ISOLASI dan IDENTIFIKASI DENGAN GEN 16S rRNA BAKTERI ENDOFIT DARI DAUN PEPAYA (Carica papaya L.) SERTA UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERINYA
SKRIPSI
Oleh:
ULFA ROSIATUL HUDA NIM : 1604041
PROGRAM STUDI S1 FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PERINTIS INDONESIA PADANG
2020
iii PERNYATAAN ORISINILITAS DAN PENYERAHAN HAK CIPTA
Saya yang bertanda tangan di bawah ini:
Nama : Ulfa Rosiatul Huda
NIM : 1604041
Judul Skripsi : Isolasi dan Identifikasi dengan Gen 16S rRNA Bakteri Endofit dari Daun Pepaya (Carica papaya L.) Serta Uji Antibakterinya
Dengan ini menyatakan bahwa:
1. Skripsi yang saya tulis merupakan hasil karya saya sendiri, terhindar dari unsur plagiarisme, dan data beserta seluruh isi skripsi tersebut adalah benar adanya 2. Saya menyerahkan hak cipta dari skripsi tersebut pada Universitas Perintis
Indonesia untuk dapat dimanfaatkan dalam kepentingan akademis
Padang, 15 September 2020
Ulfa Rosiatul Huda
iv Bacalah dengan menyebut nama Tuhanmu Dia telah menciptakan manusia dari
segumpal darah, Bacalah, dan Tuhanmulah yang maha mulia
yang mengajarkan manusia dengan pena, Dia mengajarkan manusia apa yang tidak diketahuinya
(QS: Al-‘Alaq 1-5)
Sesungguhnya bersama kesulitan itu ada kemudahan maka apabila telah selesai (dari suatu urusan) kerjakanlah dengan sesungguh-sungguh (urusan)
yang lain dan hanya kepada Tuhanlah hendaknya kamu berharap (Qs. Al- Insyirah: 7,9)
Syukur alhamdulillah penulis ucapkan kepada Allah S.W.T yang telah mengizinkan dan memberikan kesempatan serta kelancaran kepada penulis untuk dapat menyelesaikan pendidikan S1 Farmasi ini...
Teruntuk ibu dan ayah.…
Terimakasih atas segala support yang telah engkau berikan, segala do’a kebaikan yang telah engkau hantarkan, karena semua yang telah Ulfa lalui ini berkat do’a dan air mata disetiap sujud dan tengadahmu kepada ALLAH...
Semua ini Ulfa persembahkan untuk ibu dan ayah tersayang…..
Buat uni dan adek ( uni witta dan fadel )
Terima kasih atas segala kasih sayang serta dukungan yang kalian berikan kepada Ulfa sehingga menjadikan Ulfa kuat disetiap langkah, dan teruntuk adikku tersayang semoga kamu lebih sukses dari kakak-kakakmu ….
Teruntuk semua dosen dan staf Fakultas Farmasi Universitas Perintis Indonesia, terimakasih untuk mu yang sangat berarti semoga berguna dimasa depan. Teristimewa kepada bapak apt.
Irwandi, M.Farm dan ibuk Epi Spuriwardi, M,Si yang telah membimbingku dengan penuh kesabaran dari awal sampai saat ini, serta bapak apt. Yahdian Rasyadi, M.farm sebagai pembimbing akademik yang sudah sangat membantu, membimbing serta menasehatiku selama ini.
Untuk Sahabat dan Teman-temanku
“Bacot Empire”Asih, Atikah, Bella, Bilmi, Dona, Gina,Icin, Noprial, Rifqi, Rima, Rori, Satria,Arief, Sonder, Septa, Wulan, Widy, Fajar, Monic, Vella dan Yoga terimakasih kepada kalian semua yang tetap setia dan selalu menyemangati ku dalam suka dan banyak duka... rindu
hati ini untuk menghabiskan waktu bersama kalian lagi...
v Untuk teman seangkatan ku bp 16 “VERENIGEN” ter The Best sudah 4 tahun berlalu suka
duka sudah kita lalui bersama meskipun sudah ada yang tamat lebih dulu tapi kalian selalu menjadi keluargaku, karna berkat kalian jugalah diriku bisa menemukan jalan keluar atas semua
masalah yang aku temui selama masa perkulian ini..semoga masing-masing dari kita dapat menggapai apa yang selalu kita impi-impikan ya kawan...
“For My kost Gl” Icha, Puji, Wilda, Kak Wel, Hera, Putri terima kasih atas kegaduhan kalian setiap malam demi menghibur suasana kos yang kelam, dan juga terima kasih atas support kalian yang tidak pernah henti untuk diriku, semoga canda tawa kita tidak akan pernah hilang meski harus berpisah….
Dan untuk “Cigala Bandel” Ulfah, Fika, Sherin, Zelin, Resi, Meutia,Erika, Nadia.
Sahabat ku ter segalanya yang selalu membuat ku tertawa tanpa memikirkan kesedihan setelahnya, Terima kasih atas support dan nasehat dari kalian semua walaupun raga kita jauh tapi hati kita tidak akan pernah jauh..
Dan untuk sahabat ku sedari kecil Dinda Imania yang selalu menemani walau dakat maupun jauh semoga kita kelak akan menjadi pribadi yang sukses dunia akhirat..
And for everyone who asks : “kapan kompre?” “kapan wisuda?” “kapan nyusul?” dan kapan kapan yang lainnya, kalian adalah alasanku segera menyelesaikan tugas akhir ini
Untuk ribuan tujuan yang harus dicapai, untuk jutaan impian yang akan dikejar, untuk sebuah pengharapan agar hidup lebih bermakna, hidup tanpa mimpi ibarat arus sungai,
mengalir tanpa tujuan,terus belajar, berusaha, dan berdoa untuk menggapainya, jatuh berdiri lagi, kalah mencoba lagi.
Gagal bangkit lagi sampai Allah SWT berkata “waktunya pulang”
By : Ulfa Rosiatul Huda
vi KATA PENGANTAR
Syukur alhamdulillah penulis ucapkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya. Sehingga penulis telah dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul “ISOLASI dan IDENTIFIKASI DENGAN GEN 16S rRNA BAKTERI ENDOFIT DAUN PEPAYA (Carica papaya L.) SERTA UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERINYA”. Skripsi ini merupakan salah satu persyaratan untuk menyelesaikan program pendidikan sarjana strata satu pada Universitas Perintis Indonesia
Dalam penulisan skripsi ini tidak terlepas dari iringan do’a tulus dan dukungan tiada hentinya yang diberikan oleh Ayahanda Eliyus Rawis, Ibunda Rosmiati serta keluarga besar yang sangat penulis sayangi, kasih sayang berserta do’a tulus ikhlas memberikan semangat dan dukungan yang tiada ternilai bagi penulis. Selain itu, penulis juga mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Bapak apt. Irwandi, M.Farm dan Ibu Epi Supri Wardi, M.Si selaku pembimbing yang dengan penuh perhatian dan kesabaran telah berkenan meluangkan waktu, memberikan petunjuk, ilmu, nasehat, arahan serta bimbingan selama penelitian dan penyusunan skripsi ini
2. Bapak H. Prof. Dr. apt. Elfi Sahlan Ben selaku Rektor Universitas Perintis Indonesia
vii 3. Ibu Dr. apt. Eka Fitrianda, M.Farm selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Perintis Indonesia
4. Ibu apt. Revi Yenti, M.Si selaku Ketua Prodi S1 Fakultas Farmasi Universitas Perintis Indonesia
5. Bapak apt. Yahdian Rasyadi, M.Farm selaku Pembimbing akademik, yang telah memberikan bimbingan dan arahan dalam kegiatan akademis penulis di Universitas Perintis Indonesia
6. Bapak/Ibu Dosen yang telah mendidik dan mencurahkan ilmu selama ini kepada penulis dan Staf Karyawan/karyawati serta analis labor Fakultas Farmasi Universitas Perintis Indonesia
Semoga Allah SWT membalas dan melimpahkan rahmat dan karunia-Nya kepada kita semua. Penulis berharap semoga skripsi ini menjadi sumbangan yang bernilai ilmu pengetahuan dan bermanfaat bagi kita semua. Kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan demi perbaikan penyempurnaan skripsi ini.
Akhirnya, hanya kepada Allah SWT penulis serahkan segalanya mudah-mudahan dapat bermanfaat khususnya bagi penulis dan umumnya bagi kita semua.
Padang, 15 September 2020
Penulis
viii ABSTRAK
Bakteri endofit merupakan bakteri yang mampu menghasilkan senyawa- senyawa bioaktif yang sama dengan tanaman inangnya, salah satunya senyawa antimikroba. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan menguji aktivitas antibakteri bakteri endofit dari daun pepaya terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli, serta melakukan identifikasi secara molekuler menggunakan gen 16S rRNA terhadap bakteri endofit yang memiliki daya antibakteri terbesar.
Jumlah bakteri endofit yang berhasil diisolasi dengan metode penanaman didapatkan 6 isolat yaitu 2 isolat dari daun pucuk (DP), 1 isolat dari daun muda (DM) dan 3 isolat dari daun tua (DT). Hasil pemurnian dengan metode Streak plate diperoleh 3 isolat dari masing-masing hasil isolasi. Hasil pengujian aktivitas antibakteri dilakukan pada isolat yang telah dimurnikan dengan metode Kirby-Bauer yang menunjukkan bahwa masing-masing isolat memiliki aktivitas penghambatan terhadap bakteri uji Escherichia coli yaitu: DP (8,45 mm), DM (8,75 mm) dan DT (8,6 mm) yang seluruhnya tergolong kategori lemah. Sedangkan terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus tidak memiliki aktivitas antibakteri. Hasil identifikasi molekuler dengan gen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat bakteri DM homolog 98% dengan Bacillus cereus. Sehingga dapat disimpulkan bahwa terdapat 3 isolat murni bakteri endofit yang dilakukan uji aktivitas antibakteri, isolat yang memiliki aktivitas antibakteri terbesar yaitu isolat DM yang merupakan spesies dari Bacillus cereus.
Kata kunci : Bakteri Endofit, Antibakteri, Identifkasi molekuler
ix ABSTRACT
Endophytic bacteria is bacteria that is capable of producing the same bioactive compounds as their host plants, such an antimicrobial compound. This study aimed to isolate and test the antibacterial activity of endophytic bacteria from papaya leaves toward Staphylococcus aureus and Escherichia coli, and to identify the bacteria molecularly using 16S rRNA gene that have the greatest antibacterial activity. The number of endophytic bacteria isolated by the planting method was obtained 6 isolates, 2 isolates from shoot leaves (SL), 1 isolate from young leaves (YL) and 3 isolates from old leaves (OL). The purification results using the Streak plate method obtained 3 isolates from each of the isolates. The results of antibacterial activity testing is done on the isolates which was already purified by Kirby-Bauer method that showed each isolate had inhibitory activity against the test Escherichia coli bacteria, such as: SL (8.45 mm), YL (8.75 mm) and OL (8.6 mm), all of them were classified as weak. Meanwhile, bacterial testing, Staphylococcus aureus, is classified as no antibacterial activity. The results of molecular identification with the 16S rRNA gene showed that 98% homologous YL bacterial isolates with Bacillus cereus. In conclusion, there were 3 pure isolates of endophytic bacteria that were tested for antibacterial activity, the isolate that had the greatest antibacterial activity, such as YL isolate which is a species of Bacillus cereus.
Keywords: Endophytic Bacteria, Antibacterial, Molecular Identification
x DAFTAR ISI
JUDUL ... Error! Bookmark not defined.
PERNYATAAN ORISINILITAS DAN PENYERAHAN HAK CIPTA ...Error!
Bookmark not defined.
LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI ... Error! Bookmark not defined.
LEMBAR PERSEMBAHAN ... iv
KATA PENGANTAR ... vi
ABSTRAK ... viii
ABSTRACT ... ix
DAFTAR ISI ... x
DAFTAR TABEL ... xii
DAFTAR GAMBAR ... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ... xv BAB I. PENDAHULUAN ... Error! Bookmark not defined.
1.1 Latar Belakang ... Error! Bookmark not defined.
1.2 Rumusan Masalah ... Error! Bookmark not defined.
1.3 Tujuan Penelitian... Error! Bookmark not defined.
1.4 Manfaat Penelitian ... Error! Bookmark not defined.
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ... Error! Bookmark not defined.
2.1 Daun pepaya (Carica papaya L.) ... Error! Bookmark not defined.
2.1.1 Klasifikasi ... Error! Bookmark not defined.
2.1.2 Morfologi ... Error! Bookmark not defined.
2.1.3 Kandungan Kimia Daun PepayaError! Bookmark not defined.
2.1.4 Manfaat Daun Pepaya ... Error! Bookmark not defined.
2.2 Bakteri Endofit ... Error! Bookmark not defined.
2.3 Bakteri Uji... Error! Bookmark not defined.
2.3.1 Staphylococcus aureus ... Error! Bookmark not defined.
2.3.2 Escherichia coli ... Error! Bookmark not defined.
2.4 Metode Pengujian Antibakteri ... Error! Bookmark not defined.
2.5 PCR ( Polymerase Chain Reaction ) Error! Bookmark not defined.
2.5.1 Komponen Dalam PCR ... Error! Bookmark not defined.
xi 2.5.2 Tahapan – tahapan PCR ... Error! Bookmark not defined.
2.5.3 Identifikasi PCR 16S rRNA .. Error! Bookmark not defined.
2.6 Elektroforesis ... Error! Bookmark not defined.
2.7 Sekuensing gen 16S rRNA ... Error! Bookmark not defined.
BAB III. METODE PENELITIAN ... Error! Bookmark not defined.
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ... Error! Bookmark not defined.
3.2. Alat dan Bahan ... Error! Bookmark not defined.
3.2.1 Alat ... Error! Bookmark not defined.
3.2.2 Bahan ... Error! Bookmark not defined.
3.3 Prosedur dan Cara Kerja ... Error! Bookmark not defined.
3.3.1 Pengambilan dan Identifikasi Sampel.... Error! Bookmark not defined.
3.3.2 Sterilisasi Alat dan Pembuatan Media ... Error! Bookmark not defined.
3.3.3 Isolasi dan Purifikasi Bakteri Endofit Daun Pepaya ... Error!
Bookmark not defined.
3.3.4 Identifikasi Morfologi Isolat Bakteri EndofitError! Bookmark not defined.
3.3.5 Uji Aktivitas Antibakteri ... Error! Bookmark not defined.
3.3.6 Identifikasi Bakteri Endofit Terpilih Secara Molekuler Error!
Bookmark not defined.
3.4 Teknik Pengolahan dan Analisa Data Error! Bookmark not defined.
BAB 1V. HASIL DAN PEMBAHASAN ... Error! Bookmark not defined.
4.1 Hasil ... Error! Bookmark not defined.
4.2 Pembahasan ... Error! Bookmark not defined.
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... Error! Bookmark not defined.
5.1 Kesimpulan ... Error! Bookmark not defined.
5.2 Saran ... Error! Bookmark not defined.
DAFTAR PUSTAKA ... Error! Bookmark not defined.
LAMPIRAN ... Error! Bookmark not defined.
xii DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 1. Klasifikasi Respon Hambatan Mikroba... Error! Bookmark not defined.
Tabel 2. Komponen dan campuran untuk primer 16S rRNA dan DNA sampelError!
Bookmark not defined.
Tabel 3. Keterangan Primer... Error! Bookmark not defined.
Tabel 4. Siklus mesin PCR ... Error! Bookmark not defined.
Tabel 5. Hasil Pengamatan Bakteri Berdasarkan Pewarnaan GramError! Bookmark not defined.
Tabel 6. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Bakteri Endofit Daun PepayaError!
Bookmark not defined.
Tabel 7. Hasil Identifikasi Morfologi Pewarnaan Gram Bakteri Endofit Daun Pepaya (Carica papaya L.) ... Error! Bookmark not defined.
Tabel 8. Hasil Pengujian Pewarnaan Gram Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli... Error! Bookmark not defined.
xiii DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1. Tanaman Pepaya ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 2. Staphylococcus aureus ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 3. Escherichia coli pembesaran 1000x . Error! Bookmark not defined.
Gambar 4. Siklus PCR ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 5. Aktivitas Antibakteri Bakteri Endofit Daun Pepaya terhadap Bakteri Escherichia coli ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 6. Hasil Elektoforesis dari Produk Amplifikasi Gen 16S rRNA. .. Error!
Bookmark not defined.
xiv Gambar 7. Hasil Analisis BLAST dari Isolat Bakteri Endofit DM ... Error!
Bookmark not defined.
Gambar 8. Daun Pepaya (Carica papaya L.) ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 9. Surat Identifikasi Tumbuhan Daun Pepaya (Carica papaya L.)Error!
Bookmark not defined.
Gambar 10. Inkubator ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 11. Oven ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 12. Autoklaf ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 13. Sentrifugasi... Error! Bookmark not defined.
Gambar 14. PCR ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 15. Alat elekroforesis ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 16. Skema Kerja Isolasi Bakteri Endofit Daun Pepaya Error! Bookmark not defined.
Gambar 17. Skema Kerja Uji Aktivitas Antibakteri dari Bakteri Endofit .... Error!
Bookmark not defined.
Gambar 18. Skema Kerja Identifikasi Bakteri Endofit TerpilihError! Bookmark not defined.
Gambar 19. Hasil Isolasi Bakteri Endofit Daun Pucuk Pepaya (DP) ... Error!
Bookmark not defined.
Gambar 20. Hasil Isolasi Bakteri Endofit Daun Muda Pepaya (DM) ... Error!
Bookmark not defined.
Gambar 21. Hasil Isolasi Bakteri Endofit Daun Tua Pepaya (DT)Error! Bookmark not defined.
Gambar 22. Hasil pemurnian Bakteri Endofit Pucuk Daun Pepaya ... Error!
Bookmark not defined.
Gambar 23. Hasil pemurnian Bakteri Endofit Daun Muda PepayaError! Bookmark not defined.
Gambar 24. Hasil pemurnian Bakteri Endofit Daun Tua PepayaError! Bookmark not defined.
Gambar 25. Pewarnaan Gram Bakteri Endofit Daun PepayaError! Bookmark not defined.
Gambar 26. Sertifikat Bakteri Uji Stapylococcus aureus ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 27. Sertifikat Bakteri Uji Escherichia coliError! Bookmark not defined.
Gambar 28. Hasil Pengujian Pewarnaan Gram Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 29. Aktivitas Antibakteri Bakteri Endofit Daun Pepaya terhadap Bakteri Escherichia coli ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 30. Aktivitas Antibakteri Bakteri Endofit Daun Pepaya terhadap Bakteri Staphylococcus aureus ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 31. Hasil Urutan Basa Nukelotida Isolat Bakteri Endofit DM. Hasil Sequensing ... Error! Bookmark not defined.
xv DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Tumbuhan Pepaya (Carica papaya L)Error! Bookmark not defined.
Lampiran 2. Surat Identifikasi Tanaman Pepaya (Carica papaya L) ... Error!
Bookmark not defined.
Lampiran 3. Alat-alat penelitian ... Error! Bookmark not defined.
Lampiran 4. Skema Kerja... Error! Bookmark not defined.
Lampiran 5. Hasil Isolasi dan Purifikasi Bakteri Endofit Daun Pepaya ... Error!
Bookmark not defined.
Lampiran 6. Hasil Pemurnian Bakteri Endofit Daun papayaError! Bookmark not defined.
Lampiran 7. Hasil Identifikasi Morfologi Pewarnaan Gram Bakteri Endofit Daun Pepaya (Carica papaya L) ... Error! Bookmark not defined.
Lampiran 8. Sertifikat Bakteri Uji Stapylococcus aureus ... Error! Bookmark not defined.
Lampiran 9. Surat Identifikasi Bakteri Uji Escherichia coliError! Bookmark not defined.
xvi Lampiran 10.Hasil Pengujian Pewarnaan Gram Bakteri Staphylococcus aureus dan
Escherichia coli ... Error! Bookmark not defined.
Lampiran 11.Uji Aktivitas Antibakteri Bakteri Endofit Daun Pepaya ... Error!
Bookmark not defined.
Lampiran 12. Urutan Basa Nukelotida Isolat Bakteri Endofit DM. Hasil Sequensing ... Error! Bookmark not defined.
1 BAB I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Indonesia merupakan negara yang berada di kawasan tropis dengan beragam tumbuhan obat yang dimilikinya. Keberagaman jenis tumbuhan yang ada merupakan sumber kekayaan yang sangat berharga. Berbagai jenis tanaman obat diketahui mengandung senyawa-senyawa bioaktif yang potensial untuk dikembangkan. Salah satu jenis tanaman yang digunakan sebagai obat adalah Tanaman Pepaya (Carica papaya L.) (Sudarwati, 2018)
Pepaya merupakan salah satu tanaman perdu yang berbatang tegak dan basah, hampir semua bagian tanaman pepaya dapat dimanfaatkan, bagian tanaman yang sering digunakan sebagai obat adalah daunnya. Daun Pepaya diketahui memiliki kandungan senyawa kimia yang bersifat antiinflamasi, antiseptik, antifungal dan antibakteri. Senyawa antibakteri yang terdapat dalam daun papaya diantaranya adalah tanin, alkaloid, flavanoid, terpenoid, dan saponin (Duke, 2009)
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Tuntun (2016) menyatakan bahwa ektrak daun pepaya dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Pada umumnya pemanfaatan senyawa bioaktif dari suatu tanaman obat diperoleh dengan cara mengekstrak bagian dari tanaman tersebut tetapi cara ini kurang efektif karena membutuhkan banyak jumlah bagian dari tanaman untuk di ekstrak sehingga jika diambil secara terus menerus ketersedian tanaman di lingkungan akan menurun (Kusumawati, 2014). Adapun cara yang lebih efektif untuk memperoleh senyawa bioaktif dari tanaman tersebut adalah dengan memanfaatkan bakteri endofit.
2 Bakteri endofit merupakan mikroorganisme yang terdapat di permukaan jaringan sifatnya tidak berbahaya bagi tumbuhan dan tidak merugikan tanaman inangnya. Bakteri endofit dapat hidup didalam jaringan akar, batang dan daun yang memiliki ukuran mikroskopis (Prihatiningtias dkk, 2006) Bakteri endofit bersifat simbiosis mutualisme atau saling menguntungkan dimana bakteri endofit memanfaatkan nutrisi dari hasil metabolisme tanaman yang ditumpanginya untuk hidup (Strobel dan Daisy, 2003)
Bakteri endofit mampu menghasilkan senyawa bioaktif yang sama dengan tanaman inangnya. Besar kemungkinan bakteri endofit yang menetap di tanaman tersebut memiliki kemampuan mensintesis senyawa antibakteri yang sama dengan tanaman inangnya. Interaksi antara bakteri endofit dengan tanaman inangnya melibatkan transfer materi genetik (Sepriana, 2017).
Keuntungan lain yang diperoleh dari pengembangan bakteri endofit penghasil antibakteri adalah dapat menjaga kelestarian tumbuhan terutama tumbuhan langka agar tidak di eksploitasi secara terus menerus yang akhirnya akan mengakibatkan kepunahan (Prihaningtyas, 2006). Dengan berkembangnya identifikasi mikroorganisme maka saat ini identifikasi bakteri endofit dapat dilakukan dengan metode berbasis molekuler dengan menggunakan gen 16S rRNA
Berdasarkan penjelasan diatas maka penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengisolasi bakteri endofit dari daun pepaya dan mengetahui aktivitas antibakteri yang dimilikinya, serta dilakukan identifikasi secara molekuler terhadap bakteri endofit yang memiliki aktivitas antibakteri serbesar dengan
3 menggunakan gen 16S rRNA dengan alat PCR Polimerase Chain Reaction) agar dapat diketahui spesies dari bakteri endofit daun papaya.
1.2 Rumusan Masalah
1. Apakah bakteri endofit dari daun pepaya (Carica papaya L.) dapat diisolasi ?
2. Apakah bakteri endofit dari daun pepaya (Carica papaya L.) memiliki aktivitas antibakteri serta dapat diidentifikasi secara molekuler ?
1.3 Tujuan Penelitian
1. Untuk mengisolasi bakteri endofit dari daun pepaya (Carica papaya L.) 2. Untuk menguji aktivitas antibakteri dari bakteri endofit daun pepaya
(Carica papaya L.) serta mengidentifikasi secara molekuler 1.4 Manfaat Penelitian
1. Memberikan informasi tentang bakteri endofit yang diisolasi dari daun pepaya (Carica papaya L.)
2. Memberikan informasi tentang bakteri endofit yang memiliki aktivitas antibakteri dari daun pepaya (Carica papaya L.) serta dapat diidentifikasi secara molekuler.
4 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Daun pepaya (Carica papaya L.) 2.1.1 Klasifikasi
Klasifikasi tanaman pepaya adalah sebagai berikut (Yuniarti, 2008) : Regnum : Plantae
Divisi : Spermatophyta Class : Dicotyledoneae Ordo : Cistales
Family : Caricaceae Genus : Carica
Species : Carica Papaya L.
Gambar 1. Tanaman Pepaya (Sumber: Dokumentasi pribadi, 2019) 2.1.2 Morfologi
Daun (folium) merupakan tumbuhan yang penting dan umumnya tiap tumbuhan mempunyai sejumlah besar daun. Menurut Yuniarti (2008) daun pepaya merupakan daun tunggal, berukuran besar, menjari, bergerigi dan juga mempunyai bagian-bagian tangkai daun dan helaian daun (lamina). Daun pepaya
5 mempunyai bangun bulat atau bundar, ujung daun yang lancip, tangkai duan panjang dan berongga, permukaan daun licin sedikit mengkilat, dan memiliki susunan tulang daun yang berbentuk menjari.
2.1.3 Kandungan Kimia Daun Pepaya
Daun pepaya mengandung enzim papain, alkaloid, karparin, pseudokarpin, glikosida, karposida, dan saponin (Latief, 2012). Daun pepaya juga mengandung senyawa lain seperti saponin, flavonoid dan tanin (Krishna dkk, 2008). Senyawa tersebut merupakan senyawa hasil metabolit sekunder yang banyak dihasilkan oleh tanaman. Senyawa flavonoid berperan sebagai antibiotik dengan mengganggu mikroorganisme seperti fungi. Senyawa alkaloid berfungsi menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan gram negatif. Saponin berperan dalam proses pencernaan dengan cara meningkatkan permeabilitas dinding sel pada usus dan meningkatkan penyerapan zat makanan (Hasiib dkk, 2015). Papain adalah suatu senyawa yang membantu proses pencernaan alami yang efektif memecah protein dan membersihkan saluran pencernaan.
2.1.4 Manfaat Daun Pepaya
Daun papaya dapat digunakan untuk mengobati demam berdarah, menghambat pertumbuhan sel kanker dan sebagai antimalaria. Daun pepaya juga digunakan untuk membantu pencernaan dan penyerapan protein pada saluran pencernaan. Rasa pahit pada daun pepaya dapat merangsang nafsu makan, biji pepaya berkhasiat antelmintik. Pepaya memiliki banyak kegunaan untuk pengobatan penyakit secara alamiah, ada beberapa kegunaan dan ramuan yang mengandung pepaya seperti pengobatan pada flu, cacing gelang, menambah nafsu makan, mencegah demam nifas, melancarkan buang air besar, hipertensi,
6 sariawan, keputihan, diare, jerawat, luka bakar, tumit pecah-pecah, kutil, sakit gigi, melancarkan ASI, digigit serangga berbisa dan luka bakar (Latief, 2012).
2.2 Bakteri Endofit
Bakteri endofit adalah organisme hidup yang berukuran mikroskopis (bakteri dan jamur) yang hidup di dalam jaringan tanaman (xylem dan phloem), daun, akar, buah, dan batang. Bakteri dan fungi merupakan jenis mikroba yang umum ditemukan sebagai mikroba endofit, akan tetapi yang banyak diisolasi adalah golongan fungi. Hubungan antara mikroba endofit dan inangnya dapat berbentuk simbiosis mutualisme sampai hubungan yang patogenik (Simarmata dkk, 2007).
Hubungan simbiosis mutualisme ditandai dengan adanya sifat saling menguntungkan antara bakteri endofit dengan inangya, Mikroba endofit memproduksi senyawa yang berfungsi untuk melindungi jaringan tumbuhan tanpa menyebabkan kerusakan dan penyakit serta serangan mikroorganisme yang bersifat patogen bagi inangnya. Sedangkan jaringan tumbuhan akan menyediakan kebutuhan nutrisi bagi mikroba endofit agar dapat tetap hidup (Radji, 2005).
Semua tanaman vaskular hampir mempunyai bakteri endofit. Bakteri endofit telah disepakati sebagai mikroba yang dapat hidup di dalam jaringan tanaman dengan membentuk koloni dalam jaringan yang hidup tanpa menyebabkan efek negatif langsung yang nyata. Bakteri endofit dapat diisolasi dari bagian bunga, buah, daun, batang, akar, dan benih. Bakteri menembus jaringan tanaman di akar, stomata atau pada bagian tanaman yang luka. Pemanfaatan mikroba endofit belum sebanyak mikroba yang ada di alam bebas. Beberapa potensi mikroba endofit sudah diketahui di antaranya adalah menghasilkan antimikroba Xanthomonas campestris, Pseudomonas solanacearum, Colletrotricum gloeosporioides,
7 Fusarium oxysporum cubense, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Candida albicans, Stapyloccccus aureus.
Menurut Stobel and Daisy (2003) lebih dari 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi ini memiliki tanaman yang masing-masing tanaman mengandung satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri dari fungi dan bakteri.
Bakteri dan fungi tersebut dapat menghasilkan senyawa metabolit yang dapat berfungsi sebagai antibiotika, antivirus, antikanker, antidiabetes, antimalaria, antioksidan, anti immunosupresif, antiserangga, zat pengatur tumbuh dan penghasil enzim-enzim hidrolitik seperti amilase, selulase, xilanase, ligninase dan kitinase. Manfaat dari endofit lainnya juga dapat menghasilkan zat pengatur tumbuh IAA (Indol Acetic Acid) dan berperan juga dalam fiksasi nitrogen (N2 ) pada beberapa tanaman
Bakteri endofit memberikan kontribusi pada pertumbuhan tanaman inang dengan memproduksi zat pengatur tumbuh tanaman, meningkatkan induksi resistensi tanaman inang terhadap patogen dan parasit, membantu fiksasi nitrogen, dan menghasilkan antibiotik. Endofit dapat melindungi tanaman dengan melawan patogen melalui mekanisme induksi pertahanan tanaman, sekresi zat yang bersifat antagonis terhadap patogen atau melalui kompetisi untuk memperoleh nutrisi dan ruang untuk melakukan kolonisasi (Hurek dkk. 2011).
Mikroba endofit dapat menghasilkan senyawa-senyawa bioaktif yang sangat potensial untuk dikembangkan menjadi obat. Mikroba endofit memiliki potensi yang besar dalam pencarian sumber-sumber obat baru. Hal ini karena mikrobia merupakan organisme yang mudah ditumbuhkan, memiliki siklus hidup yang
8 pendek dan dapat menghasilkan jumlah senyawa bioaktif dalam jumlah besar dengan metode fermentasi.
2.3 Bakteri Uji
2.3.1 Staphylococcus aureus a. Klasifikasi
Menurut Brooks GF et al (2013) klasifikasi Staphylococcus aureus sebagai berikut :
Kingdom : Monera Divisi : Protophyta Kelas : Schizomycetes Ordo : Eubacteriales Family : Micrococcaceae Genus : Staphylococcus Spesies : Staphylococcus aureus
Gambar 2.Staphylococcus aureus (Brooks GF et al, 2013)
Staphylococcus adalah suatu nama marga dari bakteri yang berbentuk bulat (coccus), hidup secara berkoloni tak beraturan yang menyerupai buah anggur dan
9 memiliki sifat katalase yang membedakannya dengan genus Streptococcus.
Staphylococcus terbagi menjadi 32 spesies berdasarkan komposisi DNA, namun hanya 14 spesies yang hidup pada tubuh manusia. Staphylococcus aureus merupakan satu-satunya spesies yang menghasilkan enzim koagulase dan membedakannya dengan 14 spesies lainnya (Brooks GF et al, 2013).
b. Morfologi
Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram Positif berbentuk bulat berdiameter 0,7-1,2 μm, tersusun dalam kelompok yang tidak teratur seperti buah anggur, fakultatif anaerob, tidak membentuk spora, dan tidak bergerak.
Berdasarkan bakteri yang tidak membentuk spora, maka Staphylococcus aureus termasuk jenis bakteri yang paling kuat daya tahannya. Dalam keadaan kering pada benang, kertas, kain dan dalam nanah dapat tetap hidup selama 6-14 minggu (Syahrurahman et al., 2010).
2.3.2 Escherichia coli a. Klasifikasi
Menurut Jawetz et al, 2008, klasifikasi taksonomi Escherichia coli sebagai berikut:
Kingdom : Bacteria Divisi : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria Ordo : Enterobacteriales Famili : Enterobacteriaceae Genus : Escherichia Spesies : Escherichia coli
10 Gambar 3. Escherichia coli pembesaran 1000x (Brooks et al., 2013) Struktur dinding sel bakteri Gram negatif relatif lebih kompleks tersusun atas tiga lapisan yakni lapisan luar yang berupa lipoprotein, lapisan tengah berupa lipopolisakarida dan lapisan dalam berupa peptidoglikan. Peptidoglikan yang terkandung dalam bakteri Gram negatif memiliki struktur lebih kompleks dibandingkan Gram positif. Membran luarnya terdiri dari lipid, liposakarida, dan protein. Membran luar bakteri Gram negatif berhubungan dengan lingkungan termasuk pada pejamu manusia. Variasi pada membran luar inilah yang menyebabkan terdapatnya perbedaan sifat patogenitas dan resistensi antibiotik (Hendrayati, 2012)
b. Morfologi
Escherichia coli merupakan bagian famili Enterobacteriaceae, berbentuk batang pendek (coccobasil), Gram negatif, ukuran 0,4-0,7 µm x 1,4 µm, beberapa strain memiliki kapsul dan tidak membentuk spora serta bersifat anaerob fakultatif, kebanyakan bersifat motil (dapat bergerak) dengan menggunakan flagella (Brooks et al., 2013). Escherichia coli dapat tumbuh di media manapun.
Sebagian besar strain Escherichia coli bersifat mikroaerofilik yaitu butuh oksigen namun tanpa oksigen masih dapat hidup. Beberapa strain lainnya bersifat
11 hemolisis sehingga ketika ditanam di media agar darah akan terlihat hemolisis ß (hemolisis total) sedangkan jika ditanam di media Eosin Methylen Blue (EMB) akan tampak warna yang khas yaitu hijau metalik dan akan terlihat koloni berwarna kilat logam jika ditanam dalam media Endo Agar
2.4 Metode Pengujian Antibakteri
Metode pengujian aktivitas antibakteri menurut Pratiwi (2008) sebagai berikut:
1. Metode Difusi
Metode difusi ini dibagi atas :
a. Disc diffusion method (Metode Kirby Bauer)
Metode ini digunakan untuk menentukan aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media agar.
b. E-test/Epsilometer method
Metode ini digunakan untuk mengestimasi MIC (Minimum Inhibitory Concentration) atau KHM (Kadar Hambat Minimum), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme.
Pada metode ini digunakan strip plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah dan tertinggi dan diletakkan pada permukaan media agar yang telah ditanami mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang menunjukkan agen antimikroba yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar
12 c. Ditch plate technique
Sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan pada parit dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji (maksimum 6 macam) digoreskan pada parit yang berisi agen antimikroba
d. Cup plate technique
Metode ini serupa dengan metode dis diffusion, dimana dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang diuji
2. Metode Dilusi
a. Metode dilusi cair /broth dilution test
Metode ini mengukur MIC atau KHM, dan MBC (Minimum Bactericidal Concentration atau Kadar Bunuh Minimum/KBM). Cara yang dilakukan adalah membuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM.
b. Metode dilusi padat/ solid dilution test
Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.
13 Tabel 1. Klasifikasi Respon Hambatan Mikroba
Diameter Zona Hambat (mm) Respon Hambatan Pertumbuhan
≤14 Lemah
15-18 Sedang
≥19 Kuat
Sumber :Clinical and Labolatory Standart Institude (CLSI) ; 2013 2.5 PCR ( Polymerase Chain Reaction )
Polimer Chain Reaction (PCR) adalah suatu metoda enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis. Amplimers adalah amplifikasi DNA pada PCR yang dapat dicapai bila menggunakan primer oligonukeotida, primer DNA suatu sekuens oligonukelotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA (Mahardika, 2005).
Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan di amplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi
14 polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA cetakan (Ahyar, 2014).
2.5.1 Komponen Dalam PCR
Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah templat DNA; sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat;
dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA. Untuk melakukan proses PCR diperlukan komponen-komponen seperti yang telah disebutkan di atas. Pada bagian ini akan dijelaskan secara rinci kegunaan dari masing-masing komponen tersebut yaitu:
1. Template DNA
Template DNA adalah molekul DNA untai ganda yang mengandung sekuen target yang akan diamplifikasi. Ukuran DNA bukan merupakan faktor utama keberhasilan PCR, berapapun panjangnya jika tidak mengandung sekuen yang diinginkan maka tidak akan berhasil proses suatu PCR, namun sebaliknya jika ukuran DNA tidak terlalu panjang tapi mengandung sekuen yang diinginkan maka PCR akan berhasil
Konsentrasi DNA juga dapat mempengaruhi keberhasilan PCR. Jika konsentrasinya terlalu rendah maka primer mungkin tidak dapat menemukan target dan jika konsentrasi terlalu tinggi akan meningkatkan kemungkinan mispriming. Disamping itu perlu diperhatikan kemurnian template karena akan mempengaruhi hasil reaksi (Handoyo and Rudiretna, 2001)
15 2. Primer
Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang digunakan. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (- OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan urutan DNA yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari database GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju belum diketahui maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungankekerabatan yang terdekat
Panjang primer berkisar antara 20-30 basa. Konsentrasi primer biasanya optimal pada 0,1-0,5 M. Konsentrasi primer yang terlalu tinggi akan menyebabkan mispriming (penempelan pada tempat yang tidak spesifik) dan akumulasi produk non spesifik serta meningkatkan kemungkinan terbentuk primer-dimer, sebaliknya bila konsentrasi primer terlalu sedikit maka PCR menjadi tidak efisien sehingga hasilnya rendah (Handoyo and Rudiretna, 2001)
3. Enzim DNA Polimerase
Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95oC. Aktivitas polimerase DNA bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi. Sebagai contoh adalah enzim Pfu polimerase
16 (diisolasi dari bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas spesifik 10x lebih kuat dibandingkan aktivitas spesifik enzim Taq polimerase (diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus). Penggunaan jenis polimerase DNA berkaitan erat dengan buffer PCR yang dipakai. Dengan menggunakan teknik PCR, panjang fragmen DNA yang dapat diamplifikasi mencapai 35 kilo basa. Amplifikasi fragmen DNA pendek (kurang dari tiga kilo basa) relatif lebih mudah dilakukan.
Untuk mengamplifikasi fragmen DNA panjang (lebih besar dari tiga kilo basa) memerlukan beberapa kondisi khusus, di antaranya adalah diperlukan polimerase DNA dengan aktivitas yang kuat dan juga buffer PCR dengan pH dan kapasitas tinggi (High-salt buffer) (Handoyo and Rudiretna, 2001)
4. Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP)
Deoxynucleotide Triphosphate merupakan material utama untuk sintesis DNA dalam proses PCR yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP.
Konsentrasi dNTP masing-masing sebesar 20-200 M dapat menghasilkan keseimbangan optimal antara hasil, spesifitas dan ketepatan PCR. Konsentrasi masing-masing dNTP harus seimbang untuk meminimalkan kesalahan penggabungan. Deoxynucleotide Triphosphate akan menurunkan Mg2+ bebas sehingga mempengaruhi aktivitas polimerase dan menurunkan annealing primer.
Konsentrasi dNTP yang rendah akan meminimalkan mispriming pada daerah non target dan menurunkan kemungkinan perpanjangan nukleotida yang salah. Oleh karena itu spesifitas dan ketepatan PCR meningkat pada konsentrasi dNTP yang lebih rendah (Handoyo and Rudiretna, 2001)
5. Larutan Buffer
Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh
17 karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara). Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2 berpengaruh pada spesifisitas dan perolehan proses. Umumnya buffer PCR sudah mengandung senyawa MgCl2 yang diperlukan. Tetapi disarankan sebaiknya antara MgCl2 dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat dengan mudah dilakukan variasi konsentrasi MgCl2 sesuai yang diperlukan (Handoyo and Rudiretna, 2001)
2.5.2 Tahapan – tahapan PCR
Menurut (Eliwati, 2015). Proses PCR terdiri dari tiga tahapan, yaitu denaturasi DNA templat, penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA. Denaturasi merupakan proses pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang menjadi cetakan (templat) sebagai tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA polimerase, dengan pemanasan singkat pada suhu 90-95°C selama beberapa menit. Penjelasan ringkas tentang setiap siklus reaksi PCR adalah sebagai berikut:
1. Denaturasi
Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen.Pada
18 tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya.Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90oC – 95oC.
2. Penempelan Primer
Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada templat. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50oC – 60oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya misalnya pada 72oC, namun suhu yang biasa dilakukan pada proses ini adalah antara 50oC – 60oC.
3. Reaksi Polimerisasi (Extension)
Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3‟nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase. Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan di amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada
19 ujung 3‟ dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5‟-nya.Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler.
Gambar 4. Siklus PCR (Gaffar, 2007)
Reaksi- reaksi dari tahapan PCR tersebut harus diulangi hingga 25-30 kali siklus sehingga pada akhir siklus akan diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang merupakan hasil dari polimerasi dalam jumlah yang banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyak siklus pada amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi.
Elektroforesis gel agarosa digunakan dalam produk DNA untuk mengidentifikasi melalui ukurannya, metode ini dilakukan dengan menginjeksi DNA kedalam gel agarosa dan menyatukan gel tersebut dengan listrik. Hasilnya untai DNA kecil akan berpindah dengan cepat ke untai DNA yang besar diantara gel yang menunjukkan hasil positif.
Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi karena efesiensi, keakuratan dan spesifitasnya. Keakuratan tinggi karena DNA polymerase mampu menghindari
20 kesalahan pada amplifikasi produk, dan spefifitasnya terdapat pada kemampuannya mengamplifikasi sehingga menghasilkan produk yang memalui sejumlah siklus. Selain itu metode PCR memiliki kelebihan yang diperoleh dari pelipat gandaan suatu fragmen DNA sebesar 200.000 kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 22 menit dengan menggunakan komponen dalam jumlah yang lebih sedikit, DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5 ug oligonukleotida yang diperlukan hanya 1 mM dari reaksi ini. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipat gandakan suatu sekuan DNA dalam genom bakteri hanya dengan mencampurkan kultur baktri dalam tabung PCR.
2.5.3 Identifikasi PCR 16S rRNA
Analisis terhadap gen penyandi 16S rRNA dapat digunakan untuk identifikasi filogenitas bakteri. Analisis ini memiliki beberapa keuntungan di antaranya yaitu RNA umumnya dimiliki oleh semua bakteri, tidak terlalu cepat mengalami perubahan, merupakan target yang sensitif karena dalam sel aktif tersedia dalam jumlah yang banyak. Jika sekuen nukleotida dari gen 16S rRNA antara dua tipe organisme yang mirip atau memiliki sedikit perbedaan basa dalam rRNA, maka ditinjau dari kedekatan secara evolusinya kemungkinan dua organisme tersebut memiliki kekerabatan yang dekat.
Metode baru yang digunakan untuk identifikasi gen penyandi 16S rRNA yaitu dengan bantuan Polymerase Chain Reaction (PCR). Keuntungan dari teknik PCR ini yaitu lebih cepat, sedikit bahan yang digunakan, dan lebih praktis digunakan untuk penelitian daripada sekuensing RNA secara langsung. Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen rRNA dengan teknik PCR ini adalah
21 primer komplemen yang diproduksi secara sintetik (Dinnur, 2013).
Primer universal 16S rRNA merupakan suatu jenis RNA yang digunakan untuk produksi protein. Gen 16S rRNA berupa polinukleotida besar yang berukuran 1500- 2000 pasangan basa dan merupakan bagian dari subunit kecil dari ribosom serta penting dalam proses translasi. Teknik RNA ribosomal merupakan teknik yang paling sering digunakan sebagai penanda molekuler.
Sekuen gen 16S rRNA dapat digunakan untuk identifikasi bakteri yang mengalami penyimpangan strain fenotip (Dinnur, 2013).
2.6 Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Gaffar, 2007). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya.
Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel.
Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak
22 melalui matriks tersebut.Perangkat elektroforesis yang digunakan dalam elektroforesis meliputi sumber arus listrik searah (DC), ruang untuk elektroforesis (Comb, Well, platform dan cetakan wadah gel), larutan buffer (buffer ionik dan loading buffer), matriks elektroforesis, marker dan gel.
Elektroforesis gel didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyanggah matriks stabil dibawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 bp dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis akrilamid dapat memisahkan 1 bp dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA atau sekuensing (Gaffar, 2007).
Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing- masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu (Sambrook dan Russel, 2001).
Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel.
Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan
23 kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut (Muladno, 2010).
DNA dicampurkan dengan loading dye sebelum proses elektroforesis. Loading dye terdiri dari glycerol, bromphenol blue, dan xylene cyanol FF. Glycerol berfungsi sebagai pemberat sehingga DNA berada di bawah sumuran, sedangkan bromphenol blue dan xylene cyanol FF berfungsi sebagai visualisasi pada gel sehingga proses migrasi DNA pada saat berlangsungnya elektroforesis tidak melebih batas gel (Carson, 2006). Sumur-sumur dalam gel agarosa berfungsi untuk meletakkan larutan DNA yang bermuatan negatif. Arus listrik dialirkan dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai, maka DNA akan bergerak menuju kutub positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Kecepatan migrasi DNA ditentukan oleh beberapa faktor di antaranya (Muladno, 2010):
1. Migrasi molekul DNA berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.
2. Migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi lebih rendah lebih cepat daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel berkonsentrasi tinggi. Oleh karena itu, penentuan konsentrasi agarosa dalam membuat gel harus memperhatikan ukuran molekul DNA yang akan dianalisis.
3. Konformasi atau bentuk rangkaian molekul DNA berukuran sama akan bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda.
24 4. Kecepatan migrasi DNA sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. Akan tetapi apabila penggunaan voltase dinaikkan, mobilitas molekul DNA meningkat secara tajam. Ini mengakibatkan pemisahan molekul DNA di dalam gel menurun dengan meningkatnya voltase yang digunakan. Penggunaan voltase yang ideal untuk mendapatkan separasi molekul DNA berukuran lebih besar 2 kb adalah tidak lebih dari 5 Volt per cm.
5. Keberadaan etidium bromida di dalam gel mengakibatkan pengurangan tingkat kecepatan migrasi molekul DNA linear sebesar 15%.
6. Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi DNA sangat lambat. Sementara larutan buffer berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan panas, sehingga aliran listrik menjadi sangat maksimal. Ada kemungkinan gel akan meleleh dan DNA dapat mengalami denaturasi.
Visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk di antara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan terlihat di bawah lampu UV (Gaffar, 2007). Larutan etidium bromida sangat berbahaya dan bersifat karsinogen. Semua larutan yang mengandung etidium bromida harus didekontaminasi sebelum dibuang (Muladno, 2010). Bahaya yang ditimbulkan oleh etidium bromida, dapat dihindari dengan menggunakan menggunakan larutan SYBR safe sebagai penggantinya. Menurut Sambrook dan Russel (2001) pewarna SYBR safe membuat DNA berpendar di bawah sinar UV. Pita DNA yang berpendar pada gel agarosa menunjukkan hasil positif bahwa terdapat DNA pada setiap lajur.
25 2.7 Sekuensing gen 16S rRNA
Metode sekuensing telah mengalami perkembangan yang cukup pesat.
Perkembangan teknologi saat ini telah memungkinkan dilakukannya analisis terhadap jutaan sekuens DNA per tahun. Kualitas analisis sekuensing sangat tergantung pada faktor kecepatan prosedur kerja dan teknologi yang digunakan.
Identifikasi mikroorganisme penyebab infeksi dilakukan dengan menumbuhkan bakteri dari berbagai spesimen klinis pada media tertentu (Trisna, 2011).
Pada metode mikrobiologi konvensional membutuhkan waktu yang lama pada saat identifikasi berdasarkan karakteristik fisiologis dan biokimianya sedangkan pada identifikasi berbasis molekuler melalui analisis sekuensing, waktu yang dibutuhkan jauh lebih singkat. Langkah analisis sekuensing dimulai dengan mengisolasi DNA dari kultur bakteri, baik kultur padat maupun cair. DNA yang diperoleh akan dijadikan sebagai cetakan dalam tahap amplifikasi dengan PCR.
Primer yang digunakan dalam PCR adalah primer 16S rRNA yang bersifat universal berukuran sekitar 1500 pb, sehingga dapat mengamplifikasi daerah 16S rRNA dari seluruh bakteri. Produk PCR dimurnikan terlebih dahulu dengan menggunakan kit komersial untuk menghilangkan sisa-sisa primer serta fragmen nukleotida (Lau, 2002).
Produk PCR yang telah dimurnikan ditentukan urutan nukleotidanya dengan metode sekuensing. Pada tahap sekuensing produk PCR dengan ukuran tertentu digunakan sebagai cetakan. Primer pada tahap PCR juga digunakan dalam sekuensing, hanya saja masing-masing primer digunakan secara terpisah dalam satu siklus sekuensing (forward saja atau reverse saja). Berbeda dengan PCR, produk yang dihasilkan dari sekuensing memiliki ukuran yang berbeda-beda. Hal
26 ini disebabkan karena pada sekuensing ditambahkan ddNTP (dideoxyribonuclease Triphosphat) atau dNTP terminator yang dilabel dengan zat warna. Terminator ini pada satu siklus akan berikatan secara acak dan menghentikan proses pembacaan.
Pada tiap basa terminator (ddATP, ddGTP, ddCTP, atau ddTTP), terdapat zat warna fluoresen yang dapat menyerap panjang gelombang yang berbeda sehingga basa terminator akan dapat dibaca dengan fluorometri
Dalam penggunaan klinis sangat penting untuk dipertimbangkan apakah diperlukan sekuensing dari keseluruhan gen (sekitar 1500 pb). Sekuensing keseluruhan gen dapat digunakan untuk membedakan strain dari suatu mikroorganisme. Dalam penemuan spesies baru, sekuensing keseluruhan gen 16S rRNA sangat diperlukan. Pada sebagian besar isolat klinis bakteri, fragmen pendek, yaitu 500 pb di bagian awal gen 16S rRNA dinilai sudah cukup informatif dalam mengidentifikasi (Trisna, 2011). Kattar dkk (2000), menyatakan bahwa spesies dari Bordetella sp dapat ditentukan dari sekuens DNA di bagian awal gen 16S rRNA yang dimilikinya.
27 BAB III. METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini telah dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Perintis Indonesia dan Laboratorium Mikrobilogi Fakultas Kedokteran Universitas Andalas, Padang, pada bulan Februari 2019 sampai Mei 2020.
3.2. Alat dan Bahan 3.2.1 Alat
Masker, sarung tangan, erlenmeyer, gelas ukur, tabung reaksi, rak tabung reaksi, pipet tetes, timbangan analitik, pisau, cawan petri, jarum ose, pinset, bunsen, lemari pendingin, laminar air flow, autoklaf, mikrotube, pipet mikro, jangka sorong, kertas label, plastik wrap, aluminium foil, tisu, kapas, kasa, mikroskop cahaya, kaca objek, kertas koran, kompor, tabung ependorf, tabung spin coloumn, termoblock, seperangkat alat PCR dan seperangkat alat elektroforesis.
3.2.2 Bahan
Daun papaya, bakteri uji Escherichia coli dan Staphylococcus aureus, aquades steril, etanol 96%, NaCl 0.9%, 1%, H2SO4 1%, BaCl22H2O 1,175%, iodin, fuksin, media Nutrient Agar, larutan kristal ungu, nistatin, Na-hipoklorit 5.25%, disk amokcisilin, lugol, larutan safranin, Primer 16S rRNA Forward (5’
CCAGCAGCCGCGGTAATACG 3’), Primer 16S rRNA Reverse (3’- ATCGG(C/T)TACCTTGTTACGACTTC5’), gel red, DNA ladder 1 Kbp, loading dye, bubuk agarosa, dan TBE buffer.
28 3.3 Prosedur dan Cara Kerja
3.3.1 Pengambilan dan Identifikasi Sampel
Sampel yang digunakan adalah daun pepaya dengan 3 kategori yang berbeda yaitu pucuk daun, duan muda dan daun tua. Pengambilan sampel dilakukan di Lubuk Minturun, Kecamatan Koto Tangah, Kota Padang, Sumatra Barat. Sampel diidentifikasi di Herbarium Fakultas MIPA Universitas Andalas Padang.
3.3.2 Sterilisasi Alat dan Pembuatan Media a. Sterilisasi Alat
Alat yang digunakan dicuci dan dikeringkan telebih dahulu sebelum disterilkan. Cawan petri dibungkus dengan koran, tabung reaksi dan pipet tetes ditutup mulutnya dengan kapas kemudian dibungkus satu persatu dengan kertas koran. Semua alat disterilkan dalam oven pada suhu 160oC selama 1 jam. Mulut erlenmeyer ditutup dengan kapas dan gelas ukur ditutup dengan kapas dan dibungkus satu persatu dengan kertas koran kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit tekanan 15 lbs, lalu pinset, jarum ose dan kaca objek di sterilkan dengan cara dibakar menggunakan lampu spritus.
b. Pembuatan Nutrient Agar
Medium Nutrient Agar dibuat dengan cara melarutkan 20 gr Nutrient Agar kedalam 1000 ml aquades steril dalam erlenmeyer. Larutan ini selanjutnya dipanaskan diatas kompor sambil diaduk-aduk selama 10-15 menit, selanjutnya disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit (Retnowati, 2011).
29 3.3.3 Isolasi dan Purifikasi Bakteri Endofit Daun Pepaya
Sampel daun dicuci dengan air mengalir hingga bersih, kemudian dipotong
masing-masing sekitar 1-3 cm. Potongan sampel tersebut dilakukan sterilisasi permukaan secara bertahap. Potongan sampel direndam etanol 96% selama 1 menit, dilanjutkan ke dalam Na-hipoklorit 5.25% selama 5 menit, kemudian dibilas lagi ke dalam etanol 96% sebanyak tiga kali. Sampel yang telah disterilisasi lalu ditanam pada media isolasi Nutrient Agar kemudian diinkubasi di ruang gelap dan diamati sampai adanya pertumbuhan koloni. Pemurnian koloni bakteri dilakukan dengan memindahkan 1 ose koloni ke dalam cawan petri yang berisi media Nutrient Agar baru dan di inkubasi pada suhu 27oC-29oC selama 24 jam. Setelah diperoleh biakan murni, bakteri endofit dipindahkan ke agar miring Nutrient Agar (Kusumawati dkk, 2014).
3.3.4 Identifikasi Morfologi Isolat Bakteri Endofit a. Morfologi secara makroskopik
Bentuk koloni (dilihat dari atas) : berupa titik-titik, bulat, berbenang, tak
teratur, serupa akar, serupa kumparan. Permukaan koloni (dilihat dari samping) : rata, timbul- datar, melengkung, membukit, serupa kawah. Tepi koloni (dilihat dari atas) : utuh, berombak , berbelah, bergerigi, berbenang dan keriting. Warna koloni : keputih- putihan, kelabu, kekuning-kuningan, atau hampir bening.
b. Marfologi secara mikroskopik
Prosedur pewarnaan gram terdiri atas beberapa langkah berikut:
1. Bakteri endofit diambil sedikit dengan jarum ose secara aseptis dan disuspensikan dengan aquadest yang ada diatas gelas objek.
2. Preparat difuksasi di atas api bunsen sampai kering.
30 3. Preparat ditetesi dengan larutan kristal ungu dan didiamkan selama 1
menit.
4. Zat kristal ungu tersebut kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.
5. Preparat ditetesi dengan larutan iodin dan didiamkan selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.
6. Preparat ditetesi dengan larutan alkohol 96% sampai warna ungu hilang.
7. Preparat ditetesi dengan larutan safranin dan didiamkan selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.
8. Preparat ditetesi fuksin selama 1-2 menit, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.
9. Preparat dicuci dan dikeringkan lalu diamati dibawah mikroskop.
3.3.5 Uji Aktivitas Antibakteri
a. Pembuatan Larutan Mac Farland 0,5
Larutan H2SO4 1% sebanyak 10 ml dicampurkan dengan larutan BaCl22H2O 1,175% sebanyak 0,05 mL dalam erlenmeyer. Kemudian dikocok sampai terbentuk larutan yang keruh. Kekeruhan ini dipakai sebagai standar kekeruhan suspensi bakteri uji (Sihombing dkk, 2018)
b. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Bakteri uji yaitu Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif dan Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif yang telah diinokulasi diambil ± 1 ose kemudian disuspensikan ke dalam tabung yang berisi 5 mL larutan NaCl 0,9% sehingga diperoleh kekeruhan yang sama dengan standar
31 kekeruhan larutan Mac farland 0,5. Suspensi bakteri tersebut dipipet sebanyak 200 μL dan di swab ke media pembenihan (Sihombing dkk, 2018)
c. Penyiapan Bakteri Endofit
Isolat bakteri endofit dari masing-masing sampel diambil dengan jarum ose kemudian masing-masing diinokulasikan kedalam 9 ml NaCl 0,9% kemudian di vortex hingga homogen.
d. Pengujian Aktivitas Antibakteri
Suspensi bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli diambil 200 μL dan diratakan pada permukaan media Mueller Hinton Agar. Permukaan media diberi 3 buah kertas cakram yang ditetesi suspensi isolat bakteri endofit dari pucuk daun, daun muda, daun tua dan disk amoxicilin sebagai kontrol positif, kemudian diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 37°C selama 24 jam.
e. Pengamatan dan Pengukuran Zona Hambat
Pengamatan dilakukan setelah 1 x 24 jam masa inkubasi. Zona bening yang terbentuk di sekitar kertas cakram diamati. Diameter zona bening ini kemudian diukur dengan menggunakan jangka soron. Diameter zona bening diukur berdasarkan penggolongan CLSI
3.3.6 Identifikasi Bakteri Endofit Terpilih Secara Molekuler a. Isolasi DNA (boiling)
Isolat bakteri endofit yang memiliki aktivitas antibakteri terbesar di media miring diambil menggunakan pipet mikro dan dimasukkan ke dalam tabung microtube yang telah berisi Pospate Buffer Saline (PBS) sebanyak 1 ml Selanjutnya sampel dalam tabung microtube dimasukkan ke dalam sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Setelah di sentrifugasi supernatan
32 dibuang lalu ditambahkan sebanyak 1 ml TE buffer kemudian di vortex, selanjutnya di inkubasi dengan heating block selama 10 menit dengan suhu 950C kemudian suspensi bakteri tersebut disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Selanjutnya supernatan dipindahkan ke dalam tabung microtube 1,5 ml, kemudian di simpan ke dalam freezer (Sihombing dkk, 2018)
b. Amplifikasi Gen 16S rRNA dengan PCR
DNA sampel yang telah diisolasi dilanjutkan dengan metode PCR yang terdiri dari 3 tahap denaturasi,anealing, dan extension yang dapat dilihat pada tabel 4, menggunakan primer 16S rRNA. Dengan urutan basa dapat dilihat pada tabel 3 (Rahmani, dkk, 2006). Metode amplifikasi DNA ini digunakan Taq DNA Polymerase menggunakan Go Taq Mastermix.
Tabel 2. Komponen dan campuran untuk primer 16S rRNA dan DNA sampel
Pereaksi Jumlah pereaksi (µL)
Template DNA 3 µL
Go Taq mastermix 50 µL
Primer forward 1 µL
Primer reverse 1 µL
Nuclease free water 15 µL
MgCl2 5 µL
Volume total 50 µL
