Tahap awal dari penelitian ini adalah ploting areal penelitian dimana akan dilakukan pengujian sampel. Tanaman akan dijadikan tanaman sampel ditandai dengan jelas dengan cat dan diberi tali untuk menghindari kesalahan pengamatan dan agar tanaman yang dijadikan tanaman sampel tidak disadap oleh penyadap. Pengerokan Bidang Sadap
Setelah didapatkan sampel tanaman sampel tanaman yang mengalami kejadian KAS maka sebelum pemberian asma askorbat terlebih dahulu bidang sadap yang akan diberi perlakuan dikerok (bark scarpping) dengan pisau kerok untuk menghilangkan kulit luarnya kurang lebih 1-2 mm.
Perlakuan Pemberian Asam Askorbat
Larutan asam askorbat yang diberikan sesuai dengan perlakuan, dicampur dengan gliserin dan dioleskan pada bidang sadap tanaman yang sudah dikerok.Interval pemberian perlakuan adalah 1 kali dalam 1 minggu selama 4 bulan.
Pengamatan kondisi fisiologi
Pengamatan kondisi tersebut diamati dengan cara mengambil sampel lateks yang telah di tampung dan di bawa ke lab menggunakan es. Lateks di ambil 1 ml kemudian di masukan ke dalam 9 ml TCA. Serum di keluarkan dari lateks dengan cara di gerus.
Parameter Pengamatan Fisiologis lateks
Pengamatan kondisi fisiologis, yaitu kandungan sukrosalateks, kandungan fosfat anorganiklateks, kandungan thiol (R – SH) lateks. Setiap pengamatan
dilakukandengan cara mengambil sampel lateks.Pengamatan ini dilakukan pada saat, 0, 2, 4, bulan setelah aplikasi larutan asam askorbat.
Peubah Amatan Thiol (R – SH) (mM)
Pengamatan dilakukan pada sampel lateks yang diambil 1 ml langsung dari lapangan kemudian direndam pada larutan trikloro-asetat (TCA 2,5%) (2,5 g TCA dilarutkan dalam 100 ml akuades) sebanyak 9 ml pada botol ukur. Lateks yang menggumpal akibat perendaman diaduk berulang-ulang hingga serum pada lateks tercampur dengan larutan TCA kemudian dipipet campuran larutan TCA dengan serum lateks sebanyak 1,5 ml dengan menggunakan mikropipet setelah itu dicampurkan dengan larutan TCA 2,5% sebanyak 1,5 ml pada tabung reaksi kemudian dicampurkandengan pereaksi dithiobis-nitrobenzoat (DTNB) 10 mM (larutan dari DTNB 79,3 g + EDTA 148,8 g + buffer tris 0,5 M (tris 30,3 g dilarutkan dalam 500 ml aquades) 5 ml + aquades 5 ml) sebanyak 75 µ L setelah itu dicampurkan kembali dengan buffer tris 0,5 M sebanyak 1,5 ml dan divortex untuk membentuk nitrobenzoat (TNB) yang berwarna kuning yang terabsorbsi
pada λ 421 nm (nanometer) dengan spektrofotometer Beckman DU 650
(Bobbiliof, 1923). Pengamatan ini dilakukan pada saat, 0, 2 dan 4 bulan setelah aplikasi larutan asam askorbat.
Sukrosa (mM)
Pengamatan kadar sukrosa menggunakan metode anthrone (Dische, 1962). Pengamatan dilakukan pada sampel lateks yang diambil 1 ml langsung dari lapangan kemudian direndam pada larutan trikloro-asetat (TCA 2,5%) (2,5 g TCA dilarutkan dalam 100 ml akuades) sebanyak 9 ml pada botol ukur. Lateks
yang menggumpal akibat perendaman diaduk berulang-ulang hingga serum pada lateks tercampur dengan larutan TCA kemudian dipipet campuran larutanTCA dengan serum lateks sebanyak 150 µL dengan menggunakan mikropipet setelah itudicampurkan dengan larutan TCA 2,5% sebanyak 350 µL pada tabung reaksi kemudian dicampurkan kembali pada pereaksi anthrone (larutan dari 0,1 g anthrone + larutan asam sulfat pekat (H2SO4 70%) sebanyak 100 ml) sebanyak 3 ml dan divortex kemudian dipanaskan dengan merendamkannya pada air mendidih selama 15 menit sehingga menyebabkan dehidrasi sukrosa dimana akan memberikan turunan furfural yang bereaksi dengan terjadinya perubahan warna
larutan menjadi warna biru yang selanjutnya diamati absorbannya pada λ 627 nm
(nanometer) dengan spektrofotometer Beckman DU 650. Pengamatan ini dilakukan pada saat, 0, 2 dan 4 bulan setelah aplikasi larutan asam askorbat.
Fosfat Anorganik (Pi)(mM)
Pengamatan kadar fosfat anorganik berdasarkan prinsip pengikatan oleh amonium molibdad (Taussky and Shorr, 1953). Pengamatan dilakukan pada sampel lateks yang diambil 1 ml langsung dari lapangan kemudian direndam pada larutan trikloro-asetat (TCA 2,5%) (2,5 g TCA dilarutkan dalam 100 ml akuades) sebanyak 9 ml pada botol ukur. Lateks yang menggumpal akibat perendaman diaduk berulang-ulang hingga serum pada lateks tercampur dengan larutan TCA kemudian dipipet campuran larutan TCA dengan serum lateks sebanyak 0,3 ml dengan menggunakan mikropipet setelah itu dicampurkan dengan larutan TCA 2,5% sebanyak 1,2 ml pada tabung reaksi kemudian dicampurkan kembali dengan pereaksi campuran (larutan dari FeSO4 5 g + 50 ml aquades + larutan stock molibdat (H2SO4 70% 27,8 ml + amonium heptamolibdat
10 g + aquades 70 ml) 10 ml dan diterakan dengan menggunakan aquades hingga 100 ml) sebanyak 1 ml dan divortex kemudian didiamkan pada suhu kamar (25ºC) selama 10 menit sehingga tereduksi dalam reaksi asam yang menyebabkan perubahan warna pada larutan tersebut menjadi warna biru yang kemudian
diamati absorbannya pada λ 627 nm (nanometer) dengan spektrofotometer
Beckman DU 650.Pengamatan ini dilakukan pada saat, 0, 2 dan 4 bulan setelah aplikasi larutan asam askorbat.
Pengukuran indeks penyumbatan (IP)
Indeks penyumbatan merupakan perbandingan dari laju pengaliran lateks permenit dengan volume lateks total dikalikan 100 % (Milford, et al,1969). Pengamatan dilakukan di bulanke-2 dan ke-4, diamati pada saat mulai penyadapan (pukul 5.30 WIB) di ukur volume lateks pada 5 menit pertama dan volume lateks pada akhir atau total dengan gelas ukur pada setiap satuan percobaan.
Pengukuran kadar karet kering (KKK) /total solid content (TSC)
Pengukuran KKK dengan mengukur TSC (semua padatan selain partikel karet ikut diukur) pengamatan di lakukan dilakukan dengan cara mengambil beberapa tetes sampel lateks segar (1-3 gram) pada setiap unit percobaan diratakan dalampetridish kemudian dioven 1 x 24 jam dengan suhu 65 0C hingga berat konstan, lalu di timbang berat keringnya. Persentase TSC diperoleh dengan membandingkan berat kering dan berat basah dikalikan dengan 100% .
IP = Vol total Vol 5menit x 100 % TSC= x 100 % Berat kering Berat basah
Produktivitas
Pengamatan terhadap produktivitas tanaman karet dilakukan di bulan 1 dan 2, serta diamati setiap 10 hari sekalidi bulan 3 dan 4setelahaplikasi larutan asam askorbat,pengamatan di lakukan dengan cara menimbang berat lateks yang telah berhenti menetes dari alur sadap, kemudian di ambil sempel segar untuk mengukur TSC, lalu berat segar tadi di bandingkan dengan nilai TSC di kali 100%sehingga dapat dilihat apakah tanaman yang telah mendapat perlakuan dapat menghasilkan lateks layaknya tanaman yang sehat.
Superoksida dismutase (SOD)
Sampel lateks disentrifugasi 12 rpm selama 30 menitpada suhu 40C, jika serum belum terpisah sampel disentrifugasi kembali 12 rpm selama 15 menitpada suhu 40C, kemudiam setelah terpisah di ambil supernatannya 150 Mm dan di masukan larutan baffer yang di dalamnya terlarut bafer phosfat 750 µM, methionine 50 µM, NBT 50 µM, EDTA150 µM, ektrak enzim 100 µM, riboflavin 50 µM dan H2O 350 µM, lalu di baca di spektrofotometer Beckman DU 650 dengan absorbannya pada 595 λ nm (nanometer).Untuk kandungan protein lateks segar dikumpulkan dalam 1,5 ml tabung ependorf lalu sampel lateks di sentrifugase untuk memisahkan fraksi karet dari total serum, setelah terpisah di tambah regen bradfort, membuat regen bradfort yaitu timbng coomassie briviant blau 0,01 g, etanol 5 ml, phosporid acid 10 ml, lalu encerkan dengan aquades 75 ml setelah tercampur.Kemudian di baca di spektrofotometer Beckman DU 650.
TSC
Diukur 2 kali, sebelum dan setelah 4 bulanaplikasi larutan asam askorbat. Satu unit enzim aktivitas SOD didevinisikan sebagai aktifitas SOD/ mg protein.