METODOLOGI PENELITIAN
3.10 Pelaksanaan Penelitian
3.10.1 Penerbitan Ethical Clearance
Meminta penerbitan ethical clearance kepada komisi etik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara
3.10.2 Pengurusan izin penelitian
Meminta izin pelaksanaan penelitian kepada Direktur Rumah Sakit Umum Pusat Haji Adam Malik.
3.10.3 Proses Seleksi Subyek Penelitian
Subyek penelitian diseleksi berdasarkan kriteria inklusi dan eksklusi di Rumah Sakit Umum Pusat Haji Adam Malik.
3.10.4 Proses Pengambilan Sampel
Alat yang digunakan : spuit 3 cc , sarung tangan , tabung penyimpanan darah ,tisu,stiker tempel untuk penulisan nama sampel, spidol, termos es tempat penyimpanan sementara sampel darah.
Bahan yang digunakan : EDTA
Pengumpulan sampel dari para subyek penelitian dilakukan selama 9 minggu di poli Bedah Onkologi Rumah Sakit Haji Adam Malik. Pengambilan sampel dilakukan dengan mengambil darah sampel dan dimasukkan ke tabung EDTA kemudian disimpan sementara didalam wadah termos es, sebelum dilakukan isolasi DNA di laboratorium terpadu FK USU
3.10.5. Proses Isolasi DNA
- Setiap pasien yang menjadi subyek penelitian diambil data hasil neutrofil selama 3 siklus kemoterapi
Alat yang digunakan : Tabung reaksi, sarung tangan, tabung eppendorf 1,5 ml, mikropipet, mikrosentrifus, vortex, beaker glass, spidol, Blue tip, yellow tip
Bahan yang digunakan : darah ± 3 ml, EDTA, El Buffer, Nuclei Lysis Solution, Protein precipitation solution, etanol 70%, DNA Rehydration Solution Beberapa sampel yang sudah dikumpulkan dari Rumah Sakit Haji Adam Malik, setiap siang harinya langsung dibawa ke laboratorium terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara untuk melaksanakan proses selanjutnya.
Sampel berupa darah 3 cc dimasukkan ke tabung EDTA yang diinjeksikan secara perlahan-lahan. Darah EDTA dibolak-balik perlahan supaya bergabung dengan EDTA, lalu disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm dlm 10-15 menit. Darah EDTA yang sudah disentrifus kemudian dipisahkan plasmanya dan diambil leukositnya (Buffy coat) sebanyak 300 µl pada tabung eppendorf 1,5 ml. Pada saat mengambil buffy coat hendaknya ujung mikropipet dipotong sedikit lalu ditambah El Buffer 900 µl, dibolak-balik perlahan. Buffy coat yang telah dimasukkan dalam tabung eppendorf kemudian diinkubasi ± 10 menit dalam kulkas lalu dissentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit. Setelah disentrifus, maka dibuang supernatant, membuang supernatant hendaknya dilakukan dengan hati-hati, perlahan jangan sampai endapannya ikut terbuang sampai warna supernatant jernih dan endapan sudah berwarna putih. Setelah didapat endapan putih atau cairan sudah jernih, supernatant dibuang lalu endapan divortex selama 20 detik.
Tambahkan 300 µl Nuclei Lysis Solution dan campurkan dengan bolak-balik.
Tambahkan 100 µl Protein precipitation, vortex selama 20 detik. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit pada temperatur ruang. Kemudian
dipindahkan supernatant ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml yang steril yang telah berisi 300 µl isopropanol kemudian divortex selama 3 detik atau dibolak-balik sampai terlihat benang-benang DNA. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit maka akan tampak pellet putih. Buang supernatant lalu tambahkan 300 µl etanol 70%, sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit.
Dengan hati-hati aspirasikan etanol menggunakan pipet dan dikeringkan sampai 1 jam. Lalu ditambahkan 50 µl DNA Rehydration Solution dan disimpan pada suhu 40C selama 1 malam. Setelah itu disimpan dalam suhu -200 C.
3.10.6. Proses Amplifikasi DNA dengan PCR
Alat yang digunakan : Mesin PCR/Thermal cycler, mikrosentrifus, mikropipet, tabung eppendorf, Yellow tip, Blue tip, sarung tangan
Bahan yang digunakan : GoTaq® Green Master Mix, primer forward ekson 26 ABCB1 5’-TGTTTTCAGCTGCTTGATGG-3’ dan primer reverse ekson 26 ABCB1 5’-AAGGCATGTATGTTGGCCTC-3’ (Cizmarikova et al, 2010), Nuclease free water PCR sebanyak 8,5 µL ditambahkan DNA template atau whole genom sebanyak 2 µL. Kemudian primer reverse dan primer forward dimasukkan masing-masingnya sebanyak 1 µL dengan total volume final 25 µL . Lalu disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm.setelah disentrifugasi, bahan tersebut dimasukkan kedalam mesin PCR/thermal cycle .
3.10.7. Uji Polimorfisme dengan Teknik RFLP
Alat yang digunakan : Tabung reaksi, sarung tangan, tabung eppendorf 1,5 ml, mikropipet, mikrosentrifus, vortex, beaker glass, spidol, Blue tip, yellow tip
Bahan yang digunakan : Produk PCR dengan menggunakan enzim restriksi sebanyak 1 unit Sau3AI restriction endonuclease, Buffer, Nuclear Free Water.
Produk PCR dicerna (digested) pada suhu 37o C selama minimal 2 jam dengan menggunakan 1 unit Sau3AI I restriction endonuclease. Fragmen yang telah direstriksi kemudian dipisahkan dengan elektroforesis pada gel agarose 2%
selama 60 menit pada 80V dan dianalisa setelah diwarnai dengan Ethidium Bromide dibawah sinar UV. Pola elektroforesis menunjukkan satu pita (158 bp) untuk homozigot CC genotipe, 2 pita (197 dan 158 bp) untuk heterozygot CT genotipe dan satu pita (197 bp) untuk homozygot TT genotipe
3.10.8. Proses Persiapan larutan dan bahan untuk elektroforesis
Beberapa larutan yang perlu disiapkan:
1X TBE – dibuat sebanyak 1000mL , jika jumlahnya kurang bisa dibuat kembali.
Dimasukkan 10.8 g Tris, 5.5 g asam borik acid, 0.74 g EDTA ke dalam beaker 1000 ml. Dan ditambahkan 900mL akuades dan diaduk dengan magnetic stirrer sampai larut. Kemudian ditambahkan akuades sampai volume larutan sama dengan 1 L. Simpan di dalam botol bersih pada temperatur ruangan dan larutan ini dapat disimpan selama beberapa bulan.
Agarose 2% - (diperlukan 2,8 gram/casting tray) dan dibuat 140 ml untuk 1 casting tray yang bisa untuk 30 sampel.
5 g agarose dimasukkan ke dalam beaker/flask 250 ml yang bersih.lalu ditambahkan 125 ml larutan 1X TBE buffer solution. kemudian flask/beaker ditutup dengan foil aluminium untuk mengurangi penguapan dan disisakan sedikit celah. Aduk secara gerakan flask. Dipanaskan sampai mendidih dan larutan jernih.
Dinginkan dan tambahkan 12 μL larutan ethidium bromide/casting tray. harus berhati-hati dengan ethidium bromide pada proses ini sarung tangan harus dipakai
3.10.9. Elektroforesis produk PCR dengan Gel Agarose
Alat yang digunakan : Sarung tangan, mikropipet, beaker glass, erlenmeyer glass, stir hot plate, timbangan automatik, casting tray, gel doc, chamber, blue tip, yellow tip
Bahan yang digunakan : Agar 2%, Tris Acetic Acid (TAE), Double destilation Aquades (DD aquadest), ethidium bromide, Tris Boric Acid (TBE), Loading dye
Dipersiapkan casting tray, dipasang satu “comb” (sisir) pada pertengahan “tray”
(plat cetakan) dan sisir lainnya di ujung tray. Kemudian agarose 2 % sebanyak 140 mL dituang ke casting tray, didiamkan sampai gel membeku. Bila gel sudah beku, comb diangkat secara hati-hati, dan diletakkan gel di dalam tank elektroforesis yang sudah berisi larutan 1X TBE. Lalu ditambahkan larutan 1X TBE secukupnya sampai gel-gel terbenam seluruhnya. Setelah itu, 10μl DNA sampel dimasukkan ke sumur gel.posisi dan urutan sampel penelitian dicatat.
Mesin elektroforesis dinyalakan selama 90 menit dengan tegangan 90V. dan akan terlihat sampel-sampelnya akan mulai bergerak ke katode lalu mesin elektroforesis dimatikan dan gel dikeluarkan dengan sangat hati-hati dan diletakkan pada tray yang disediakan. dipindahkan ke alat Gel documentation system untuk pembacaan pita DNA dan dokumentasi hasil (Rasmussen 2010) 3.10.10 Elektroforesis produk RFLP dengan Gel Agarose
Proses elektroforesisnya sama, yang berbeda hanyalah sampel yang di elektroforesis.