau aberasi kromosom (Harten, 1998). Sedangkan Hao and Deng (2002), melakukan analisis sitologi dan molekuler menemukan penyimpangan genetik (mitotic irregulated) pada tanaman jeruk, seperti pemanjangan dan pemendekan kromosom serta ketidakseimbangan kromosom sehingga tanaman yang diregenerasikan dari kalus yang dikultur dalam waktu lama (“long term culture”) akan mengalami abnormalitas.
Selain memberikan pengaruh yang kurang baik, iradiasi sinar gamma juga memberikan pengaruh yang baik dengan adanya perubahan susunan genetik tanaman. Menurut Charbaji dan Nabulsi (1999), iradiasi sinar gamma pada taraf dosis yang rendah dapat menginduksi perubahan secara fisiologis dan biokimia sehingga dapat menghasilkan pertumbuhan vegetatif yang lebih cepat. Sedangkan hasil penelitian Mariska et al (2004), perlakuan iradiasi gamma dengan dosis rendah (400 rad) yang dikombinasikan dengan seleksiIn vitro dapat meningkatkan toleransi tanaman kedelai terhadap cekaman Al. Berdasarkan karakteristik sifat-sifat di atas yang dihasilkan