BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
E. Optimasi Komposisi Fase Gerak
Pada sistem KCKT fase terbalik, fase diam yang bersifat non polar akan menahan senyawa yang lebih non polar sehingga senyawa yang bersifat lebih polar akan terelusi terlebih dahulu daripada senyawa yang bersifat non polar. Asam askorbat merupakan suatu senyawa yang bersifat polar sehingga secara teori asam askorbat akan terelusi dengan cepat yang dapat ditunjukkan dengan
waktu retensi yang pendek. Tabel III menunjukkan waktu retensi, nilai tailing
factor dan nilai resolusi yang diperoleh dari pengukuran asam askorbat 100
µg/mL pada komposisi fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 dengan
perbandingan 10 : 90; 20 : 80; 30 : 70; 40 : 60 dan 50 : 50 pada kecepatan alir 1,0 mL/menit.
Tabel III. Waktu retensi, nilai tailing factor dan nilai resolusi baku asam askorbat 100 µg/mL pada beberapa komposisi fase gerak pada kecepatan alir 1,0 mL/menit
No. Komposisi fase gerak Waktu retensi pada kecepatan alir 1,0 mL/menit Nilai tailing factor pada kecepatan alir 1,0 mL/menit Nilai resolusi pada kecepatan alir 1,0 mL/menit Metanol (%) Bufer fosfat 0,01 M pH 3 (%) 1. 10 90 3,37 0 0,60 2. 20 80 2,86 2,99 0 3. 30 70 2,78 1,98 0 4. 40 60 2,73 1,41 0 5. 50 50 2,70 1,27 0
Data pada tabel III menunjukkan bahwa semakin besar jumlah metanol dalam fase gerak maka semakin pendek waktu retensi asam askorbat yang dihasilkan. Hal ini disebabkan karena kemampuan elusi fase gerak akan meningkat dengan menambahkan jumlah pelarut organik dalam fase gerak (Snyder dkk., 2010).
Asam askorbat dapat berinteraksi dengan fase diam dan fase gerak. Interaksi asam askorbat dengan fase diam adalah interaksi gaya London. Menurut Levita dan Mustarichie (2012), gaya London merupakan gaya tarikan lemah yang disebabkan oleh dipol induksi sesaat pada suatu atom yang terjadi karena adanya pergerakan elektron dalam suatu orbital. Pergerakan ini dapat mengakibatkan tidak meratanya kepadatan elektron atom sehingga atom memiliki satu sisi dipol dengan muatan lebih negatif dibandingkan sisi lainnya. Dipol sesaat pada suatu atom dapat menginduksi atom yang berada disekitarnya sehingga terjadi dipol terinduksi. Hal ini menyebabkan terjadinya gaya tarik menarik antara dipol sesaat suatu atom dengan dipol terinduksi atom lainnya. Gambar 12 di bawah ini
menunjukkan interaksi gaya London antara asam askorbat dengan fase diam oktadesilsilan:
Gambar 12. Interaksi asam askorbat dengan fase diam oktadesilsilan
Interaksi yang terjadi pada asam askorbat dengan fase gerak adalah interaksi hidrogen. Menurut Levita dan Mustarichie (2012), interaksi hidrogen merupakan interaksi dipol-dipol yang terbentuk antara suatu proton yang terikat pada gugus yang memiliki atom elektronegatif dengan suatu atom elektronegatif lin yang memiliki pasangan elektron bebas. Gambar 13 di bawah ini menunjukkan interaksi hidrogen antara asam askorbat dengan fase gerak:
Gambar 13. Interaksi asam askorbat dengan fase gerak metanol : bufer fosfat
Berdasarkan penjelasan interaksi yang terjadi antara asam askorbat dengan fase diam dan fase gerak, dapat dikatakan bahwa interaksi asam askorbat
dengan fase diam merupakan interaksi yang bersifat lemah sehingga asam askorbat cenderung berinteraksi lebih kuat dengan fase gerak.
Pada optimasi komposisi fase gerak didapatkan bahwa semakin besar jumlah metanol dalam fase gerak maka semakin pendek waktu retensi asam askorbat yang dihasilkan. Pada pengamatan waktu retensi, didapatkan hasil asam askorbat terelusi kurang dari 10 menit pada seluruh variasi perbandingan komposisi fase gerak (tabel III). Pada analisis dengan KCKT secara umum, waktu retensi yang diharapkan adalah kurang dari 10 menit (Snyder dkk., 2010).
Parameter optimasi lainnya adalah nilai tailing factor. Parameter ini
menunjukkan bentuk puncak kromatogram yang simetris atau asimetris
(mengalami tailing). Bentuk puncak dikatakan simetris apabila memiliki nilai
tailing factor mendekati 1, sedangkan bentuk puncak dikatakan asimetris atau
mengalami tailing apabila nilai tailing factor lebih besar dari 1. Semakin besar
nilai tailing factor maka semakin menurun efisiensi kolom. Menurut Snyder dkk.
(2010), nilai tailing factor yang masih dapat diterima adalah kurang dari 2. Jika
nilai tailing factor lebih dari 2, maka puncak kromatogram dikatakan mengalami
tailing, penurunan resolusi, batas deteksi dan presisi (Rohman dan Gandjar,
2007). Beberapa penyebab nilai tailing factor yang besar adalah jumlah analit
yang masuk dalam kolom terlalu besar, fase gerak yang tidak sesuai dan interaksi analit dengan residu silanol pada fase diam. Dalam penelitian ini, jumlah asam
askorbat yang masuk ke kolom adalah 2 µg dalam 20 µL volume injeksi.
Parameter optimasi komposisi fase gerak adalah nilai resolusi. Pengamatan nilai resolusi dilakukan untuk menjamin puncak asam askorbat tidak
tumpang tindih dengan noise pengotor lain yang mungkin ada dalam kolom dan terdeteksi pada panjang gelombang yang sama dengan panjang gelombang asam askorbat. Pemisahan yang baik dilihat dengan nilai resolusi yang harus lebih besari dari 1,5 (Rohman dan Gandjar, 2007).
1. Fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 10 : 90 dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit
Pada komposisi fase gerak 10 : 90 (Gambar 14), didapatkan puncak baku asam askorbat yang pecah dan tidak terpisah secara sempurna. Nilai resolusi yang diperoleh adalah 0,60 antara puncak dengan waktu retensi 3,09 menit dan puncak
dengan waktu retensi 3,37 menit. Nilai tailing factor sama dengan nol yang
disebabkan karna puncak tidak terpisah secara sempurna. Parameter tersebut tidak memenuhi kriteria penerimaan yang ada sehingga dianggap bukan komposisi fase gerak yang optimal untuk penelitian ini.
Gambar 14. Kromatogram baku asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL, dengan parameter sebagai berikut:
Fase diam : Phenomenex®C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : bufer fosfat 0,01M pH 3 10 : 90 Kecepatan alir : 1,0 mL/menit
Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm
2. Fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 20 : 80 dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit
Pada komposisi fase gerak 20 : 80 (Gambar 15), didapatkan puncak baku
asam askorbat yang melebar dengan nilai tailing factor lebih dari 2, yaitu 2,99.
Nilai resolusi sama dengan nol dikarenakan tidak ada puncak lain yang terdeteksi dan waktu retensi yang diperoleh kurang dari 10 menit, yaitu 2,86 menit. Pada
komposisi ini, parameter tailing factor tidak memenuhi kriteria penerimaan
sehingga dianggap bukan komposisi fase gerak yang optimal untuk penelitian ini.
Gambar 15. Kromatogram baku asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL, dengan parameter sebagai berikut:
Fase diam : Phenomenex®C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : bufer fosfat 0,01M pH 3 20 : 80 Kecepatan alir : 1,0 mL/menit
Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm
3. Fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 30 : 70 dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit
Pada komposisi fase gerak 30 : 70 (Gambar 16), didapatkan puncak baku
mendekati 2, yaitu 1,98. Nilai resolusi sama dengan nol dikarenakan tidak ada puncak lain yang terdeteksi dan waktu retensi yang diperoleh kurang dari 10
menit, yaitu 2,78 menit. Pada komposisi ini, meskipun nilai tailing factor yang
dihasilkan masih di bawah 2, tetapi nilai tersebut tergolong kurang baik sehingga dianggap bukan komposisi fase gerak yang optimal untuk penelitian ini.
Gambar 16. Kromatogram baku asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL, dengan parameter sebagai berikut:
Fase diam : Phenomenex®C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : bufer fosfat 0,01M pH 3 30 : 70 Kecepatan alir : 1,0 mL/menit
Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm
4. Fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 40 : 60 dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit
Pada komposisi fase gerak 40 : 60 (Gambar 17), didapatkan puncak baku
asam askorbat yang runcing dan ramping dengan nilai tailing factor kurang dari 2,
yaitu 1,41. Nilai resolusi sama dengan nol dikarenakan tidak ada puncak lain yang terdeteksi dan waktu retensi yang diperoleh kurang dari 10 menit, yaitu 2,73 menit. Pada komposisi ini, seluruh parameter telah memenuhi kriteria penerimaan.
Gambar 17. Kromatogram baku asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL, dengan parameter sebagai berikut:
Fase diam : Phenomenex®C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : bufer fosfat 0,01M pH 3 40 : 60 Kecepatan alir : 1,0 mL/menit
Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm
5. Fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 50 : 50 dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit
Pada komposisi fase gerak 50 : 50 (Gambar 18), didapatkan puncak baku
asam askorbat yang runcing dan ramping dengan nilai tailing factor kurang dari 2,
yaitu 1,27. Nilai resolusi sama dengan nol dikarenakan tidak ada puncak lain yang terdeteksi dan waktu retensi yang diperoleh kurang dari 10 menit, yaitu 2,70 menit. Pada komposisi ini, seluruh parameter telah memenuhi kriteria penerimaan.
Gambar 18. Kromatogram baku asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL, dengan parameter sebagai berikut:
Fase diam : Phenomenex®C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : bufer fosfat 0,01M pH 3 50 : 50 Kecepatan alir : 1,0 mL/menit
Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm
Berdasarkan uraian di atas, kompisisi fase gerak yang optimal untuk penelitian ini adalah komposisi 40 : 60. Hal ini ditunjukkan dengan bentuk puncak
baku asam askorbat yang runcing dan ramping, nilai tailing factor kurang dari 2,
nilai resolusi sama dengan nol dikarenakan tidak ada puncak lain yang terdeteksi dan waktu retensi kurang dari 10 menit. Pada komposisi ini, seluruh parameter telah memenuhi kriteria penerimaan.