BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
2.3 Penelitian Mengenai Tumbuhan yang Berkhasiat
dapat dilihat pada Tabel 2.3.
Tabel 2.3 Penelitian dari berbagai tumbuhan yang berkhasiat sebagai antioksidan
Tumbuhan Bahan Uji Metode Rujukan
Bawang putih
(Allium sativum) Ekstrak DPPH
Lenkova, dkk., 2016 Bawang merah
(Allium cepa) Ekstrak DPPH Bawang prei
(Allium porrum) Ekstrak DPPH Al-Snafi, 2013 Bawang putih
(Allium sativum) Ekstrak DPPH
Sinaga, G., 2016 Bawang Batak
(Allium chinense) Ekstrak DPPH
2.4 Ekstrak
Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif yang terdapat dalam simplisia menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian pelarut akan diuapkan dan massa yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim, 2000).
Terdapat beberapa metode ekstraksi dengan menggunakan pelarut, yaitu:
i. Cara dingin
a. Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan.
Maserasi kinetik berarti dilakukan pengadukan secara terus-menerus.
Remaserasi adalah pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya (Anonim, 2000).
b. Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan. Proses terdiri dari pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak) secara terus menerus sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlah satu sampai lima kali dari bahan (Anonim, 2000).
ii. Cara panas
a. Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut tertentu pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dengan jumlah pelarut yang terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Proses pengulangan dilakukan pada residu pertama sebanyak tiga sampai lima kali hingga proses ekstraksi sempurna (Anonim, 2000).
b. Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi terus-menerus dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik (Anonim, 2000).
c. Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan terus-menerus) pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-500C (Anonim, 2000).
d. Infusa adalah ekstraksi dengan pelarut air di mana bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih dengan temperatur 900C selama 15 menit (Anonim, 2000).
e. Dekoktasi adalah infus pada waktu yang lebih lama (lebih dari 30 menit) dan temperatur sampai titik didih air (Anonim, 2000).
2.5 Senyawa Fenol
Senyawa fenol adalah senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus hidroksil yang menempel di cincin aromatik. Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air karena umumnya sering kali berikatan dengan gula sebagai glikosida, dan biasanya terdapat dalam vakuola sel. Flavonoid merupakan salah satu golongan terbesar fenol (Harborne, 1984).
Salah satu contoh senyawa fenolat adalah asam galat yang banyak terdapat pada tumbuhan berkayu, merupakan senyawa yang sangat reaktif (Harborne, 1984).
2.6 Senyawa Flavonoid
Flavonoid terdistribusi luas pada tanaman. Flavonoid merupakan kandungan khas tumbuhan yang terdapat hampir pada semua bagian tumbuhan seperti daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, nectar, bunga dan biji. Flavonoid memiliki peranan yang cukup beragam pada tanaman, mulai dari memproduksi pigmen berwarna kuning, merah, atau biru pada bunga, hingga sebagai penangkal terhadap mikroba dan insekta (Andarwulan dan Faradilla, 2012).
Flavonoid biasanya terdapat dalam sebagai flavonoid O-glikosida; pada senyawa tersebut terdapat satu gugus hidroksil flavonoid (atau lebih) terikat pada satu gula (atau lebih) dengan ikatan hemiasetal yang tak tahan asam. Pengaruh glikosilasi menyebabkan flavonoid menjadi kurang reaktif dan lebih mudah larut dalam air; sifat terakhir ini memungkinkan penyimpanan flavonoid di dalam vakuola sel (Markham, 1982).
Senyawa flavonoid merupakan salah satu senyawa polifenol yang memiliki struktur dasar terdiri atas 15 atom C (C6-C3-C6), dimana dua cincin aromatik yang dihubungkan oleh satuan karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga (Harborne, 1984).
Berdasarkan perbedaan struktur C3 yang mengikat dua gugus benzen, flavonoid dapat dibagi menjadi tiga jenis. Ketiga jenis tersebut adalah kalkon, auron, dan flavonoid (Andarwulan dan Faradilla, 2012). Gambar struktur kalkon, auron dan flavonoid dapat dilihat pada Gambar 2.1.
Gambar 2.1 (i) Kalkon; (ii) Auron dan (iii) Flavonoid (Andarwulan dan Faradilla, 2012).
Kuersetin (3,4-dihidroksiflavonol) merupakan senyawa flavonoid dari kelompok flavonol dan terdapat terutama pada tanaman teh, tomat, apel, kakao, anggur dan bawang. Kuersetin dapat memberikan manfaat sebagai pemusnah radikal bebas jika dikonsumsi dalam jumlah yang cukup (50-200 mg per hari) sehingga dapat mencegah penuaan dini (Kosasih, dkk., 2004).
(i) (ii)
(iii)
2.7 Radikal Bebas
Radikal bebas adalah atom atau molekul dengan susunan elektron yang tidak lengkap atau tidak berpasangan sehingga bersifat tidak stabil dan memiliki kecenderungan kuat untuk berpasangan. Proses ini terjadi berantai sehingga menyebabkan kerusakan biologik seperti disfungsi sel yang diikuti inflamasi dan akhirnya menjadi penyakit degeneratif (Kosasih, dkk., 2004).
Radikal bebas dapat digolongkan menjadi radikal bebas endogen dan radikal bebas eksogen.
i. Radikal bebas endogen
Radikal bebas endogen adalah radikal bebas dari hasil samping reaksi biokimia dalam tubuh. Makhluk hidup menghasilkan energi dari hasil metabolisme dengan mengoksidasi zat zat makanan seperti karbohidrat, lemak dan protein. Dalam proses oksidasi ini terbentuk radikal bebas dan ROS (Reactive Oxidative Species), yaitu anion superoksid dan hidroksi radikal. Radikal bebas dan ROS mudah menempel pada sel-sel tubuh dan merusak dengan mengambil satu elektron dari sel-sel tubuh (Kosasih, dkk., 2004).
ii. Radikal bebas eksogen
Radikal bebas eksogen adalah radikal bebas yang terbentuk karena pengaruh dari luar tubuh. Bahan dasar radikal bebas masuk ke dalam tubuh meliputi obat-obatan (kemoterapeutika), udara (pestisida, polusi udara, asap rokok, minuman beralkohol). Sinar ultraviolet juga dapat menyebabkan radikal bebas jika sinar tersebut menerpa suatu benda terus-menerus yang menyebabkan elektron atom benda tersebut melompat dari orbitnya. Radikal bebas juga
diperoleh karena rokok baik perokok aktif maupun perokok pasif (sekunder) (Kosasih, dkk., 2004).
2.8 Antioksidan
Antioksidan adalah zat yang dapat menetralisir radikal bebas sehingga atom dengan elektron yang tidak berpasangan mendapat pasangan elektron sehingga tidak reaktif lagi sehingga melindungi tubuh dari beragam penyakit degeneratif (Kosasih, dkk., 2004).
Antioksidan dapat dibedakan menjadi dua, yaitu antioksidan internal dan antioksidan eksternal. Antioksidan internal adalah antioksidan yang diproduksi oleh tubuh sendiri. Secara alami tubuh mampu menghasilkan antioksidan sendiri, kemampuan tubuh untuk memproduksi antioksidan alami akan semakin berkurang dengan bertambahnya usia. Contoh antioksidan internal adalah Super Oxide Dismutase (SOD), enzim Glutathion Peroxide, dan enzim katalase. Antioksidan eksternal adalah antioksidan yang diperoleh dari luar tubuh, seperti melalui asupan makanan yang mengandung antioksidan seperti vitamin C, vitamin E, Beta Karoten, dan senyawa flavonoid seperti isoflavon yang terdapat dalam kedelai dan produk makanan dari kedelai (Sayuti dan Yenrina, 2015; Kosasih, dkk., 2004).
Berdasarkan fungsi dan mekanisme kerjanya, antioksidan dapat dibedakan menjadi tiga jenis, yaitu:
a. Antioksidan primer, bekerja mencegah pembentukan senyawa radikal baru, yaitu dengan mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul yang berkurang dampak negatifnya sebelum senyawa radikal bebas bereaksi.
Antioksidan primer mengikuti mekanisme pemutusan rantai (chain-breaking
antioxidant) reaksi radikal dengan mendonorkan atom hidrogen secara cepat pada suatu lipid yang radikal, produk yang dihasilkan lebih stabil dari produk awal. Contohnya Superoksida Dismutase (SOD), Glutathion Peroxide (GPx), katalase dan protein pengikat logam. (Sayuti dan Yenrina, 2015).
b. Antioksidan sekunder, berperan sebagai pengikat ion-ion logam, penangkap oksigen, pengurai hidroperoksida menjadi senyawa non-radikal, penyerap radiasi UV atau deaktivasi singlet oksigen. Contohnya vitamin E, vitamin C, beta-karoten, isoflavon, bilirubin dan albumin. Potensi antioksidan ini dengan cara memotong reaksi oksidasi berantai radikal bebas atau dengan cara menangkapnya (scavenger free radical) (Sayuti dan Yenrina, 2015).
c. Antioksidan tersier, bekerja memperbaiki kerusakan biomolekul yang disebabkan oleh serangan radikal bebas. Contoh antioksidan tersier adalah enzim-enzim yang memperbaiki DNA dan metionin sulfida reduktase (Sayuti dan Yenrina, 2015).
2.9 Metode Pengujian Antioksidan
Metode untuk menentukan kadar total fenol pada ekstrak tumbuhan yang merujuk pada prosedur (Geng, dkk., 2015) menggunakan metode kolorimetrik dengan reagen Ciocalteau. Senyawa fenol direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteau dalam suasana basa, gugus hidroksil pada senyawa fenolik akan bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteau membentuk kompleks molibdeum-tungsten berwarna biru dan dapat dideteksi dengan spektrofotometer.
Metode untuk menentukan total flavonoid adalah dengan metode kolorimetrik menggunakan reagen Aluminium klorida (AlCl3). AlCl3 akan
membentuk asam kompleks yang stabil dengan C-4 kelompok keto dan baik C-3 atau C-5 gugus hidroksil dari flavon (Bhaigyabati, dkk., 2014).
Metode pengujian aktivitas antioksidan dikelompokkan menjadi tiga golongan. Golongan pertama adalah Hydrogen Atom Transfer Methods (HAT), misalnya Oxygen Radical Absorbance Capacity Method (ORAC) dan Lipid Peroxidation Inhibition Capacity Assay (LPIC). Golongan kedua adalah Electron Transfer Methods (ET), misalnya Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) dan 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH) Free Radical Scavenging Assay. Golongan ketiga misalnya Total Oxidant Scavenging Capacity (TOSC) dan Chemiluminescence (Sayuti dan Yenrina, 2015).
Metode yang paling umum digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan adalah menggunakan radikal bebas 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH). Pengukuran antioksidan dengan metode DPPH karena sederhana, cepat dan tidak membutuhkan banyak reagen seperti halnya metode lain (Sayuti dan Yenrina, 2015).
Larutan DPPH akan bereaksi dengan senyawa antioksidan sehingga DPPH akan berubah menjadi non-radikal. Peredaman radikal bebas DPPH akan ditandai dengan berubahnya warna ungu tua menjadi warna merah muda atau kuning pucat dan dapat diamati dan diukur menggunakan spektrofotometer sehingga aktivitas peredaman radikal bebas oleh sampel dapat ditentukan (Molyneux, 2004).
Parameter yang digunakan untuk menunjukkan aktivitas antioksidan adalah nilai konsentrasi efektif atau Effect Concentration (EC50) atau Inhibition Concentration (IC50) yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang menyebabkan 50% dari DPPH kehilangan sifat radikal atau konsentrasi zat antioksidan yang
memberikan % peredaman sebesar 50%. Zat yang mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi, mempunyai nilai IC50 yang rendah (Molyneux, 2004).
Prinsip pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH adalah mengukur daya peredaman sampel (ekstrak) terhadap radikal bebas DPPH. DPPH akan bereaksi dengan atom hidrogen dari senyawa peredaman radikal bebas membentuk DPPH yang lebih stabil. Senyawa peredaman radikal bebas yang bereaksi dengan DPPH akan menjadi radikal baru yang lebih stabil atau senyawa bukan radikal (Sayuti dan Yenrina, 2015).
Reaksi DPPH dengan antioksidan dapat dilihat pada Gambar 2.2.
Gambar 2.2 Reaksi DPPH dengan antioksidan (Sayuti dan Yenrina, 2015).
2.10 Spektrofotometer UV-Vis.
Spektrofotometri serapan adalah pengukuran serapan radiasi elektromagnet panjang gelombang tertentu yang sempit, mendekati monokromatik, yang diserap zat. Pengukuran serapan dapat dilakukan pada daerah ultraviolet dengan panjang gelombang 190 nm - 380 nm atau pada daerah cahaya tampak (Visibel) dengan panjang gelombang 380 nm – 780 nm (Ditjen
Penetapan kadar sampel dengan spektrofotometer UV-Vis adalah dengan menggunakan perbandingan absorbansi sampel dengan absorbansi baku, atau dengan menggunakan persamaan regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi baku dengan absorbansinya. Persamaan kurva baku selanjutnya digunakan untuk menghitung kadar dalam sampel (Rohman, 2007).
Menurut Rohman (2007), spektrofotometer yang sesuai untuk pengukuran di daerah spektrum ultraviolet dan sinar tampak. Komponen- komponen dalam spektrofotometer UV-VIS meliputi sumber-sumber lampu, monokromator dan sistem optik.
(i) Sumber-sumber lampu
Sumber lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada panjang gelombang 190-350 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel (sinar tampak) pada panjang gelombang antara 350-900 nm.
(ii) Monokromator
Monokromator digunakan untuk mendispersikan sinar ke dalam komponen-komponen panjang gelombangnya yang selanjutnya akan dipilih oleh celah (slit).
(iii) Optik-optik
Optik dapat dibentuk untuk memecah sumber sinar sehingga sumber sinar melewati 2 kompartemen, dan sebagaimana dalam spektrofotometer berkas ganda (double beam), suatu larutan blanko dapat digunakan dalam satu kompartemen untuk mengkoreksi pembacaan atau spektrum sampel, biasanya berupa pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel atau pereaksi.
BAB III
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental yang terdiri dari variabel terikat yaitu penetapan kadar total fenol dan total flavonoid dengan variabel bebas menggunakan pelarut yang berbeda serta pengujian aktivitas senyawa antioksidan menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
3.1 Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fitokimia dan Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, pada bulan Januari 2018 sampai April 2018.
3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat - alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas laboratorium, blender, rotary evaporator, cawan penguap, spot plate, stopwatch, panci infus, krus porselin, oven listrik, lemari pengering, neraca analitik, penangas air, spektrofotometer UV-Vis. Dapat dilihat pada Lampiran 2.
3.2.2 Bahan – bahan
Bahan- bahan kimia lainnya seperti DPPH (Sigma), asam galat, reagen Folin-Ciocalteau (Sigma), kuersetin (Sigma). Produksi E-Merck: amil alkohol, asam asetat anhidrida, asam klorida, asam nitrat, asam sulfat, serbuk magnesium, kalium iodida, natrium karbonat (Na2CO3), akuades, etil-asetat, etanol, n-heksan, natrium asetat (CH3COONa), AlCl3, metanol.
3.3 Sampel Penelitian
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun kucai dari Pasar Baru, Perbaungan, Provinsi Sumatera Utara. Foto tanaman kucai dapat dilihat pada Lampiran 3.
3.3.1 Identifikasi Sampel
Identifikasi daun kucai dilakukan di Herbarium Medanense, Laboratorium Fakultas Matematika dan Ilmu Penegtahuan Alam (FMIPA) Universitas Sumatera Utara.
3.3.2 Penyiapan Sampel
Daun kucai yang telah dikumpulkan, dibersihkan dari pengotornya, selanjutnya dicuci dibawah air mengalir beberapa kali hingga bersih, kemudian ditiriskan lalu disebarkan diatas perkamen sampai merata hingga airnya terserap, setelah itu dipisahkan antara daun dan bulbusnya, daun dipotong-potong, dimasukkan ke dalam lemari pengering pada suhu ± 400C selama 5 hari, kemudian simplisia dihaluskan dan disimpan dalam wadah plastik untuk mencegah pengaruh lembab dan pengotor lainnya. Simplisia yang dihasilkan dibagi menjadi lima bagian yaitu untuk skrining fitokimia, pembuatan infusa 10%
daun kucai, ekstrak etanol 96% daun kucai, ekstrak etil-asetat daun kucai, dan ekstrak n-heksan daun kucai. Untuk lebih jelas dapat dilihat bagan alir penyiapan sampel dan karakterisasi simplisia pada Lampiran 4.
3.4 Pembuatan Pereaksi
Pembuatan pereaksi yang digunakan dalam penelitian ini meliputi peraksi asam sulfat (H2SO4) 2 N, asam nitrat (HNO3) 0,5 N, Liebermann-Bouchard,
Molisch, Mayer, besi (III) klorida (FeCl3) 10%, Dragendorff, Bouchardat, natrium hidroksida (NaOH) 2 N, timbal (II) asetat /Pb(CH3COO)2 0,4 M, asam klorida HCl 2 N (Depkes RI, 1995).
3.4.1 Pereaksi H2SO4 2 N
Sebanyak 5,5 mL H2SO4 pekat diencerkan dengan akuades hingga volume 100 mL (Dekpkes RI, 1995).
3.4.2 Pereaksi HNO3 0,5 N
Sebanyak 4,2 mL HNO3 diencerkan dengan akuades hingga diperoleh volume larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.3 Pereaksi Molisch
Sebanyak 3 gram α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam HNO3 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.4 Pereaksi Liebermann-Bouchard
Sebanyak 5 mL CH3COOH anhidrida dicampurkan perlahan dengan 5 mL H2SO4 pekat dan ditambahkan etanol hingga 50 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.5 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,359 gram HgCl2 ditimbang dan dilarutkan dalam akuades hingga diperoleh volume larutan 60 mL. Sebanyak 5 gram KI ditimbang, dilarutkan dalam 10 mL akuades pada wadah yang berbeda, kemudian kedua larutan dicampurkan dalam satu wadah. Campuran larutan tersebut ditambahkan akuades hingga diperoleh volume larutan sebanyak 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.6 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8 gram Bi(NO)3 ditimbang dan dilarutkan ke dalam 20 mL HNO3 pekat. Dilarutkan 27,2 gram KI dalam 50 mL akuades pada wadah lain.
Kedua larutan tersebut dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna.
Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan akuades hingga diperoleh larutan dengan volume 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.7 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 gram KI dilarutkan dalam akuades, kemudian 2 gram iodium dilarutkan dalam larutan kalium iodide dan dicukupkan dengan akuades hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.8 Pereaksi HCl 2 N
Sebanyak 17 mL HCl pekat ditambahkan dengan akuades hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.9 Pereaksi FeCl3 10%
Sebanyak 10 gram FeCl3 ditimbang dan dilarutkan dalam akuades hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.10 Peraksi Pb(CH3COO)2 0,4 M
Sebanyak 15,17 gram Pb(CH3COO)2 dilarutkan dalam akuades bebas CO2 hingga 100 mL (Depkes RI,1995).
3.5 Karakterisasi Simplisia
Karaterisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu tidak larut dalam asam, penetapan kadar sari larut dalam air dan penetapan kadar sari larut dalam etanol (WHO, 1998).
3.5.1 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi (destilasi toluen).
Metode ini menggunakan alat destilasi, terdiri dari labu alas bulat 500 mL, tabung penyambung, hot plate, pendingin bola, sirkulator, tabung penerima 10 mL.
a. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 mL toluen dan 2 mL akuades dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang tabung penyambung, alat penambung dan pendingin bola, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air di dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 mL dan dicatat.
b. Penetapan kadar air pada simplisia
Ditimbang simplisia sebanyak 5 gram dan dimasukkan ke dalam labu alas bulat yang berisi penjenuhan toluen tersebut, labu dipanaskan kembali selama 15 menit. Ketika toluen mulai mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes per detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian dinaikkan kecepatan tetesan menjadi 4 tetes per detik. Ketika semua air telah terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Air dan toluen memisah sempurna, volume air dapat dibaca dengan ketelitian 0,05 mL. Selisih dari kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat di dalam sampel. Kadar air dihitung dalam persen terhadap berat simplisia yang ditimbang (WHO, 1998).
3.5.2 Penetapan Kadar Abu Total
Ditimbang simplisia yang sudah digerus sebanyak 2 gram, dimasukkan ke dalam krus porselin yang telah lebih dahulu dipijarkan dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijarkan sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung dalam persen terhadap berat simplisia yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 1995).
3.5.3 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut Asam
Dididihkan abu yang diperoleh dari penetapan kadar abu dengan 25 mL HCl encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring dengan kertas saring bebas abu, dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijar sampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 1995).
3.5.4 Penetapan Kadar Sari Larut Air
Ditimbang serbuk simplisia sebanyak 5 gram, dimaserasi selama 24 jam dengan 100 mL air-kloroform (2,5 mL kloroform dalam air hingga 1 liter) menggunakan labu bersumbat sambil dikocok sekali-kali selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak 20 mL filtrat diuapkan dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 1050C hingga bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 1995).
3.5.5 Penetapan Kadar Sari Larut Etanol
Ditimbang sebanyak 5 gram serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dengan 100 mL etanol (96%) menggunakan labu tersumbat sambil dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak 20 mL
filtrat diuapkan dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 1050C hingga bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 1995).
3.6 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia daun kucai meliputi pemeriksaan senyawa alkaloid, glikosida, saponin, flavonoid, tanin dan steroid/triterpenoid.
3.6.1 Pemeriksaan Alkaloid
Sebanyak 0,5 gram simplisia ditambahkan 1 mL HCl 2 N dan 9 mL air suling. Dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring.
Filtrat dipakai untuk uji alkaloid sebagai berikut :
a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer akan terbentuknya endapan menggumpal berwarna putih atau kuning.
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai kehitaman.
c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan dengan 2 tetes larutan peraksi Dragendorff, akan terbentuk endapan berwarna merah atau jingga.
Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percobaan diatas (Depkes RI, 1995).
3.6.2 Pemeriksaan Glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 gram kemudian disari dengan 30 mL campuran 7 bagian volume etanol 96% dan 3 bagian volume air suling ditambahkan dengan 10 mL HCl 2 N. Direfluks selama 30 menit, lalu didinginkan dan disaring. Diambil 20 mL filtrat ditambahkan 25 mL air suling dan 25 mL
Pb(CH3COO)2 0,4 M, lalu dikocok selama 5 menit dan disaring. Filtrat disari dengan 20 mL campuran 3 bagian kloroform dan 2 isopropanol dilakukan berulang sebanyak tiga kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50oC. Sisa dilarutkan dalam 2 mL air suling dan 5 tetes pereaksi Molish, kemudian secara perlahan ditambahkan 2 mL H2SO4 pekat. Glikosida positif jika terbentuk cincin ungu (Depkes RI, 1995).
3.6.3 Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 0,5 gram sampel simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 mL air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik, timbul busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm, ditambahkan 1 tetes HCl 2 N, bila buih tidak hilang menunjukkan adanya saponin (Depkes RI, 1995).
3.6.4 Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 10 gram serbuk simplisia kemudian ditambahkan 100 mL air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, filtrat yang diperoleh kemudian diambil 5 mL lalu ditambahkan 0,1 gram serbuk Mg dan 1 mL HCl pekat dan 2 mL amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol (Farnsworth, 1996).
3.6.5 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0,5 gram sampel disari dengan 10 mL air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 mL larutan filtrat lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi FeCl3. Adanya warna biru/ hijau kehitaman menunjukkan senyawa tanin (Farnsworth, 1996).
3.6.6 Pemeriksaan Stereoid/Triterpenoid
Sebanyak 1 gram sampel dimaserasi dengan n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap, pada sisa ditambahkan 2 tetes CH3COOH anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat. Timbul warna biru/hijau menunjukkan adanya steroid dan timbul warna merah, pink atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid (Farnsworth, 1996).
3.7 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak yang menggunakan pelarut akuades digunakan metode infusa sedangkan untuk pelarut lainnya menggunakan metode maserasi. Bagan alir pembuatan infusa dan ekstrak daun kucai dapat dilihat pada Lampiran 5.
3.7.1 Pembuatan Infusa Kental 10% Daun Kucai
Ditimbang seksama 100 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam panci infusa kemudian ditambahkan dengan akuades hingga 1000 mL untuk mendapatkan konsentrasi 10%, dipanaskan pada suhu 900C selama 15 menit sambil diaduk sesekali, diserkai selagi panas dengan kain flanel, dibilas dengan
Ditimbang seksama 100 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam panci infusa kemudian ditambahkan dengan akuades hingga 1000 mL untuk mendapatkan konsentrasi 10%, dipanaskan pada suhu 900C selama 15 menit sambil diaduk sesekali, diserkai selagi panas dengan kain flanel, dibilas dengan