Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri endofit secara molekuler serta menghitung diameter daya hambatnya terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia colii. Dalam penelitian ini sampel yang digunakan adalah daun pepaya yang di ambil di daerah Lubuk Minturun, Koto Tangah, Padang, Sumatera Barat. Kemudian diidentifikasi di Herbarium ANDA dengan No Identifikasi: 061/K-ID/ANDA/II/2020 yang bertujuan untuk mengenali tumbuhan yang dimaksud adalah tumbuhan yang sama. Sampel daun pepaya ini memiliki nama spesies Carica papaya L. Sampel diambil dengan tiga
37 kategori yaitu pucuk daun, daun muda, dan daun tua, karena untuk mengetahui daun mana yang menghasilkan bakteri endofit yang mengandung senyawa aktif antibakteri terbesar.
Sampel yang diperoleh tersebut dilakukan sterilisasi permukaan dengan larutan Na.hipoklorit dan etanol 96% yang berfungsi sebagai desinfektan yang berguna untuk mensterilkan dan menghilangkan kotoran serta mikroorganisme lain yang menempel pada permukaan sampel, sehingga koloni yang tumbuh pada media isolasi merupakan bakteri endofit (Strobel dan daisy, 2003)
Sampel yang telah disterilisasi di potong 3-4 cm kemudian diinkubasi di media Nutrient Agar dalam cawan petri, media Nutrient Agar dipilih karena didalam media ini terdapat nutrien yang merupakan substansi organik dan anorganik yang digunakan sebagai sumber energi untuk mendukung pertumbuhan bakteri (Priharta, 2008). Media diletakkan secara terbalik pada inkubator yang berfungsi untuk menghindari uap air yang memenuhi tutup cawan petri hasil dari penguapan media selama inkubasi (Imawati, 2015). Media yang di simpan dalam ikunbator dengan suhu 370C merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri dan waktu yang berhasil ditumbuhkan setelah inkubasi yaitu selama 24 jam karena pada waktu tersebut bakteri dimungkinkan telah berada pada fase logaritmik dan eksponensial, karena pada fase tersebut bakteri melakukan pembelahan secara konstan dan jumlah sel meningkat (Ifnawati, 2013)
Setelah bakteri endofit tumbuh, kemudian dilakukan isolasi bakteri endofit untuk mendapatkan biakan murni bakteri endofit dengan menginokulasi 1 ose bakteri endofit yang tumbuh di sekitar daun pepaya. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam, kemudian didapatkan koloni bakteri yang terpisah yaitu koloni
38 murni yang hanya mengandung satu karakteristik morfologi yang sama (Henry, dkk. 2018). Dari hasil pemurnian diperoleh 3 isolat bakteri murni dari ketiga koloni bakteri daun Pepaya. Masing-masing isolat diberi kode DP (Daun Pucuk) DM (Daun Muda), dan DT( Daun Tua).
Hasil identifikasi morfologi secara makroskopis menunjukkan bahwa ketiga koloni bakteri endofit mempunyai bentuk bulat, permukaan timbul datar, tepian terdapat lengkungan dan warna putih kekuningan. Menurut Faradiska (2012) karakteristik koloni bakteri endofit yaitu mempunyai bentuk yang bulat, oval, dan pada warna koloni yaitu putih, putih kekuningan, atau kental seperti susu, dan tepian koloni terdapat lekukan seperti gelombang dan menyebar.
Selanjutnya dilakukan identifikasi secara mikroskopis dengan pengamatan secara pewarnaan gram yang menunjukkan hasil bahwa isolat bakteri endofit seluruhnya merupakan bakteri gram positif yang ditunjukkan dengan koloni berwarna ungu (Lampiran 7, Gambar 25). Bakteri gram positif ditunjukkan dengan adanya koloni berwarna ungu karena bakteri gram positif mampu mempertahankan zat warna utama dalam pewarnaan Gram, yaitu kristal violet sehingga tampak warna ungu saat pengamatan dikarenakan dinding sel kelompok bakteri ini tersusun oleh sebagian besar peptidoglikan yang tebal yang mampu mengikat zat warna dan tidak merusak saat dicuci dengan alkohol. Bakteri gram positif lebih kompleks dalam memproteksi pertahanan dari gangguan fisik maupun patogen dalam jaringan inang, jika dilihat dari struktur dan komposisi dinding sel, bakteri gram positif relatif lebih sederhana dibandingkan dengan bakteri gram negatif yang lebih kompleks (Imawati, 2015)
39 Tabel 5. Hasil Pengamatan Bakteri Berdasarkan Pewarnaan Gram
Kode Isolat Pewarnaan Gram Bentuk
DP Positif Basil
DM Positif Basil
DT Positif Basil
Keterangan Tabel 5. DP=Daun Pucuk, DM=Daun Muda, DT=Daun Tua
Setelah dilakukan Uji morfologi isolat bakteri endofit, selanjutnya dilakukan uji aktivitas antibakteri untuk mengetahui kemampuan penghambatan bakteri terhadap bakteri uji yang dilakukan dengan menggunakan difusi agar terhadap 2 jenis bakteri yaitu bakteri gram positif Staphylococcus aureus dan bakteri gram negatif Escherichia coli. Bakteri Staphylococcus aureus merupakan bakteri flora normal pada tubuh manusia dan merupakan bakteri patogen pada manusia jika jumlahnya meningkat dalam tubuh maka dapat menimbulkan penyakit, dan dapat menyebabkan kulit bernanah (Brooks, et al, 2008). Sedangkan bakteri Escherichia coli bersifat patogen pada manusia sehingga menyebabkan gangguan pencernaan pada manusia serta mengganggu sistem kerja dari organ lambung
Bakteri uji diperoleh dari Labolatorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Andalas, sebelum dilakukan uji aktivitas sediaan terhadap bakteri uji, terlebih dahulu dilakukan identifikasi bakteri uji di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Perintis Indonesia, Padang menggunakan pewarnaan gram. Hasil dentifikasi menunjukkan bahwa bakteri yang dapat mempertahankan zat warna ungu pada saat pencucian dengan alkohol 96% merupakan bakteri gram positif sedangkan kelompok bakteri yang tidak dapat mempertahankan zat warna ungu pada saat pencucian dengan alkohol 96% maka merupakan bakteri gram
40 negatif yang ditandai dengan warna merah pada pewarnaan dengan air fuksin dan safranin (Radji, 2010) ( Lampiran 8, gambar 26)
Uji aktivitas antibakteri dilakukan pada 3 isolat bakteri endofit dengan kode DP, DM, dan DT yang diuji dengan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia colii dengan metode difusi menggunakan kertas cakram dengan media Mueller Hinton Agar (MHA). Pada media MHA yang sudah mengandung bakteri uji diletakkan kertas cakram yang berisi suspensi bakteri endofit dari 3 isolat bakteri tersebut dan amoksicillin sebagai kontrol positif, selanjutnya media tersebut diinkubasi dalam inkubator selama kurang lebih 24 jam pada suhu 370C dengan posisi terbalik yang berfungsi untuk menghindari uap air yang memenuhi tutup cawan petri hasil dari penguapan media selama inkubasi (Imawati, 2015)
Setelah 24 jam, media tersebut di ukur diameter daerah bening pada kertas cakram yang menunjukkan potensi daya hambat dari bakteri endofit terhadap bakteri uji tersebut. Dari hasil pengukuran rata-rata diamter zona hambatnya, daya antibakteri dengan kode DP, DM, dan DT adalah (0.00 mm) dengan kategori tidak dapat menghambat bakteri Staphylococcus aureus karena tidak terdapat zona bening disekitar kertas cakram. Sedangkan daya antibakteri terhadap bakteri uji dari isolat kode DP yaitu (8,45 mm) yang termasuk kategori lemah, kode DM (8,7 mm) termasuk kategori lemah, dan kode DT ( 8,6 mm) juga termasuk ketegori lemah. Karena menurut Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI), respon hambatan lemah ketika diameter zona hambat antibakteri ≤ 14 mm, respon hambatan sedang ketika diameter zona hambat antibakteri 15-18 mm, respon hambatan kuat ketika diameter zona hambat antibakteri ≥ 19 mm
41 Tabel 6. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Bakteri Endofit Daun Pepaya
Kode Isolat/
Kontrol
Diameter Zona Bening (mm) S.aureus
Rata-rata
E. coli
Rata-rata
Pengulangan Pengulangan
1 2 1 2
DP 0 0 0 8,5 8,4 8,45
DM 0 0 0 8,8 8,7 8,75
DT 0 0 0 8,6 8,6 8,6
Amoxicilin (Kontrol Positif)
17,5 17,6 17,5 16,1 19 17,55
(pengulangan 1) (pengulangan 2)
Gambar 5.Aktivitas Antibakteri Bakteri Endofit Daun Pepaya terhadap Bakteri Escherichia coli
Keterangan gambar: K = Kontrol positif (amoksicilin) 1 = Daun Pucuk (DP)
2 = Daun Muda (DM) 3 = Daun Tua (DT)
Dengan demikian diketahui bahwa bakteri dengan kode isolat DP, DM, dan DT seluruhnya memiliki daya antibakteri yang lemah terhadap Escherichia coli karena menunjukaan zona bening di area kertas cakram, terbentuknya zona bening menunjukkan bahwa bakteri endofit tersebut menghasilkan senyawa bioaktif seperti yang dihasilkan tanaman pepaya yaitu senyawa alkaloid, tanin, flavanoid dan terpenoid yang mampu digunakan sebagai antibakteri. Perbedaan diameter zona bening juga dipengaruhi oleh faktor lingkungan dan bakteri uji yang berlebihan, sehingga pengaruh metabolit sekunder yang dihasilkan oleh bakteri endofit tidak signifikan terhadap bakteri uji.
42 Mekanisme penghambatan pertumbuhan bakteri oleh metabolit sekunder dapat terjadi melalui penghambatan pembentukan senyawa penyusun dinding bakteri, peningkatan permeabilitas membran sel, sehingga sel kehilangan komponen penyusun sel. (Sepriana dkk, 2017) Dari perhitungan rata-rata, diameter zona hambat yang dihasilkan isolat bakteri endofit lebih besar menghambat pertumbuhan bakteri Gram Negatif Escherichia coli, karena struktur dinding sel yang menyebabkan kedua jenis bakteri tersebut memberikan respon yang berbeda sehingga menunjukkan bekteri dengan kode isolat DM memiliki nilai perhitungan rata-rata diameter zona hambat yang lebih basar dibandingkan dengan isolat kode DP, dan DT.
Isolat bakteri dengan kode DM yang memiliki daya hambat terbesar dilanjutkan untuk identifikasi molekuler dengan menggunakan Gen 16S rRNA untuk mengetahui jenis bakteri tersebut. Dalam proses identifikasi molekuler mikroorganisme terdapat 4 proses utama yaitu isolasi DNA, PCR, elektroforesis, dan Sequensing. Proses isolasi DNA menggunakan metode boiling yang merupakan metode isolasi sederhana dengan memberikan gangguan fisik terhadap sel bakteri berupa pemanasan dengan suhu tinggi (950-1000C). Pemanasan dengan suhu tinggi dapat meningkatkan permeabilitas dinding sel sehingga mengakibatkan masuknya cairan dan molekul di sekitar sel dan keluarnya materi-materi dari dalam sel, kemudian DNA dipisahkan untuk selanjutnya digunakan sebagai DNA dalam proses PCR (Afif, 2019)
Setelah dilakukan isolasi DNA tahap selanjutnya adalah proses PCR yang bertujuan untuk melipat gandakan suatu pita DNA, dengan 3 reaksi berantai yaitu denaturasi (950C) annealing (550C) dan extension(720C) (Mahardika, 2005).
43 Proses ini dilakukan sebanyak 35 siklus selama 2 jam. Bahan yang digunakan H2O, Taq Master mix, primer forwad (63F) dan primer reverse (1387R), dan Cl.
Master Mix berfungsi sebagai komponen atau campuran DNA tamplete yang akan diamplifikasi menggunakan mesin PCR. Primer Forward berfungsi untuk untuk menginisiasi sintesis untai DNA dari ujung 5’ --- 3’ sedangkan Primer Reverse berfungsi untuk Menginisiasi sintesis untai DNA dari ujung 3’ --- 5’.
Fungsi DNA template di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase dan H2O berfungsi sebagai pelarut DNA (Harvianti, 2017).
Tahap berikutnya yaitu elektroforesis DNA yang merupakan suatu teknik yang mengukur laju perpindahan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik (Gaffar, 2007). Hasil dari proses ekstraksi dan PCR kemudian dielektroforesis selama 30 menit dengan voltase 100 pada gel agarosa dengan konsentrasi 0,8 %. Dari hasil elektroforesis diketahui terdapat benk yang terseparasi dan sejajar dengan marka 1300 bp. Hal ini mengindikasikan bahwa fragmen gen yang teramplifikasi memiliki ukuran ±1300 bp yang sesuai dengan ukuran nukelotida dari gen 16S rRNA yaitu sekitar 1500 bp (Rinanda, 2011).
44 Dimana hasil dari elektrofoteris dari isolat DM didapatkan hasil sebagai berikut:
Gambar 6. Hasil Elektoforesis dari Produk Amplifikasi Gen 16S rRNA isolat bakteri endofit daun muda (DM) dengan ukuran pita DNA ±1300bp.
M (DNA marker) 1 kb DNA ladder.
Sehingga dapat dikatakan bahwa proses amplifikasi bakteri berhasil dilakukan.
Selanjutnya isolat dideterminasi dengan menggunakan sekuen 16S rRNA yang dianalisis secara lengkap di 1st BASE Singapura melalui PT. Genetika Science.
Pada sekuen tersebut dilakukan dengan program BLAST-N (Basic Local Aligment Search Tool-Nukelotida). Hasil analisis BLAST dari isolat DM seperti pada gambar berikut :
Gambar 7.Hasil Analisis BLAST dari Isolat Bakteri Endofit DM
10000bp
3000bp
1500bp 1000bp
M DM
45 Analisis BLAST dilakukan dengan tujuan untuk membandingkan hasil yang diperoleh dengan hasil sekuen DNA dari seluruh dunia yang didepositkan pada database Gen Bank. Analisis hasil BLAST tersebut memberikan informasi mengenai bakteri apa yang mempunyai kesamaan dengan urutan DNA sampel sehingga dapat digunakan untuk identifikasi bakteri. Informasi dari hasil BLAST tersebut berupa Query Coverage dan Maximum identity.
Ciri-ciri yang paling mirip dengan sequens DNA yang diperoleh dapat dilihat dari nilai Max Score yang merupakan nilai kesamaan (identik) pasangan basa dengan Total Score sama, dan Query Coverage yang merupakan presentase sampel yang terpakai dalam analisis BLAST mendekati 100%, serta Max identity adalah presentase keakuratan identifikasi mendekati 100%. Hasil analisis BLAST dari isolat bakteri endofit DM menunjukkan bahwa spesies isolat DM homolog 98% dengan bakteri Bacillus cerues, menurut Akihary (2020) Apabila homologi sekuen 16S rRNA menunjukkan <97,5 % dapat dikatan sebagai spesies yang berbeda atau novel spesies dan dikatakan satu spesies apabila kemiripan yang dimiliki adalah 99%.
46 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN