BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Determinasi tanaman keladi tikus yang didapatkan di Malang, Jawa Timur dengan buku acuan menurut Backer, 1963 dilakukan di Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
2. Strerilisasi alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilisasikan terlebih dahulu. Alat-alat dicuci bersih dibawah air mengalir dengan menggunakan deterjen. Setelah dikeringkan, alat-alat tersebut dibungkus menggunakan aluminium foil dan disterilisasikan dalam autoclave selama 20 menit pada suhu 121°C.
3. Pembuatan simplisia
Daun keladi tikus yang telah dikumpulkan kemudian dicuci bersih dibawah air mengalir. Setelah dicuci daun dikeringkan dibawah terik matahari dan dilanjutkan dengan menggunakan oven pada suhu 50° C. Daun kemudian diserbukkan di Merapi Farma, Kaliurang, Yogyakarta.
4. Ekstraksi daun keladi tikus dengan metode maserasi
Sebanyak 25 gram serbuk simplisia daun keladi tikus direndam dalam 250 mL etil asetat dalam erlenmeyer bertutup dan dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari sambil diaduk menggunakan shaker. Setelah 24 jam maserat diambil dan disaring kemudian ditampung dalam tabung erlenmeyer tertutup dan disimpan terlindung dari cahaya matahari. Kemudian ditambahkan pelarut baru dan dilakukan remaserasi selama 24 jam. Setelah 24 jam ekstrak disaring dan ditampung. Ekstrak kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator.
5. Pembuatan media kultur
Disiapkan botol Duran volume 100 mL. Sebelum digunakan, FBS dan penisilin-streptomisin dicairkan terlebih dahulu pada suhu kamar.
Setelah itu 10 mL FBS diambil dan dituangkan kedalam botol duran lalu ditambahkan 1 mL campuran antibiotik-antifungal penisilin-streptomisin. Kemudian, media RPMI ditambahkan sampai 100 mL (sekitar leher botol). Diberi penandaan pada botol dengan nama media dan tanggal pembuatan media kultur.
6. Uji sitotoksisitas ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker kolon WiDr dengan metode MTT
a. Kultur sel WiDr
Sel WiDr diambil dari tangki nitrogen dan segera dicairkan dalam penangas air 37° C. Ampul disemprot dengan etanol 70% dan dimasukkan dalam LAF. Ampul dibuka dan sel WiDr dipindahkan ke dalam conical tube
steril yang telah berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 650 rpm selama 3 menit dan supernatan yang terbentuk dibuang. Medium RPMI 1640 yang baru ditambahkan kedalam suspensi sel dan disentrifugasi kembali selama 5 menit hingga homogen dan dicuci ulang sekali lagi. Setelah suspensi sel WiDr didapatkan, ditambahkan 1 mL media kultur yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan kembali secara perlahan hingga homogen. Sel WiDr kemudian ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator CO2 dengan suhu 37° C. Setelah 24 jam, medium kultur WiDr diganti dan sel WiDr ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian. b. Panen Sel WiDr
Setelah sel WiDr konfluen, medium kultur dibuang kemudian sel WiDr dicuci dengan 3,5 mL PBS sebanyak 2 kali. Tripsin-EDTA sebanyak 300L ditambahkan dalam sel WiDr dan dilakukan inkubasi selama 3 menit dalam inkubator CO2. Sebanyak ± 5 mL media kultur ditambahkan kembali dan sel WiDr diresuspensikan hingga terlepas seluruhnya dari dinding flask. Suspensi sel dipindahkan ke dalam conical tube steril baru. Sel WiDr dihitung dengan haemocytometer dan cell counter dan dibuat konsentrasi suspensi sel yang digunakan untuk penelitian yaitu sebesar 2x104/100 µL. c. Preparasi larutan uji ekstrak daun keladi tikus
Ekstrak daun keladi tikus ditimbang ± 1 mg dan dimasukkan dalam tabung effendorf kemudian dilarutkan dalam 1 mL DMSO dan divortex sampai homogen untuk mendapatkan larutan ekstrak induk dengan konsentrasi 1 mg/mL. Larutan induk diencerkan dengan media kultur hingga diperoleh seri konsentrasi 1; 10; 100; 400; 1000; 1200; dan 1500 g/mL. d. Preparasi larutan kontrol positif doksorubisin
Doksorubisin dengan konsentrasi stok 2000 M dibuat seri konsentrasi 1; 10; 25; 50; 100; dan 250 M dalam media kultur.
e. Uji sitotoksik dengan MTT assay
Orientasi dilakukan untuk menentukan rentang konsentrasi yang akan dilakukan dalam uji. Sebanyak 100 µL ekstrak daun keladi tikus dengan kadar 1; 10; 100; 400; 1000; 1200; dan 1500 g/mL diteteskan pada suspensi sel WiDr dengan kepadatan 2x104/100 L dalam sumuran yang berbeda pada well plate. Sebagai kontrol, tiga buah
well berisi 100 µ L suspensi sel ditambahkan 100 µL media kultur. Doksorubisin sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 1; 10; 25; 50; 100; 250 ditambahkan ke dalam sumuran.
Sel yang telah diberi perlakuan kemudian diinkubasi selama semalam didalam inkubator dengan suhu 37C, kemudian seluruh larutan uji dan media dibuang seluruhnya dan ditambahkan 100 L reagen MTT ke dalam masing-masing sumuran, diinkubasikan selama 2-4 jam. Reagen stopper ditambahkan dan kemudian sel didiamkan selama semalam. Absorbansi setiap sumuran dibaca menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm.
7. Uji induksi apoptosis dengan metode Double Staining a. Penanaman sel kanker WiDr
Sel kanker WiDr diambil dari inkubator CO2 kemudian dipanen. Sel yang digunakan adalah sel yang sudah dalam kondisi 80% konfluen. Dilakukan perhitungan sel dan dibuat suspensi sel sebanyak 5x104 sel tiap 200 L untuk tiap sumuran. Coverslip dimasukkan kedalam 24-well plate
menggunakan pinset dengan hati-hati. Dua ratus µL suspensi sel dimasukkan tepat diatas coverslip secara merata dan perlahan, kemudian didiamkan selama 3-30 menit dalam inkubator agar sel menempel pada
coverslip. Sebanyak 800 µL media kultur sel WiDr ditambahkan kedalam sumuran secara perlahan. Keadaan sel diamati di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Dilakukan inkubasi sel dalam inkubator selama semalam. Sebanyak satu konsentrasi sampel pada IC50 terhadap sel kanker kolon
WiDr dibuat untuk sampel perlakuan dan media kultur untuk kontrol sel, masing-masing sebanyak 1000 µL.
b. Perlakuan Double Staining Sampel pada Sel
Sel WiDr dalam 24-well plate diambil dari inkubator. seluruh media kultur dari tiap-tiap sumuran dibuang dengan mikropipet secara perlahan. Kemudian, kedalam tiap sumuran diteteskan 500 L PBS untuk mencuci sel WiDr. Kemudian PBS dibuang dari sumuran dan ditambahkan sebanyak 1000 µ L larutan uji ekstrak etil asetat daun keladi tikus atau doksorubisin dengan konsentrasi sesuai IC50 terhadap sel kanker kolon WiDr kedalam sumuran. Media kultur dimasukkan diatas kontrol sel dan kemudian diinkubasikan didalam inkubator selama 24 jam. Setelah diinkubasi, semua media dari sumuran dibuang dan masing-masing dicuci dengan 500 µL PBS. PBS kemudian dibuang dan coverslip diambil menggunakan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati. Letakkan coverslip di atas object glass (kaca obyek) dan diberi label. Teteskan 10 µ L reagen campuran ethidium bromide-akridin oranye di atas
coverslip dan ratakan dengan cara digoyangkan secara perlahan. Preparat tersebut kemudian diamati di bawah mikroskop fluoresens dan didokumentasikan.
8. Pengamatan ekpresi protein dengan metode imunositokimia
Sel kanker WiDr diambil dari inkubator CO2 kemudian dipanen. Sel yang digunakan adalah sel yang sudah dalam kondisi 80% konfluen. Dilakukan perhitungan sel dan dibuat suspensi sel sebanyak 5x104 sel tiap
200 L untuk tiap sumuran. Coverslip dimasukkan kedalam 24-well plate
menggunakan pinset dengan hati-hati. Dua ratus µL suspensi sel dimasukkan tepat diatas coverslip secara merata dan perlahan, kemudian didiamkan selama 3-30 menit dalam inkubator agar sel menempel pada
coverslip. Sebanyak 800 µL media kultur sel WiDr ditambahkan kedalam sumuran secara perlahan. Keadaan sel diamati di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Inkubasi sel dilakukan di dalam inkubator selama semalam. Sebanyak satu konsentrasi sampel pada IC50 dibuat untuk sampel perlakuan dan media kultur untuk kontrol sel, masing-masing sebanyak 1000 µL.
Sebuah 24 well plate yang telah berisi sel diambil dari inkubator. Semua media kultur dari sumuran dibuang dengan mikropipet secara perlahan. Sel dicuci dengan PBS 500 L kemudian PBS dibuang. Sampel berupa ekstrak etil asetat daun keladi tikus atau doksorubisin sebanyak 1000 µL dimasukkan kedalam sumuran. Kemudian sebanyak 1000 µL media kultur sel dimasukkan kedalam sumuran sebagai kontrol sel. Kemudian diinkubasikan didalam inkubator selama 15 menit. Kondisi sel WiDr diamati sebelum difiksasi. Media kultur dibuang seluruhnya dari sumuran dan masing-masing dicuci dengan 500 µL PBS. PBS dibuang dan coverslip diambil menggunakan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati. Coverslip diletakkan di dalam 24-well plate dan diberi label pada masing-masing perlakuan. Sebanyak 300 µL methanol dingin ditambahkan dan diinkubasi selama 10 menit dalam freezer. Methanol
dibuang secara perlahan dan coverslip dijaga agar tidak terbalik. Sebanyak 500 µL PBS kemudian ditambahkan pada coverslip dan didiamkan selama 5 menit. PBS kemudian diambil dengan mikropipet 1000 µL kemudian ditambahkan 500 µL akuades. Akuades dibuang setelah 5 menit dan dilakukan pencucian dengan akudest selama 2 kali. Larutan hidrogen peroksida (blocking solution) ditambahkan pada
coverslip, lalu diinkubasikan selama 10 menit. Larutan dibuang dengan mikropipet dan diteteskan predilute blocking serum kemudian diinkubasikan selama 10 menit. Larutan dibuang dan ditetesi antibodi monoklonal primer mouse anti-human COX-2. 500 µL PBS ditambahkan kedalam sumuran dan diinkubasi selama 5 menit. PBS dibuang dan ditetesi antibodi sekunder rabbit anti-mouse COX-2 yang dilabeli oleh biotin (biotinylated universal secondary antibody) serta diinkubasi selama 10 menit. 500 µ L PBS ditambahkan dan diinkubasi selama 5 menit. PBS dibuang dan diteteskan dengan reagen yang berisi kompleks streptavidin-enzim peroksidase lalu diinkubasi selama 10 menit. Kemudian 500 µ L PBS ditambahkan dan diinkubasi selama 5 menit. PBS dibuang dan diteteskan larutan substrat kromogen DAB lalu diinkubasi selama 10 menit. Sebanyak 500 µ L akuades ditambahkan kemudian buang kembali. Larutan haemotoxylin diteteskan dan diinkubasi selama 3 menit. 500 µL akuades ditambahkan lalu di buang kembali. Coverslip
diangkat dengan pinset secara hati-hati kemudian dicelupkan dalam larutan xylol. Coverslip kemudian dicelupkan dalam alkohol dan
dikeringkan. Coverslip kemudian diletakkan di atas object glass dan ditetesi dengan mounting media. Tutup coverslip dengan coverslip kontak dan ekspresi protein diamati dengan mikroskop.
F. Tata Cara Analisis Hasil