BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
B. Penentuan Fase Gerak
Berdasarkan polaritas fase diam dan fase gerak, metode KCKT yang digunakan merupakan metode KCKT fase terbalik karena fase diam yang
digunakan yaitu oktadesilsilan (C18) yang bersifat non polar sedangkan fase gerak
bersifat lebih polar dibanding fase diam. Fase gerak yang paling sering digunakan dalam penelitian menggunakan sistem KCKT fase terbalik adalah campuran air dengan pelarut organik seperti asetonitril dan metanol. Fase gerak yang dipakai untuk sistem KCKT fase terbalik adalah pelarut organik yang bersifat mudah bercampur dengan air, viskositas relatif rendah, stabil di bawah kondisi yang digunakan. Jenis pelarut organik yang paling sering dan disarankan berturut-turut adalah asetonitril, metanol, dan paling jarang digunakan adalah tetrahidrofuran (Snyder dkk., 2010).
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah campuran metanol dengan bufer fosfat 0,01 M pada pH 3. Sistem elusi fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah isokratik karena menggunakan campuran fase gerak dengan perbandingan tetap sehingga polaritas fase gerak tetap selama proses elusi berlangsung.
Eluent strength (ε°) merupakan salah satu hal yang perlu diperhatikan
ketika memilih suatu pelarut dalam fase gerak. Eluent strength adalah
kemampuan pelarut organik untuk mengelusi suatu analit. Semakin besar nilai eluent strength maka semakin besar kemampuan elusinya. Semakin besar nilai ε° maka semakin besar risiko terjadinya tumpang tindih antara puncak dua analit
maka fase gerak akan lebih sulit untuk mengelusi analit. Metanol memiliki nilai
ε° = 1,0 sedangkan asetonitril memiliki nilai ε° = 3,1 pada kolom C18. Apabila
dilihat dari nilai ε° menunjukkan kemampuan elusi asetonitril untuk mengelusi
analit lebih besar dari pada metanol. Namun, asetonitril tidak digunakan sebagai komposisi fase gerak dikarenakan biaya yang dibutuhkan terlalu mahal. Selain itu, dengan menggunakan pelarut metanol, asam askorbat sudah dapat terelusi dengan baik dalam sistem KCKT yang digunakan. Oleh karena itu, untuk meningkatkan efisiensi biaya dalam penelitian ini dipilih pelarut metanol sebagai komponen fase gerak.
Bufer fosfat merupakan salah satu komponen fase gerak yang digunakan. Bufer fosfat mempunyai nilai pKa 2,1; 7,2 dan 12,3 dengan rentang pH berturut-turut adalah 1,1-3,1; 6,2-8,2; dan 11,3-13,3 (Supelco, 2001). Rentang pH tersebut menunjukkan kapasitas bufer fosfat, yaitu kemampuan untuk mempertahankan pH secara efektif. Suatu larutan asam askorbat 5% dalam air memiliki pH 2,1 - 2,6, pH 10% larutan kalsium askorbat dalam air adalah antara 6,8 dan 7,4 dan pH larutan natrium askorbat dalam air antara 7,0 dan 8,0. Stabilitas maksimum terjadi dekat pH 3 dan pH 6 (Sihite, 2010). Asam askorbat cukup stabil dalam larutan dengan pH rendah seperti 2 atau 3 dengan anggapan bahwa tidak ada ion logam transisi dalam larutan. Peningkatan pH fase gerak menjadi > nilai pKa asam
askorbat yaitu 4,2 akan meningkatkan terbentuknya ion asam askorbat (AscH-)
yang berakibat pada stabilitas asam askorbat dalam larutan menurun (Buettner and Jurkiewics, 1996). Pada penelitian ini digunakan pH 3 dengan pertimbangan stabilitas larutan asam askorbat dalam sistem KCKT yang digunakan. Pada saat
orientasi, dilakukan pengukuran dengan menggunakan fase gerak tanpa mengandung bufer, mengandung bufer fosfat pH 3 dan bufer fosfat pada pH 5,6. Akan tetapi, hasil puncak kromatogram yang diperoleh dari penggunaan fase gerak tanpa bufer dan bufer pH 5,6 terpecah menjadi beberapa bagian dan bentuk puncak yang tidak baik (Gambar 7 dan 8). Berbeda dengan puncak kromatogram yang dihasilkan dengan menggunakan bufer fosfat pH 3 (Gambar 9). Oleh sebab itu, perlu digunakan bufer untuk mempertahankan pH selama berada dalam sistem KCKT tetap pada rentang pH stabil larutan asam askorbat sehingga menghasilkan waktu retensi asam askorbat yang tetap dan meminimalkan terjadinya kerusakan asam askorbat akibat perubahan pH.
Gambar 7. Kromatogram asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL, dengan parameter sebagai berikut:
Fase diam : Phenomenex®C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : air (40 : 60)
Kecepatan alir : 1 mL/menit Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm
Gambar 8. Kromatogram asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL, dengan parameter sebagai berikut:
Fase diam : Phenomenex®C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : bufer fosfat pH 5,6 (40 : 60)
Kecepatan alir : 1 mL/menit Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm
Gambar 9. Kromatogram asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL, dengan parameter sebagai berikut:
Fase diam : Phenomenex®C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60)
Kecepatan alir : 1 mL/menit Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm
Selain kapasitas bufer, UV-cutoff merupakan hal lain yang perlu
diperhatikan dalam pemilihan bufer. UV-cutoff adalah panjang gelombang suatu
kuvet yang memiliki tebal 1 cm (Rohman dan Gandjar, 2007). Bufer fosfat
memiliki nilai UV-cutoff di bawah 200 nm (Supelco, 2001), sedangkan metanol
memiliki UV-cutoff 205 nm (Rohman dan Gandjar, 2007). Apabila pengukuran
analit dilakukan pada panjang gelombang UV-cutoff pelarut yang digunakan maka
akan terjadi kekacauan hasil sehingga hasil data menjadi bias. Panjang gelombang yang digunakan dalam penelitian ini adalah 244 nm sehingga tidak terjadi bias
data akibat UV-cutoff.
Evaluasi polaritas fase gerak yang digunakan dapat dilihat dengan menggunakan parameter indeks polaritas (P’). Komposisi fase gerak yang digunakan pada penelitian ini adalah metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 dengan perbandingan 10:90; 20:80; 30:70; 40:60; dan 50:50. Menurut Mulja dan Suharman (1995), semakin besar nilai indeks polaritas campuran fase gerak, maka semakin polar fase gerak yang digunakan. Indeks polaritas fase gerak yang digunakan untuk masing-masing komposisi dapat dilihat pada tabel II di bawah ini:
Tabel II. Indeks polaritas fase gerak campuran metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 (Snyder dkk., 2010)
No. Komposisi Fase Gerak Indeks Polaritas Metanol Bufer fosfat 0,01 M pH 3
1. 10 90 9,69
2. 20 80 9,18
3. 30 70 8,67
4. 40 60 8,16
5. 50 50 7,65
Menurut hasil indeks polaritas di atas dapat dikatakan bahwa dengan bertambahnya metanol dalam campuran fase gerak maka semakin non polar fase gerak yang digunakan. Hal ini menjadi dasar pemilihan variasi komposisi fase
gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 yang akan di optimasi yaitu 10 : 90; 20 : 80; 30 : 70; 40 : 60 dan 50 : 50. Asam askorbat merupakan senyawa yang bersifat polar sehingga cenderung akan lebih optimal terelusi dengan menggunakan fase gerak yang bersifat polar dalam sistem KCKT fase terbalik.
Fase gerak yang telah dipersiapkan, disaring dengan menggunakan
kertas Whatman 0,45 µm dengan maksud untuk menghilangkan partikel-partikel
yang dapat mengotori kolom dan mengganggu pengukuran. Selanjutnya, fase
gerak harus didegassing selama kurang lebih 15 menit untuk menghilangkan
gelembung gas yang dapat mengganggu detektor.