PENETAPAN KADAR
TOTAL FENOL DAN TOTAL FLAVONOID DARI EKSTRAK DAUN KUCAI (Allium schoenoprasum L.)
DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS
SKRIPSI
OLEH:
MARSELINA PURNAMA SARI NIM 141501062
PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN
2018
PENETAPAN KADAR
TOTAL FENOL DAN TOTAL FLAVONOID DARI EKSTRAK DAUN KUCAI (Allium schoenoprasum L.)
DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
OLEH:
MARSELINA PURNAMA SARI NIM 141501062
PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN
2018
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena berkat kasih dan karunia-Nya, saya dapat melewati masa perkuliahan, penelitian dan hingga penyusunan skripsi dengan baik. Adapun judul skripsi saya adalah
“Penetapan Kadar Total Fenol dan Total Flavonoid dari Ekstrak Daun Kucai (Allium schoenoprasum L.) dengan Metode Spektrofotometri UV-Vis”. Skripsi ini merupakan salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi dari Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
Dalam menyelesaikan skripsi ini tidak terlepas dari hambatan ataupun kesulitan yang saya temui, namun berkat bantuan moril maupun materil serta dukungan dan saran dari berbagai pihak saya dapat melaluinya dengan baik hingga skripsi ini selesai. Oleh karena itu, saya ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Ibu Prof. Dr. Siti Morin Sinaga, M.Sc. Apt., selaku pembimbing, yang telah mengajarkan, membimbing dan mengarahkan saya selama penelitian hingga penyusunan skripsi ini sehingga menghasilkan skripsi yang lebih baik. Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., dan Ibu Dra. Masria Lasma Tambunan, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah bersedia menguji dan memberikan arahan untuk menyempurnakan skripsi ini. Bapak dan Ibu dosen Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan ilmu-ilmu yang berharga selama perkuliahan.
Saya juga mengucapkan terima kasih kepada orangtua tercinta, Ayahanda Tiam Huang dan Ibunda Lie Tjin serta adik tercinta Descham Winaldo yang telah memberikan dukungan dan kasih sayang yang tak terhingga serta doa yang selalu
Tak lupa saya ucapkan terima kasih kepada Delviana, S.Farm. yang telah bersedia meluangkan waktunya untuk saling bertukar pikiran dan memberi saran selama penelitian ini. Terima kasih kepada sahabat seperjuangan Octavina Bakie, Gra Cella, Cyntia Syahrir, Jennifer Agustina, Vina Kumalasari, Cindy, Kevin, dan Steven Tandiono yang telah banyak membantu saya dan saling berbagi ilmu untuk kelancaran penelitian, sahabat tercinta, Pavita Puansari, Elvina Valencia, B. Ed., Sherly Roselliny Kencana, Emilia, teman-teman pengurus KMB-USU 2017/2018, N.Y.P.D., asisten-asisten dan laboran Teknologi Sediaan Farmasi III (Steril) dan teman-teman angkatan 2014 Farmasi Universitas Sumatera Utara yang senantiasa selalu memberikan dukungan serta doa-nya sehingga saya selalu bersemangat menyelesaikan skripsi ini.
Saya menyadari sepenuhnya bahwa skripsi ini masih belum sempurna, sehingga saya mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk menambah pengetahuan dan wawasan saya di masa depan.
Akhir kata saya berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi rekan- rekan di bidang farmasi serta adik-adik Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
Medan, 17 Juli 2018 Penulis,
Marselina Purnama Sari NIM 141501062
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan di bawah ini:
Nama : Marselina Purnama Sari
Nomor Induk Mahasiswa : 141501062
Program Studi : S-1 Reguler Farmasi
Judul Skripsi : Penetapan Kadar Total Fenol dan Total Flavonoid dari Ekstrak Daun Kucai (Allium schoenoprasum L.) dengan Metode Spektrofotometri UV-Vis.
Dengan ini menyatakan bahwa skripsi ini ditulis berdasarkan data dan hasil pekerjaan yang saya lakukan sendiri, dan belum pernah diajukan orang lain untuk memperoleh gelar kesarjanaan di perguruan tinggi lain, dan bukan plagiat karena kutipan yang ditulis telah disebutkan sumbernya di dalam daftar pustaka.
Apabila dikemudian hari ada pengaduan dari pihak lain karena di dalam skripsi ini ditemukan plagiat karena kesalahan saya sendiri, maka saya bersedia mendapat sanksi apapun oleh Program Studi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, dan bukan menjadi tanggung jawab pembimbing.
Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya untuk dapat digunakan jika diperlukan sebagaimana mestinya.
Medan, 17 Juli 2018 Penulis
Marselina Purnama Sari NIM 141501062
PENETAPAN KADAR TOTAL FENOL DAN TOTAL FLAVONOID DARI EKSTRAK DAUN KUCAI (Allium schoenoprasum L.)
DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS ABSTRAK
Sumber daya alam bahan obat dan obat tradisional merupakan aset nasional yang perlu digali, diteliti, dikembangkan dan dioptimalkan pemanfaatannya. Salah satu sumber daya alam yang dapat dijadikan bahan obat adalah tanaman kucai, terutama bagian daunnya. Daun kucai mengandung senyawa flavonoid yang berpotensi sebagai antioksidan.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kadar total fenol dan total flavonoid yang terkandung di dalam ekstrak simplisia daun kucai serta uji aktivitas antioksidan dari ekstrak simplisia daun kucai dengan empat pelarut yang memiliki polaritas yang berbeda. Penelitian ini dilakukan secara eksperimental meliputi pengumpulan sampel, pengolahan sampel, skrining fitokimia dan pembuatan ekstrak. Simplisia daun kucai kemudian diekstraksi dengan metode infusa menggunakan pelarut air dan metode maserasi menggunakan pelarut etanol, etil asetat dan n-heksan. Penetapan kadar total fenol dilakukan dengan metode kolorimetri menggunakan reagen Folin-Ciocalteau dan penetapan kadar total flavonoid dilakukan dengan metode kolorimetri dengan penambahan pereaksi AlCl3. Penentuan uji aktivitas antioksidan ekstrak simplisia daun kucai menggunakan metode peredaman radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazil) yang diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
Hasil penentuan kadar total fenol terbanyak terdapat pada ekstrak etanol simplisia daun kucai sebesar 111,2839 mg GAE/g ekstrak sedangkan kadar total flavonoid terbanyak terdapat pada ekstrak etil asetat sebesar 34,6390 mg QE/g ekstrak. Aktivitas antioksidan terbesar terdapat pada ekstrak etil asetat simplisia daun kucai dengan nilai IC50 236,5093 µg/ml.
Kata kunci : Daun kucai, total fenol, total flavonoid, antioksidan, IC50, DPPH.
DETERMINATION OF
TOTAL PHENOLIC AND TOTAL FLAVONOID CONTENT OF EXTRACTS OF CHIVES LEAVES (Allium schoenoprasum L.)
USING SPECTROPHOTOMETRY UV-VIS METHOD ABSTRACT
Natural resources and traditional medicines are national assets that need to be explored, researched, developed and optimized for their use. One of the natural resources that can be used as medicinal ingredients is chives, especially the leaves. Chives leaves contains flavonoid which is potential as antioxidants.
This research aimed to determine the total phenol and total flavonoid content and also to determine the antioxidant activity in extract of chives leaves with four solvent that have different polarity. This research was conduted experimentally and involved the collection, sample processing, production of extract and phytochemical screening. Simplicia of chives leaves was being extraction by using infusion method with water solvent and another extracts made by maceration method using ethanol, ethyl acetate and n-hexana solvent. Total phenolic content was determined by colorimetric method using Folin-Ciocalteu reagent. Total flavonoid content was determined with colorimetric method using AlCl3 reagent. Antioxidants activity was determined by using DPPH (1,1- diphenyl-2-picrylhydrazil) as a free radical method and was measured by using spectrophotometer UV-Vis.
The determination of total phenolic content was found in extract of ethanol of chives leaves showed the value 111.2839 mg GAE/g extract while total flavonoid content was found in extract of ethyl acetate 34.6390 mg QE/g extract.
The greatest antioxidant activity was found in the extract of ethyl acetate of chives leaves with the value of IC50 was 236.5093 µg/ml.
Keywords : Chives, total phenolic content, total flavonoid content, antioxidant, IC50, DPPH.
DAFTAR ISI
Halaman
JUDUL ... i
HALAMAN JUDUL... ... ii
LEMBAR PENGESAHAN ... iii
KATA PENGANTAR ... iv
SURAT PERNYATAAN... vi
ABSTRAK ... vii
ABSTRACT ... viii
DAFTAR ISI ... ix
DAFTAR TABEL ... xv
DAFTAR GAMBAR ... xvi
DAFTAR GAMBAR DALAM LAMPIRAN ... xvii
DAFTAR LAMPIRAN ... xviii
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Perumusan Masalah ... 4
1.3 Hipotesis ... 4
1.4 Tujuan Penelitian ... 5
1.5 Manfaat Penelitian ... 5
1.6 Kerangka Penelitian ... 6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 7
2.1 Uraian Tumbuhan ... 7
2.1.1 Sistematika Tumbuhan ... 7
2.1.2 Nama Daerah ... 7
2.1.3 Nama Asing ... 7
2.1.4 Morfologi Tumbuhan ... 7
2.1.5 Kandungan Kimia ... 8
2.1.6 Kegunaan Kucai ... 9
2.2 Penelitian Mengenai Tumbuhan Kucai ... 9
2.3 Penelitian Mengenai Tumbuhan yang Berkhasiat sebagai Antioksidan ... 10
2.4 Ekstrak ... 10
2.5 Senyawa Fenol ... 12
2.6 Senyawa Flavonoid ... 12
2.7 Radikal Bebas ... 14
2.8 Antioksidan ... 15
2.9 Metode Pengujian Antioksidan ... 16
2.10 Spektrofotometer UV-Vis ... 18
BAB III METODE PENELITIAN... 20
3.1 Lokasi Penelitian ... 20
3.2 Alat-Alat Dan Bahan ... 20
3.2.1 Alat-alat ... 20
3.2.2 Bahan-bahan ... 20
3.3 Sampel penelitian ... 21
3.3.1 Identifikasi Sampel ... 21
3.3.2 Penyiapan Sampel ... 21
3.4 Pembuatan Pereaksi ... 21
3.4.2 Pereaksi HNO3 0,5 N ... 22
3.4.3 Pereaksi Molisch ... 22
3.4.4 Pereaksi Liebermann-Bouchard ... 22
3.4.5 Pereaksi Mayer ... 22
3.4.6 Pereaksi Dragendorff ... 22
3.4.7 Pereaksi Bouchardat ... 23
3.4.8 Pereaksi HCl 2 N ... 23
3.4.9 Pereaksi FeCl3 10% ... 23
3.4.10 Pereaksi Pb(CH3COO)2 ... 23
3.5 Karakterisasi Simplisia ... 23
3.5.1 Penetapan Kadar Air ... 24
3.5.2 Penetapan Kadar Abu Total ... 25
3.5.3 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut Asam ... 25
3.5.4 Penetapan Kadar Sari Larut Air ... 25
3.5.5 Penetapan Kadar Sari Larut Etanol ... 25
3.6 Skrining Fitokimia ... 26
3.6.1 Pemeriksaan Alkaloid ... 26
3.6.2 Pemeriksaan Glikosida ... 26
3.6.3 Pemeriksaan Saponin ... ... 27
3.6.4 Pemeriksaan Flavonoid ... 27
3.6.5 Pemeriksaan Tanin ... 27
3.6.6 Pemeriksaan Triterpenoid/Steroid ... 28
3.7 Pembuatan Ekstrak ... 28
3.7.1 Pembuatan Infusa Kental 10% Daun Kucai ... 28
3.7.2 Pembuatan Ekstrak Kental Etanol Daun Kucai .... 28 3.7.3 Pembuatan Ekstrak Kental Etil Asetat Daun Kucai 29 3.7.4 Pembuatan Ekstrak Kental n-Heksan Daun Kucai 29 3.8 Penetapan Kadar Total Fenol ... 30 3.8.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Asam Galat ... 30
3.8.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Asam
Galat……. ... 30 3.8.3 Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Galat ... 30 3.8.4 Penetapan Kadar Total Fenol Infusa Kental
Daun Kucai………. ... 31 3.8.5 Penetapan Kadar Total Fenol Ekstrak Kental ..
Daun Kucai………. ... 31 3.9 Penentuan Kadar Total Flavonoid ... 32 3.9.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Kuersetin ... 32 3.9.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Kuersetin ... 32 3.9.3 Pembuatan Kurva Kalibrasi Kuersetin ... 32 3.9.4 Penetapan Kadar Total Flavonoid Infusa Kental
Daun Kucai ... 33 3.9.5 Penetapan Kadar Total Flavonoid Ekstrak Kental
Daun Kucai ... 33 3.10 Pengujian Aktivitas Antioksidan Menggunakan ...
Metode Pemerangkapan Radikal Bebas DPPH ... 33 3.10.1 Prinsip Metode Pemerangkapan Radikal Bebas
(DPPH) ... 33 3.10.2 Pembuatan larutan DPPH 0,5 mM ... 34 3.10.3 Pengukuran panjang gelombang serapan
maksimum DPPH ... 34
3.10.4 Pembuatan Larutan Uji Infusa Kental Daun Kucai ... 34
3.10.5 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Kental Daun Kucai ... 35
3.10.6 Penentuan Persen Pemerangkapan Radikal Bebas DPPH ……… ... 35
3.10.7 Penentuan nilai IC50 ... 35
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 36
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan ... 36
4.2 Karakterisasi Simplisia Daun Kucai ... 36
4.3 Hasil Skrining Fitokimia ... 37
4.4 Hasil Penentuan Kadar Total Fenol ... 38
4.4.1 Waktu Operasional (Operating Time) ... 38
4.4.2 Hasil Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum ... 38
4.4.3 Hasil Penentuan Kurva Serapan Asam Galat ... 39
4.4.4 Hasil Penentuan Kadar Total Fenol pada Infusa Kental dan Ekstrak Kental Daun Kucai ... 40
4.5 Hasil Penetapan Kadar Total Flavonoid ... 41
4.5.1 Waktu Operasional ... 41
4.5.2 Hasil Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum ... 41
4.5.3 Hasil Penentuan Kurva Serapan Baku Kuersetin ... 42
4.5.4 Hasil Penentuan Kadar Total Flavonoid pada ... Infusa Kental dan Ekstrak Kental Daun kucai... ... 43
4.6 Hasil Analisis Aktivitas Antioksidan Infusa Kental
dan Ekstrak Kental Daun Kucai Dengan Metode DPPH 44
4.6.1 Waktu Operasional ... 44
4.6.2 Hasil Penentuan Panjang Gelombang Serapan . Maksimum DPPH ... 44
4.6.3 Hasil Analisis Aktivitas Antioksidan pada Infusa . Kental dan Ekstrak Kental Daun Kucai ... 45
4.6.4 Hasil Analisis Nilai IC50 ... 47
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 49
5.1 Kesimpulan ... 49
5.2 Saran ... 49
DAFTAR PUSTAKA ... 50
LAMPIRAN ... 53
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
2.1 Kandungan Zat Gizi pada Kucai ... 8
2.2 Penelitian Mengenai Khasiat dari Tumbuhan Kucai ... 9
2.3 Penelitian Mengenai Tumbuhan yang Berkhasiat sebagai Antioksidan ... 10
4.1 Hasil Karakterisasi Simplisia Daun Kucai ... 36
4.2 Hasil Skrining Fitokimia Simplisia Daun Kucai ... 37
4.3 Nilai Absorbansi Asam Galat ... 39
4.4 Kadar Total Fenol pada Infusa Kental dan Ekstrak Kental Daun Kucai... ... 40
4.5 Nilai Absorbansi Kuersetin ... 42
4.6 Kadar Total Flavonoid pada Infusa Kental dan Ekstrak Kental Daun Kucai ... 43
4.7 Hasil Uji Aktivitas Persen Peredaman DPPH pada Infusa Kental Daun Kucai………. 45
4.8 Hasil Uji Aktivitas Persen Peredaman DPPH pada Ekstrak Kental Etanol 96% Daun Kucai…...……….……… 46
4.9 Hasil Uji Aktivitas Persen Peredaman DPPH pada Ekstrak Kental Etil Asetat Daun Kucai……….……… 46
4.10 Hasil Uji Aktivitas Persen Peredaman DPPH pada Ekstrak n-Heksan Daun Kucai………….………. ….. 46
4.11 Nilai IC50 dari larutan Infusa Kental 10% Daun Kucai ... 47
4.12 Nilai IC50 dari larutan Ekstrak Kental Etanol Daun Kucai .. 47
4.13 Nilai IC50 dari larutan Ekstrak Kental Etil Asetat Kucai .... 47
4.14 Nilai IC dari larutan Ekstrak Kental n-Heksan Kucai…. .. 47
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1.1 Skema kerangka penelitian ... 6 2.1 Kalkon, Auron dan Flavonoid ... 13 2.2 Reaksi DPPH dengan Antioksidan ... 18 4.1 Kurva panjang gelombang serapan maksimum asam
galat (775 nm) ... 38 4.2 Kurva serapan asam galat ... 39 4.3 Kurva panjang gelombang serapan maksimum kuersetin
(431,5 nm) ... 41 4.4 Kurva serapan kuersetin ... 42 4.5 Kurva panjang gelombang serapan maksimum DPPH
(516 nm) ... 44
DAFTAR GAMBAR DALAM LAMPIRAN
Gambar Halaman
1 Rotary Evaporator ... 54
2 Panci Infusa ... 54
3 Tanaman Kucai ... 55
4 Daun Kucai ... 55
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1 Surat Hasil Identifikasi Tumbuhan ... 53 2 Gambar Alat ... 54 3 Tanaman Kucai ... 55 4 Bagan Alir Penyiapan Sampel dan Karakterisasi Simplisia 56 5 Bagan Alir Pembuatan Infusa dan Ekstrak Daun Kucai ... 57 6 Bagan Alir Penetapan Kadar Total Fenol ... 61 7 Bagan Alir Pengukuran Kandungan Total ... 62 8 Bagan Alir Pengukuran Aktivitas Peredaman
Radikal Bebas DPPH ... 63 9 Perhitungan Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia
Daun Kucai ... 65 10 Perhitungan Persamanan Regresi dari Kurva Serapan
Asam Galat ... 68 11 Hasil Penetapan Kadar Total Fenol pada Infusa Kental
dan Ekstrak Kental Daun Kucai ... 69 12 Contoh Perhitungan Kadar Total Fenol pada Infusa
Kental Daun Kucai ... 71 13 Perhitungan Persamanan Regresi dari Kurva Serapan
Kuersetin ... 72 14 Hasil Penetapan Kadar Total Flavonoid pada Infusa
Kental dan Ekstrak Kental Daun Kucai ... 73 15 Contoh Perhitungan Kadar Total Flavonoid pada Infusa
Kental Daun Kucai ... 75 16 Contoh Perhitungan Persen Peredaman DPPH ... 76 17 Contoh Perhitungan IC50 ... 77
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Sumber daya alam bahan obat dan obat tradisional merupakan aset nasional yang perlu digali, diteliti, dikembangkan dan dioptimalkan pemanfaatannya. Sebagai suatu negara dengan wilayah yang mempunyai tingkat keanekaragaman hayati yang tinggi, potensi sumber daya tumbuhan yang ada merupakan aset dengan nilai keunggulan komparatif dan sebagai modal dasar utama dalam upaya pemanfaatan dan pengembangannya untuk menjadi komoditi yang kompetitif (Kepmenkes RI, 2007).
Kucai (Allium schoenoprasum L.) merupakan salah satu tanaman di Indonesia yang sering dikonsumsi oleh masyarakat. Seluruh bagian dari tanaman kucai dapat dimakan (dari pucuk hingga bulbusnya). Bunga kucai dapat digunakan sebagai rempah penyedap. Aromanya yang sedap membuat kucai menjadi salah satu bumbu masakan yang favorit (Andarwulan dan Faradilla, 2012). Selain sebagai sumber pangan, daun kucai juga dapat digunakan sebagai tanaman obat, di mana daun kucai dimakan untuk membersihkan parasit dalam usus, meningkatkan sistem kekebalan tubuh, menstimulasi pencernaan dan mengobati anemia (Al-Snafi, 2013).
Daun kucai mengandung zat gizi seperti kalori, protein, lemak, karbohidrat, kalsium, fosfor, besi dan vitamin (Andarwulan dan Faradilla, 2012).
Daun kucai juga mengandung berbagai senyawa fitokimia antara lain alkaloid, flavonoid, glikosida, steroid dan tanin (Al-Snafi, 2013). Kandungan zat non-gizi
pada kucai seperti senyawa flavonoid dan komponen zat non-gizi lainnya yang penggunaannya kebanyakan sebagai tanaman obat yang berfungsi sebagai antioksidan (Andarwulan dan Faradilla, 2012). Flavonoid merupakan turunan senyawa fenol yang umumnya memiliki sifat analgetik, antiinflamasi, meningkatkan mortilitas usus, antimikroba, dan lainnya (Andarwulan dan Faradilla, 2012).
Kandungan total fenol dari daun kucai dapat ditetapkan kadarnya yang setara dengan asam galat (Gallic acid Equivalent/GAE) dengan menggunakan reagen Folin-Ciocalteau di medium alkali yang mengakibatkan fenol mengalami reaksi redoks kompleks dengan asam phosphomolibdat pada reagen Folin- Ciocalteau membentuk larutan berwarna biru kompleks yang dapat diukur dengan spektrofotometer UV-Vis (Geng, dkk., 2015).
Sedangkan kandungan total flavonoid dari daun kucai dapat ditetapkan kadarnya setara dengan kuersetin (Quercetine Equivalent/QE) dengan metode kolorimetrik dengan menggunakan Aluminium klorida (AlCl3), di mana AlCl3 akan membentuk kompleks stabil dari senyawa flavon (Bhaigyabati, dkk., 2014).
Penetapan kadar total fenol dan total flavonoid dari daun kucai dibuat dari ekstrak daun kucai dengan menggunakan pelarut yang berbeda berdasarkan kepolarannya, dari yang paling polar yaitu air, etanol, etil asetat dan n-heksana.
Untuk pelarut air digunakan dalam proses infusa simplisia daun kucai sedangkan pada pelarut lainnya menggunakan metode maserasi untuk mendapatkan ekstrak kental. Berdasarkan studi literatur yang dilakukan belum diketahui sifat senyawa fenol dan flavonoid yang terdapat dalam daun kucai sehingga digunakan beberapa jenis pelarut yang berbeda kepolarannya. Penggunaan pelarut yang memiliki
perbedaan kepolaran dikarenakan tiap jenis fenol dan flavonoid memiliki kelarutan yang berbeda-beda tergantung kepada jumlah dan posisi gugus hidroksil. Beberapa jenis flavonoid seperti rutin terlarut dalam pelarut polar, kuersetin dalam pelarut semipolar dan sinersetin pelarut non polar (Suryani, dkk., 2015).
Senyawa flavonoid memiliki potensi sebagai antioksidan. Antioksidan adalah suatu senyawa atau komponen kimia yang dalam kadar atau jumlah tertentu mampu menghambat atau memperlambat kerusakan akibat proses oksidasi (Sayuti dan Yenrina, 2015).
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan berbagai metode, salah satunya yaitu Electron Transfer Methods (ET), misalnya Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) dan 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH) Free Radical Scavenging Assay. Pada umumnya metode yang sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan adalah dengan menggunakan radikal bebas DPPH karena metode ini sederhana, cepat dan tidak membutuhkan banyak reagen seperti halnya metode lain (Sayuti dan Yenrina, 2015).
Pengukuran absorbansi peredaman DPPH dilakukan dengan mengggunakan spektrofotometer UV-Vis (400-800 nm), kemudian hasil absorbansi diinterpretasikan ke dalam nilai IC50 (Inhibitory Concentration of 50%) di mana IC50 ini menunjukkan konsentrasi substrat yang mampu meredam 50% aktivitas dari radikal bebas DPPH (Molyneux, 2004).
Berdasarkan uraian diatas, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui kadar total fenol dan total flavonoid yang terkandung di dalam ekstrak daun kucai dengan pelarut yang berbeda serta pengaruhnya terhadap aktivitas senyawa yang
terkandung di dalam ekstrak daun kucai sebagai antioksidan dengan metode peredaman radikal bebas DPPH yang diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
1.2 Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, maka perumusan masalah pada penelitian ini adalah :
a. Golongan senyawa kimia apa saja yang terkandung pada simplisia daun kucai?
b. Apakah penggunaan pelarut yang berbeda dalam pembuatan ekstrak daun kucai mempengaruhi kandungan total fenol dan total flavonoid dari daun kucai?
c. Apakah kandungan total fenol dan total flavonoid dalam ekstrak daun kucai dengan pelarut yang berbeda dapat menunjukkan hasil peredaman aktivitas radikal bebas yang berbeda?
1.3 Hipotesis
Berdasarkan perumusan masalah di atas, maka hipotesis pada penelitian ini adalah :
a. Golongan senyawa kimia yang terkandung dalam simplisia daun kucai adalah alkaloid, flavonoid, glikosida, saponin, tanin, dan triterpenoid/steroid.
b. Ekstrak daun kucai dengan pelarut yang lebih polar menunjukkan kandungan total fenol dan total flavonoid yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak dengan pelarut lainnya.
c. Semakin tinggi kadar total fenol dan total flavonoid dalam ekstrak maka semakin tinggi aktivitas peredaman radikal bebas DPPH.
1.4 Tujuan Penelitian
Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah :
a. Untuk mengetahui kandungan senyawa kimia yang terdapat dalam simplisia daun kucai.
b. Untuk mengetahui pengaruh kepolaran pelarut terhadap kandungan total fenol dan total flavonoid dari ekstrak daun kucai.
c. Untuk mengetahui pengaruh kandungan total fenol dan total flavonoid ekstrak daun kucai dalam pelarut yang berbeda terhadap aktivitas peredaman radikal bebas DPPH.
1.5 Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah diharapkan hasil penelitian ini dapat memberikan informasi dalam perkembangan farmasi khususnya di bidang penemuan obat-obatan tradisonal yang baru sebagai antioksidan.
1.6 Kerangka Pemikiran
Daun Kucai
Simplisia daun Kucai
Infusa dan Ekstrak daun Kucai (air, etanol, etil- asetat, n-heksan)
Skrining Fitokimia
Kandungan Total Fenol
Kandungan Total Flavonoid
1. Alkaloid 2. Glikosida 3. Flavonoid 4. Saponin 5. Tanin 6. Steroid/
Triterpenoid
Uji Aktivitas Antioksidan dengan
metode peredaman radikal bebas (DPPH)
Nilai IC50
Gambar 1.1 Skema Kerangka Pemikiran
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Uraian Tumbuhan 2.1.1 Sistematika Tumbuhan
Menurut Anonim (2018) sistematika tumbuhan kucai adalah sebagai berikut:
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta Class : Monocotyledoneae Ordo : Liliales
Famili : Liliaceae Genus : Allium
Spesies : Allium schoenoprasum L.
2.1.2 Nama Daerah
Lokio (Melayu), ganda isi (Palembang), langkio dan kucai (Sunda, Jawa) (Badan POM RI, 2008).
2.1.3 Nama Asing
Chivet, cive garlic, chive (Inggris); patzia (Cekoslovakia); ciboullete (Perancis); schnittlauch (Jerman); cipoletta (Italia); cebollino (Spanyol); purlog (Denmark); bislook (Belanda) (Badan POM RI, 2008).
2.1.4 Morfologi Tumbuhan
Tumbuhan kucai umumnya memiliki tinggi sekitar 15-50 cm, membentuk rumpun, dan berumbi. Daun kucai berwarna hijau, ramping, pipih dan
memanjang, serta memiliki aroma yang tajam. Bunga kucai berwarna putih dan ungu (Andarwulan dan Faradilla, 2012). Daun kucai berbentuk bulat dan biasanya bertekstur halus. Bagian umbi kucai berwarna putih dengan ukuran yang kecil dan bulat memanjang (Badan POM RI, 2008).
2.1.5 Kandungan Kimia
Kucai mengandung senyawa fitokimia seperti alkaloid, fenol, flavonoid glikosida yang merupakan sumber biofarmaka dalam pengembangan tanaman obat modern (Al-Snafi, 2013). Kandungan zat non-gizi pada kucai seperti senyawa flavonoid dari golongan flavonol (kuersetin dan kaemferol) serta flavon (mirisetin) dan komponen zat non-gizi lainnya yang penggunaannya kebanyakan sebagai tanaman obat yang berfungsi sebagai antioksidan (Andarwulan dan Faradilla, 2012).
Selain kandungan tersebut, kucai juga mengandungan zat gizi. Kandungan zat gizi pada kucai dapat dilihat pada Tabel 2.1
Tabel 2.1 Kandungan zat gizi pada Kucai
Komponen zat gizi Kandungan per 100 g
Kalori 45 cal
Protein 2,2 g
Lemak 0,3 g
Karbohidrat 10,3 g
Kalsium 52 mg
Fosfor 50 mg
Besi 1,1 mg
Aktivitas Vitamin A 40 I.U.
Tiamin (Vitamin B1) 0,11 mg
Asam askorbat (Vitamin C) 17 mg
Air 83,4 %
Sumber : Andarwulan dan Faradilla (2012).
2.1.6 Kegunaan Kucai
Seluruh bagian dari tumbuhan kucai dapat dimakan (dari pucuk hingga bawangnya). Daun kucai yang beraroma tajam dan pekat dapat dicacah dan dicampurkan dengan masakan seperti telur dadar. Bunga kucai dapat digunakan sebagai rempah penyedap (Andarwulan dan Faradilla 2012).
Kucai juga dimanfaatkan masyarakat Indonesia untuk mengatasi keputihan, darah tinggi, sembelit, meningkatkan sistem kekebalan tubuh, membunuh kuman bakteri dalam usus, mengobati anemia serta memiliki khasiat melancarkan aliran darah dan menghindari pembekuan darah (Andarwulan dan Faradilla, 2012; Al-Snafi, 2013).
2.2 Penelitian Mengenai Tumbuhan Kucai
Terdapat beberapa penelitian mengenai khasiat dari tumbuhan kucai yang dapat dilihat pada Tabel 2.2.
Tabel 2.2 Penelitian mengenai khasiat dari tumbuhan Kucai Bagian yang
digunakan Bahan Uji Khasiat Rujukan
Semua bagian Ekstrak Antioksidan Al-Snafi, 2013 Semua bagian Ekstrak Antioksidan Lenkova, dkk., 2016
Bulbus Ekstrak Antihipertensi Amalia, dkk., 2008
Daun Ekstrak Antimikroba
Ervianingsih dan Razak, A., 2017 Umbi Ekstrak Antimikroba Sihombing, D. R., 2014 Daun Ekstrak Antilithogenesis Hutabalian, 2018 Daun Infusa Antilithogenesis Wardhany, S., 2018
2.3 Penelitian Mengenai Tumbuhan yang Berkhasiat sebagai Antioksidan Penelitian dari berbagai tumbuhan yang berkhasiat sebagai antioksidan dapat dilihat pada Tabel 2.3.
Tabel 2.3 Penelitian dari berbagai tumbuhan yang berkhasiat sebagai antioksidan
Tumbuhan Bahan Uji Metode Rujukan
Bawang putih
(Allium sativum) Ekstrak DPPH
Lenkova, dkk., 2016 Bawang merah
(Allium cepa) Ekstrak DPPH Bawang prei
(Allium porrum) Ekstrak DPPH Al-Snafi, 2013 Bawang putih
(Allium sativum) Ekstrak DPPH
Sinaga, G., 2016 Bawang Batak
(Allium chinense) Ekstrak DPPH
2.4 Ekstrak
Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif yang terdapat dalam simplisia menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian pelarut akan diuapkan dan massa yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim, 2000).
Terdapat beberapa metode ekstraksi dengan menggunakan pelarut, yaitu:
i. Cara dingin
a. Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan.
Maserasi kinetik berarti dilakukan pengadukan secara terus-menerus.
Remaserasi adalah pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya (Anonim, 2000).
b. Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan. Proses terdiri dari pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak) secara terus menerus sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlah satu sampai lima kali dari bahan (Anonim, 2000).
ii. Cara panas
a. Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut tertentu pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dengan jumlah pelarut yang terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Proses pengulangan dilakukan pada residu pertama sebanyak tiga sampai lima kali hingga proses ekstraksi sempurna (Anonim, 2000).
b. Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi terus-menerus dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik (Anonim, 2000).
c. Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan terus-menerus) pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-500C (Anonim, 2000).
d. Infusa adalah ekstraksi dengan pelarut air di mana bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih dengan temperatur 900C selama 15 menit (Anonim, 2000).
e. Dekoktasi adalah infus pada waktu yang lebih lama (lebih dari 30 menit) dan temperatur sampai titik didih air (Anonim, 2000).
2.5 Senyawa Fenol
Senyawa fenol adalah senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus hidroksil yang menempel di cincin aromatik. Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air karena umumnya sering kali berikatan dengan gula sebagai glikosida, dan biasanya terdapat dalam vakuola sel. Flavonoid merupakan salah satu golongan terbesar fenol (Harborne, 1984).
Salah satu contoh senyawa fenolat adalah asam galat yang banyak terdapat pada tumbuhan berkayu, merupakan senyawa yang sangat reaktif (Harborne, 1984).
2.6 Senyawa Flavonoid
Flavonoid terdistribusi luas pada tanaman. Flavonoid merupakan kandungan khas tumbuhan yang terdapat hampir pada semua bagian tumbuhan seperti daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, nectar, bunga dan biji. Flavonoid memiliki peranan yang cukup beragam pada tanaman, mulai dari memproduksi pigmen berwarna kuning, merah, atau biru pada bunga, hingga sebagai penangkal terhadap mikroba dan insekta (Andarwulan dan Faradilla, 2012).
Flavonoid biasanya terdapat dalam sebagai flavonoid O-glikosida; pada senyawa tersebut terdapat satu gugus hidroksil flavonoid (atau lebih) terikat pada satu gula (atau lebih) dengan ikatan hemiasetal yang tak tahan asam. Pengaruh glikosilasi menyebabkan flavonoid menjadi kurang reaktif dan lebih mudah larut dalam air; sifat terakhir ini memungkinkan penyimpanan flavonoid di dalam vakuola sel (Markham, 1982).
Senyawa flavonoid merupakan salah satu senyawa polifenol yang memiliki struktur dasar terdiri atas 15 atom C (C6-C3-C6), dimana dua cincin aromatik yang dihubungkan oleh satuan karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga (Harborne, 1984).
Berdasarkan perbedaan struktur C3 yang mengikat dua gugus benzen, flavonoid dapat dibagi menjadi tiga jenis. Ketiga jenis tersebut adalah kalkon, auron, dan flavonoid (Andarwulan dan Faradilla, 2012). Gambar struktur kalkon, auron dan flavonoid dapat dilihat pada Gambar 2.1.
Gambar 2.1 (i) Kalkon; (ii) Auron dan (iii) Flavonoid (Andarwulan dan Faradilla, 2012).
Kuersetin (3,4-dihidroksiflavonol) merupakan senyawa flavonoid dari kelompok flavonol dan terdapat terutama pada tanaman teh, tomat, apel, kakao, anggur dan bawang. Kuersetin dapat memberikan manfaat sebagai pemusnah radikal bebas jika dikonsumsi dalam jumlah yang cukup (50-200 mg per hari) sehingga dapat mencegah penuaan dini (Kosasih, dkk., 2004).
(i) (ii)
(iii)
2.7 Radikal Bebas
Radikal bebas adalah atom atau molekul dengan susunan elektron yang tidak lengkap atau tidak berpasangan sehingga bersifat tidak stabil dan memiliki kecenderungan kuat untuk berpasangan. Proses ini terjadi berantai sehingga menyebabkan kerusakan biologik seperti disfungsi sel yang diikuti inflamasi dan akhirnya menjadi penyakit degeneratif (Kosasih, dkk., 2004).
Radikal bebas dapat digolongkan menjadi radikal bebas endogen dan radikal bebas eksogen.
i. Radikal bebas endogen
Radikal bebas endogen adalah radikal bebas dari hasil samping reaksi biokimia dalam tubuh. Makhluk hidup menghasilkan energi dari hasil metabolisme dengan mengoksidasi zat zat makanan seperti karbohidrat, lemak dan protein. Dalam proses oksidasi ini terbentuk radikal bebas dan ROS (Reactive Oxidative Species), yaitu anion superoksid dan hidroksi radikal. Radikal bebas dan ROS mudah menempel pada sel-sel tubuh dan merusak dengan mengambil satu elektron dari sel-sel tubuh (Kosasih, dkk., 2004).
ii. Radikal bebas eksogen
Radikal bebas eksogen adalah radikal bebas yang terbentuk karena pengaruh dari luar tubuh. Bahan dasar radikal bebas masuk ke dalam tubuh meliputi obat-obatan (kemoterapeutika), udara (pestisida, polusi udara, asap rokok, minuman beralkohol). Sinar ultraviolet juga dapat menyebabkan radikal bebas jika sinar tersebut menerpa suatu benda terus-menerus yang menyebabkan elektron atom benda tersebut melompat dari orbitnya. Radikal bebas juga
diperoleh karena rokok baik perokok aktif maupun perokok pasif (sekunder) (Kosasih, dkk., 2004).
2.8 Antioksidan
Antioksidan adalah zat yang dapat menetralisir radikal bebas sehingga atom dengan elektron yang tidak berpasangan mendapat pasangan elektron sehingga tidak reaktif lagi sehingga melindungi tubuh dari beragam penyakit degeneratif (Kosasih, dkk., 2004).
Antioksidan dapat dibedakan menjadi dua, yaitu antioksidan internal dan antioksidan eksternal. Antioksidan internal adalah antioksidan yang diproduksi oleh tubuh sendiri. Secara alami tubuh mampu menghasilkan antioksidan sendiri, kemampuan tubuh untuk memproduksi antioksidan alami akan semakin berkurang dengan bertambahnya usia. Contoh antioksidan internal adalah Super Oxide Dismutase (SOD), enzim Glutathion Peroxide, dan enzim katalase. Antioksidan eksternal adalah antioksidan yang diperoleh dari luar tubuh, seperti melalui asupan makanan yang mengandung antioksidan seperti vitamin C, vitamin E, Beta Karoten, dan senyawa flavonoid seperti isoflavon yang terdapat dalam kedelai dan produk makanan dari kedelai (Sayuti dan Yenrina, 2015; Kosasih, dkk., 2004).
Berdasarkan fungsi dan mekanisme kerjanya, antioksidan dapat dibedakan menjadi tiga jenis, yaitu:
a. Antioksidan primer, bekerja mencegah pembentukan senyawa radikal baru, yaitu dengan mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul yang berkurang dampak negatifnya sebelum senyawa radikal bebas bereaksi.
Antioksidan primer mengikuti mekanisme pemutusan rantai (chain-breaking
antioxidant) reaksi radikal dengan mendonorkan atom hidrogen secara cepat pada suatu lipid yang radikal, produk yang dihasilkan lebih stabil dari produk awal. Contohnya Superoksida Dismutase (SOD), Glutathion Peroxide (GPx), katalase dan protein pengikat logam. (Sayuti dan Yenrina, 2015).
b. Antioksidan sekunder, berperan sebagai pengikat ion-ion logam, penangkap oksigen, pengurai hidroperoksida menjadi senyawa non-radikal, penyerap radiasi UV atau deaktivasi singlet oksigen. Contohnya vitamin E, vitamin C, beta-karoten, isoflavon, bilirubin dan albumin. Potensi antioksidan ini dengan cara memotong reaksi oksidasi berantai radikal bebas atau dengan cara menangkapnya (scavenger free radical) (Sayuti dan Yenrina, 2015).
c. Antioksidan tersier, bekerja memperbaiki kerusakan biomolekul yang disebabkan oleh serangan radikal bebas. Contoh antioksidan tersier adalah enzim-enzim yang memperbaiki DNA dan metionin sulfida reduktase (Sayuti dan Yenrina, 2015).
2.9 Metode Pengujian Antioksidan
Metode untuk menentukan kadar total fenol pada ekstrak tumbuhan yang merujuk pada prosedur (Geng, dkk., 2015) menggunakan metode kolorimetrik dengan reagen Folin-Ciocalteau. Senyawa fenol direaksikan dengan reagen Folin- Ciocalteau dalam suasana basa, gugus hidroksil pada senyawa fenolik akan bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteau membentuk kompleks molibdeum- tungsten berwarna biru dan dapat dideteksi dengan spektrofotometer.
Metode untuk menentukan total flavonoid adalah dengan metode kolorimetrik menggunakan reagen Aluminium klorida (AlCl3). AlCl3 akan
membentuk asam kompleks yang stabil dengan C-4 kelompok keto dan baik C-3 atau C-5 gugus hidroksil dari flavon (Bhaigyabati, dkk., 2014).
Metode pengujian aktivitas antioksidan dikelompokkan menjadi tiga golongan. Golongan pertama adalah Hydrogen Atom Transfer Methods (HAT), misalnya Oxygen Radical Absorbance Capacity Method (ORAC) dan Lipid Peroxidation Inhibition Capacity Assay (LPIC). Golongan kedua adalah Electron Transfer Methods (ET), misalnya Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) dan 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH) Free Radical Scavenging Assay. Golongan ketiga misalnya Total Oxidant Scavenging Capacity (TOSC) dan Chemiluminescence (Sayuti dan Yenrina, 2015).
Metode yang paling umum digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan adalah menggunakan radikal bebas 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH). Pengukuran antioksidan dengan metode DPPH karena sederhana, cepat dan tidak membutuhkan banyak reagen seperti halnya metode lain (Sayuti dan Yenrina, 2015).
Larutan DPPH akan bereaksi dengan senyawa antioksidan sehingga DPPH akan berubah menjadi non-radikal. Peredaman radikal bebas DPPH akan ditandai dengan berubahnya warna ungu tua menjadi warna merah muda atau kuning pucat dan dapat diamati dan diukur menggunakan spektrofotometer sehingga aktivitas peredaman radikal bebas oleh sampel dapat ditentukan (Molyneux, 2004).
Parameter yang digunakan untuk menunjukkan aktivitas antioksidan adalah nilai konsentrasi efektif atau Effect Concentration (EC50) atau Inhibition Concentration (IC50) yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang menyebabkan 50% dari DPPH kehilangan sifat radikal atau konsentrasi zat antioksidan yang
memberikan % peredaman sebesar 50%. Zat yang mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi, mempunyai nilai IC50 yang rendah (Molyneux, 2004).
Prinsip pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH adalah mengukur daya peredaman sampel (ekstrak) terhadap radikal bebas DPPH. DPPH akan bereaksi dengan atom hidrogen dari senyawa peredaman radikal bebas membentuk DPPH yang lebih stabil. Senyawa peredaman radikal bebas yang bereaksi dengan DPPH akan menjadi radikal baru yang lebih stabil atau senyawa bukan radikal (Sayuti dan Yenrina, 2015).
Reaksi DPPH dengan antioksidan dapat dilihat pada Gambar 2.2.
Gambar 2.2 Reaksi DPPH dengan antioksidan (Sayuti dan Yenrina, 2015).
2.10 Spektrofotometer UV-Vis.
Spektrofotometri serapan adalah pengukuran serapan radiasi elektromagnet panjang gelombang tertentu yang sempit, mendekati monokromatik, yang diserap zat. Pengukuran serapan dapat dilakukan pada daerah ultraviolet dengan panjang gelombang 190 nm - 380 nm atau pada daerah cahaya tampak (Visibel) dengan panjang gelombang 380 nm – 780 nm (Ditjen
Penetapan kadar sampel dengan spektrofotometer UV-Vis adalah dengan menggunakan perbandingan absorbansi sampel dengan absorbansi baku, atau dengan menggunakan persamaan regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi baku dengan absorbansinya. Persamaan kurva baku selanjutnya digunakan untuk menghitung kadar dalam sampel (Rohman, 2007).
Menurut Rohman (2007), spektrofotometer yang sesuai untuk pengukuran di daerah spektrum ultraviolet dan sinar tampak. Komponen- komponen dalam spektrofotometer UV-VIS meliputi sumber-sumber lampu, monokromator dan sistem optik.
(i) Sumber-sumber lampu
Sumber lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada panjang gelombang 190-350 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel (sinar tampak) pada panjang gelombang antara 350-900 nm.
(ii) Monokromator
Monokromator digunakan untuk mendispersikan sinar ke dalam komponen- komponen panjang gelombangnya yang selanjutnya akan dipilih oleh celah (slit).
(iii) Optik-optik
Optik dapat dibentuk untuk memecah sumber sinar sehingga sumber sinar melewati 2 kompartemen, dan sebagaimana dalam spektrofotometer berkas ganda (double beam), suatu larutan blanko dapat digunakan dalam satu kompartemen untuk mengkoreksi pembacaan atau spektrum sampel, biasanya berupa pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel atau pereaksi.
BAB III
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental yang terdiri dari variabel terikat yaitu penetapan kadar total fenol dan total flavonoid dengan variabel bebas menggunakan pelarut yang berbeda serta pengujian aktivitas senyawa antioksidan menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
3.1 Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fitokimia dan Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, pada bulan Januari 2018 sampai April 2018.
3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat - alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas laboratorium, blender, rotary evaporator, cawan penguap, spot plate, stopwatch, panci infus, krus porselin, oven listrik, lemari pengering, neraca analitik, penangas air, spektrofotometer UV-Vis. Dapat dilihat pada Lampiran 2.
3.2.2 Bahan – bahan
Bahan- bahan kimia lainnya seperti DPPH (Sigma), asam galat, reagen Folin-Ciocalteau (Sigma), kuersetin (Sigma). Produksi E-Merck: amil alkohol, asam asetat anhidrida, asam klorida, asam nitrat, asam sulfat, serbuk magnesium, kalium iodida, natrium karbonat (Na2CO3), akuades, etil-asetat, etanol, n-heksan, natrium asetat (CH3COONa), AlCl3, metanol.
3.3 Sampel Penelitian
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun kucai dari Pasar Baru, Perbaungan, Provinsi Sumatera Utara. Foto tanaman kucai dapat dilihat pada Lampiran 3.
3.3.1 Identifikasi Sampel
Identifikasi daun kucai dilakukan di Herbarium Medanense, Laboratorium Fakultas Matematika dan Ilmu Penegtahuan Alam (FMIPA) Universitas Sumatera Utara.
3.3.2 Penyiapan Sampel
Daun kucai yang telah dikumpulkan, dibersihkan dari pengotornya, selanjutnya dicuci dibawah air mengalir beberapa kali hingga bersih, kemudian ditiriskan lalu disebarkan diatas perkamen sampai merata hingga airnya terserap, setelah itu dipisahkan antara daun dan bulbusnya, daun dipotong-potong, dimasukkan ke dalam lemari pengering pada suhu ± 400C selama 5 hari, kemudian simplisia dihaluskan dan disimpan dalam wadah plastik untuk mencegah pengaruh lembab dan pengotor lainnya. Simplisia yang dihasilkan dibagi menjadi lima bagian yaitu untuk skrining fitokimia, pembuatan infusa 10%
daun kucai, ekstrak etanol 96% daun kucai, ekstrak etil-asetat daun kucai, dan ekstrak n-heksan daun kucai. Untuk lebih jelas dapat dilihat bagan alir penyiapan sampel dan karakterisasi simplisia pada Lampiran 4.
3.4 Pembuatan Pereaksi
Pembuatan pereaksi yang digunakan dalam penelitian ini meliputi peraksi asam sulfat (H2SO4) 2 N, asam nitrat (HNO3) 0,5 N, Liebermann-Bouchard,
Molisch, Mayer, besi (III) klorida (FeCl3) 10%, Dragendorff, Bouchardat, natrium hidroksida (NaOH) 2 N, timbal (II) asetat /Pb(CH3COO)2 0,4 M, asam klorida HCl 2 N (Depkes RI, 1995).
3.4.1 Pereaksi H2SO4 2 N
Sebanyak 5,5 mL H2SO4 pekat diencerkan dengan akuades hingga volume 100 mL (Dekpkes RI, 1995).
3.4.2 Pereaksi HNO3 0,5 N
Sebanyak 4,2 mL HNO3 diencerkan dengan akuades hingga diperoleh volume larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.3 Pereaksi Molisch
Sebanyak 3 gram α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam HNO3 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.4 Pereaksi Liebermann-Bouchard
Sebanyak 5 mL CH3COOH anhidrida dicampurkan perlahan dengan 5 mL H2SO4 pekat dan ditambahkan etanol hingga 50 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.5 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,359 gram HgCl2 ditimbang dan dilarutkan dalam akuades hingga diperoleh volume larutan 60 mL. Sebanyak 5 gram KI ditimbang, dilarutkan dalam 10 mL akuades pada wadah yang berbeda, kemudian kedua larutan dicampurkan dalam satu wadah. Campuran larutan tersebut ditambahkan akuades hingga diperoleh volume larutan sebanyak 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.6 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8 gram Bi(NO)3 ditimbang dan dilarutkan ke dalam 20 mL HNO3 pekat. Dilarutkan 27,2 gram KI dalam 50 mL akuades pada wadah lain.
Kedua larutan tersebut dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna.
Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan akuades hingga diperoleh larutan dengan volume 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.7 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 gram KI dilarutkan dalam akuades, kemudian 2 gram iodium dilarutkan dalam larutan kalium iodide dan dicukupkan dengan akuades hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.8 Pereaksi HCl 2 N
Sebanyak 17 mL HCl pekat ditambahkan dengan akuades hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.9 Pereaksi FeCl3 10%
Sebanyak 10 gram FeCl3 ditimbang dan dilarutkan dalam akuades hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.10 Peraksi Pb(CH3COO)2 0,4 M
Sebanyak 15,17 gram Pb(CH3COO)2 dilarutkan dalam akuades bebas CO2 hingga 100 mL (Depkes RI,1995).
3.5 Karakterisasi Simplisia
Karaterisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu tidak larut dalam asam, penetapan kadar sari larut dalam air dan penetapan kadar sari larut dalam etanol (WHO, 1998).
3.5.1 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi (destilasi toluen).
Metode ini menggunakan alat destilasi, terdiri dari labu alas bulat 500 mL, tabung penyambung, hot plate, pendingin bola, sirkulator, tabung penerima 10 mL.
a. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 mL toluen dan 2 mL akuades dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang tabung penyambung, alat penambung dan pendingin bola, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air di dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 mL dan dicatat.
b. Penetapan kadar air pada simplisia
Ditimbang simplisia sebanyak 5 gram dan dimasukkan ke dalam labu alas bulat yang berisi penjenuhan toluen tersebut, labu dipanaskan kembali selama 15 menit. Ketika toluen mulai mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes per detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian dinaikkan kecepatan tetesan menjadi 4 tetes per detik. Ketika semua air telah terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Air dan toluen memisah sempurna, volume air dapat dibaca dengan ketelitian 0,05 mL. Selisih dari kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat di dalam sampel. Kadar air dihitung dalam persen terhadap berat simplisia yang ditimbang (WHO, 1998).
3.5.2 Penetapan Kadar Abu Total
Ditimbang simplisia yang sudah digerus sebanyak 2 gram, dimasukkan ke dalam krus porselin yang telah lebih dahulu dipijarkan dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijarkan sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung dalam persen terhadap berat simplisia yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 1995).
3.5.3 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut Asam
Dididihkan abu yang diperoleh dari penetapan kadar abu dengan 25 mL HCl encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring dengan kertas saring bebas abu, dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijar sampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 1995).
3.5.4 Penetapan Kadar Sari Larut Air
Ditimbang serbuk simplisia sebanyak 5 gram, dimaserasi selama 24 jam dengan 100 mL air-kloroform (2,5 mL kloroform dalam air hingga 1 liter) menggunakan labu bersumbat sambil dikocok sekali-kali selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak 20 mL filtrat diuapkan dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 1050C hingga bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 1995).
3.5.5 Penetapan Kadar Sari Larut Etanol
Ditimbang sebanyak 5 gram serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dengan 100 mL etanol (96%) menggunakan labu tersumbat sambil dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak 20 mL
filtrat diuapkan dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 1050C hingga bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 1995).
3.6 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia daun kucai meliputi pemeriksaan senyawa alkaloid, glikosida, saponin, flavonoid, tanin dan steroid/triterpenoid.
3.6.1 Pemeriksaan Alkaloid
Sebanyak 0,5 gram simplisia ditambahkan 1 mL HCl 2 N dan 9 mL air suling. Dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring.
Filtrat dipakai untuk uji alkaloid sebagai berikut :
a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer akan terbentuknya endapan menggumpal berwarna putih atau kuning.
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai kehitaman.
c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan dengan 2 tetes larutan peraksi Dragendorff, akan terbentuk endapan berwarna merah atau jingga.
Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percobaan diatas (Depkes RI, 1995).
3.6.2 Pemeriksaan Glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 gram kemudian disari dengan 30 mL campuran 7 bagian volume etanol 96% dan 3 bagian volume air suling ditambahkan dengan 10 mL HCl 2 N. Direfluks selama 30 menit, lalu didinginkan dan disaring. Diambil 20 mL filtrat ditambahkan 25 mL air suling dan 25 mL
Pb(CH3COO)2 0,4 M, lalu dikocok selama 5 menit dan disaring. Filtrat disari dengan 20 mL campuran 3 bagian kloroform dan 2 isopropanol dilakukan berulang sebanyak tiga kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50oC. Sisa dilarutkan dalam 2 mL air suling dan 5 tetes pereaksi Molish, kemudian secara perlahan ditambahkan 2 mL H2SO4 pekat. Glikosida positif jika terbentuk cincin ungu (Depkes RI, 1995).
3.6.3 Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 0,5 gram sampel simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 mL air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat- kuat selama 10 detik, timbul busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm, ditambahkan 1 tetes HCl 2 N, bila buih tidak hilang menunjukkan adanya saponin (Depkes RI, 1995).
3.6.4 Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 10 gram serbuk simplisia kemudian ditambahkan 100 mL air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, filtrat yang diperoleh kemudian diambil 5 mL lalu ditambahkan 0,1 gram serbuk Mg dan 1 mL HCl pekat dan 2 mL amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol (Farnsworth, 1996).
3.6.5 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0,5 gram sampel disari dengan 10 mL air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 mL larutan filtrat lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi FeCl3. Adanya warna biru/ hijau kehitaman menunjukkan senyawa tanin (Farnsworth, 1996).
3.6.6 Pemeriksaan Stereoid/Triterpenoid
Sebanyak 1 gram sampel dimaserasi dengan n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap, pada sisa ditambahkan 2 tetes CH3COOH anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat. Timbul warna biru/hijau menunjukkan adanya steroid dan timbul warna merah, pink atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid (Farnsworth, 1996).
3.7 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak yang menggunakan pelarut akuades digunakan metode infusa sedangkan untuk pelarut lainnya menggunakan metode maserasi. Bagan alir pembuatan infusa dan ekstrak daun kucai dapat dilihat pada Lampiran 5.
3.7.1 Pembuatan Infusa Kental 10% Daun Kucai
Ditimbang seksama 100 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam panci infusa kemudian ditambahkan dengan akuades hingga 1000 mL untuk mendapatkan konsentrasi 10%, dipanaskan pada suhu 900C selama 15 menit sambil diaduk sesekali, diserkai selagi panas dengan kain flanel, dibilas dengan akuades panas hingga diperoleh volume infusa 1000 mL (Depkes RI, 1995).
Filtrat hasil infusa diuapkan di atas penangas air dengan suhu sekitar 60-700C hingga dihasilkan infusa kental.
3.7.2 Pembuatan Ekstrak Kental Etanol 96% Daun Kucai
Ditimbang serbuk simplisia sebanyak 200 gram kemudian dimasukkan ke dalam wadah kaca, dimasukkan 1500 mL etanol 96%, ditutup wadah kaca dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya dan sesekali diaduk. Setelah 5 hari, maserat disaring, dicuci ampas dengan etanol 96% secukupnya hingga diperoleh
2000 mL, lalu dipindahkan dalam bejana tertutup dan dibiarkan di tempat yang sejuk dan terhindar dari matahari selama 2 hari, kemudian dienap-tuangkan dan disaring. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 700C sampai diperoleh maserat pekat (Ditjen POM, Depkes RI, 1979).
3.7.3 Pembuatan Ekstrak Kental Etil Asetat Daun Kucai
Ditimbang serbuk simplisia sebanyak 200 gram kemudian dimasukkan ke dalam wadah kaca, dimasukkan 1500 mL etil asetat ditutup wadah kaca dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya dan sesekali diaduk. Setelah 5 hari, maserat disaring, dicuci ampas dengan etil asetat secukupnya hingga diperoleh 2000 mL, lalu dipindahkan dalam bejana tertutup dan dibiarkan di tempat yang sejuk dan terhindar dari matahari selama 2 hari, kemudian dienap-tuangkan dan disaring. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 770C sampai diperoleh maserat pekat (Ditjen POM, Depkes RI, 1979).
3.7.4 Pembuatan Ekstrak Kental n-Heksan Daun Kucai
Ditimbang serbuk simplisia sebanyak 200 gram kemudian dimasukkan ke dalam wadah kaca, dimasukkan 1500 mL n-heksana ditutup wadah kaca dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya dan sesekali diaduk. Setelah 5 hari, maserat disaring, dicuci ampas dengan n-heksana secukupnya hingga diperoleh 2000 mL, lalu dipindahkan dalam bejana tertutup dan dibiarkan di tempat yang sejuk dan terhindar dari matahari selama 2 hari, kemudian dienap-tuangkan dan disaring. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 700C sampai diperoleh maserat pekat (Ditjen POM, Depkes RI, 1979).
3.8 Penetapan Kadar Total Fenol
Penetapan kadar total fenol pada penelitian Ahlem Rebaya, dkk. (2014) yang dilakukan secara spektrofotometri UV-Vis menggunakan reagen Folin- Ciocalteau dan asam galat sebagai baku pembanding. Bagan alir penetapan kadar total fenol dapat dilihat pada Lampiran 6.
3.8.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Asam Galat
Ditimbang asam galat sebanyak 5 mg kemudian dilarutkan dengan metanol hingga 10 mL dan dihomogenkan sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 500 µg/ml.
3.8.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Asam Galat
Dipipet 0,1 mL larutan baku asam galat kemudian ditambahkan 7,9 mL akuades; 0,5 mL Folin-Ciocalteau, divortex selama ± 1 menit; serta ditambahkan 1,5 mL Na2CO3 20%; kemudian diinkubasi selama 90 menit. Diukur panjang gelombang maksimum menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada rentang 400– 800 nm.
3.8.3 Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Galat
Dipipet dari larutan baku asam galat masing masing 0,3125 mL; 0,625 mL; 1,25 mL; 2,5 mL; 5 mL ke dalam masing- masing labu tentukur 5 mL, kemudian ditambahkan metanol hingga batas kalibrasi labu tentukur sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 31,25 µg/ml; 62,5 µg/ml; 125 µg/ml; 250 µg/ml; dan 500 µg/ml. Dari masing- masing konsentrasi dipipet sebanyak 0,1 mL, kemudian ditambahkan dengan 7,9 mL akuades; 0,5 mL reagen Folin-Ciocalteau, divortex selama ± 1 menit; serta ditambahkan 1,5 mL Na2CO3 20%; kemudian diinkubasi selama 90 menit. Diukur absorbansi dari masing-masing konsentrasi
larutan terhadap reagen yang digunakan (blanko) secara spektrofotometri UV-Vis (400-800 nm) pada panjang gelombang maksimum. Diperoleh kurva kalibrasi dan persamaan garis regresi linear y = ax + b dari asam galat.
3.8.4 Penetapan Kadar Total Fenol pada Infusa Kental Daun Kucai
Ditimbang 10,0 mg infusa kental dilarutkan dengan metanol hingga 10 mL sehingga diperoleh larutan 1000 µg/ml. Diambil larutan uji sebanyak 0,1 mL kemudian ditambahkan 7,9 mL akuades 0,5 mL reagen Folin-Ciocalteau, divortex selama ± 1 menit; serta ditambahkan 1,5 mL Na2CO3 20%; kemudian diinkubasi selama 90 menit. Diukur absorbansi larutan terhadap kalibrasi asam galat pada panjang gelombang maksimum secara spektrofotometri UV-Vis.
3.8.5 Penetapan Kadar Total Fenol pada Ekstrak Kental Daun Kucai
Ditimbang 10,0 mg ekstrak kental dilarutkan dengan metanol hingga 10 mL sehingga diperoleh larutan 1000 µg/ml. Diambil larutan uji sebanyak 0,1 mL kemudian ditambahkan 7,9 mL akuades 0,5 mL reagen Folin-Ciocalteau, divortex selama ± 1 menit; serta ditambahkan 1,5 mL Na2CO3 20%; kemudian diinkubasi selama 90 menit. Diukur absorbansi masing-masing larutan ekstrak kental daun kucai terhadap kalibrasi asam galat pada panjang gelombang maksimum secara spektrofotometri UV-Vis. Konsentrasi fenol dalam larutan uji dihitung dari plot kalibrasi dan kandungan total fenol dinyatakan dalam satuan mg GAE/ gram ekstrak sampel.
3.9 Penetapan Kadar Total Flavonoid
Penetapan kadar total flavonoid ekstrak daun kucai mengacu pada penelitian Chang C., dkk. (2002) yang dilakukan dengan metode kolorimetri dan spektrofotometri menggunakan AlCl3 dan kuersetin sebagai pembanding. Bagan alir penetapan kadar total flavonoid dapat dilihat pada Lampiran 7.
3.9.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Kuersetin
Dibuat larutan kuersetin dengan konsentrasi µg/ml. Sebanyak 10,0 mg kuersetin dilarutkan dalam metanol sampai volume 100 mL.
3.9.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Kuersetin
Dipipet 2 mL dari larutan induk baku kuersetin, ditambahkan 0,1 mL AlCl3 dan 0,1 mL CH3COONa dan 2,8 mL akuades, lalu diinkubasi selama 40 menit. Diukur panjang gelombang maksimum menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada rentang 400 nm – 800 nm.
3.9.3 Pembuatan Kurva Kalibrasi Kuersetin
Dipipet dari larutan baku kuersetin masing-masing 1,5 mL; 2,5 mL; 3,625 mL; 4,75 mL; dan 5,875 mL dan dimasukkan ke dalam masing-masing labu tentukur 25 mL sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 6 µg/ml; 10 µg/ml;
14,5 µg/ml; 19 µg/ml; dan 23,5 µg/ml. Dipipet 2 mL dari masing-masing konsentrasi dan ditambahkan 0,1 mL AlCl3 dan 0,1 mL CH3COONa dan 2,8 mL akuades, lalu diinkubasi selama 40 menit. Diukur absorbansi dari masing-masing konsentrasi larutan standard secara spektrofotometri UV-Vis (400-800 nm) pada panjang gelombang maksimum. Diperoleh kurva kalibrasi kuersetin serta persamaan garis regresi linear y = ax + b.
3.9.4 Penetapan Kadar Total Flavonoid Infusa Kental Daun Kucai
Ditimbang sebanyak 25 mg infusa kental dilarutkan dengan 50 mL metanol sehingga diperoleh konsentrasi 500 µg/ml, kemudian diambil 15 mL larutan uji dan diencerkan dengan metanol hingga 25 mL sehingga diperoleh konsentrasi 300 µg/ml. Dipipet larutan ini sebanyak 2 mL, ditambahkan 0,1 mL AlCl3 dan 0,1 mL CH3COONa serta 2,8 mL akuades, lalu diinkubasi selama 40 menit. Diukur absorbansi larutan terhadap standard kalibrasi kuersetin secara spektrofotometri UV-Vis (400-800 nm) pada panjang gelombang maksimum.
3.9.5 Penetapan Kadar Total Flavonoid Ekstrak Kental Daun Kucai
Ditimbang sebanyak 25 mg ekstrak kental dilarutkan dengan 50 mL metanol sehingga diperoleh konsentrasi 500 µg/ml, kemudian diambil 15 mL larutan uji dan diencerkan dengan metanol hingga 25 mL sehingga diperoleh konsentrasi 300 µg/ml. Dipipet larutan ini sebanyak 2 mL, ditambahkan 0,1 mL AlCl3 dan 0,1 mL CH3COONa serta 2,8 mL akuades, lalu diinkubasi selama 40 menit. Diukur absorbansi terhadap kalibrasi kuersetin secara spektrofotometri UV-Vis (400-800 nm) pada panjang gelombang maksimum. Konsentrasi flavonoid dalam sampel uji yang dihitung dari plot kalibrasi dan dinyatakan dalam satuan mg QE/gram ekstrak sampel.
3.10 Pengujian Aktivitas Antioksidan Menggunakan Metode Pemerangkapan Radikal Bebas DPPH
3.10.1 Prinsip Metode Pemerangkapan Radikal Bebas (DPPH)
Kemampuan antioksidan dalam ekstrak tumbuhan dalam menetralkan radikal bebas DPPH dengan melepaskan elektron kepada DPPH, menghasilkan
