Tata Cara Penelitian

BAB III. METODE PENELITIAN

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi buah P. americana

Determinasi dilakukan dengan mencocokkan buah P. americana yang diperoleh dari depot Es Teler 77 di Yogyakarta dengan buah P. americana berdasarkan acuan determinasi tanaman P. americana (Agrilink, 2001).

2. Pengumpulan bahan uji

Bahan uji yang digunakan adalah kulit buah P. americana. Pemilihan kulit buah P. americana yang digunakan adalah buah P. americana yang sudah matang, kulit buah yang masih segar, warna kulit hijau tua dan kulit buah tidak membusuk. Kulit buah P. americana diperoleh dari depot Es Teler 77 di Yogyakarta periode Juni –Juli 2014.

3. Pembuatan serbuk kulit buah P. americana

Kulit buah P.americana dicuci bersih di bawah air mengalir. Setelah bersih kulit dipotong kecil-kecil dan diangin-anginkan hingga kulit tidak tampak basah kemudian dilakukan pengeringan menggunakan oven pada

suhu 50˚C selama 24 jam. Setelah kering kulit dibuat serbuk dan diayak dengan ayakan nomor 40 karena jika serbuk terlalu halus akan mengendap pada saat maserasi sehingga mempengaruhi proses ekstraksi. Pernyataan tersebut berdasarkan teori bahwa pada saat melakukan ekstrak suatu simplisia, tidak jarang terjadi bagian (potongan) yang sangat halus dari simplisia melewati penyaring sehingga dapat membentuk endapan (Agoes, 2009)

4. Penetapan kadar air dalam serbuk kering kulit buah P. americana

Penetapan kadar air serbuk kulit buah P. americana bertujuan untuk mengetahui kadar air dalam serbuk dan untuk memenuhi persyaratan serbuk yang baik, yaitu kurang dari 10% (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995). Penetapan kadar air serbuk kulit buah P. americana dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada Yogyakarta menggunakan metode gravimetri.

5. Pembuatan sediaan etanol kulit buah P. americana

Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi. Sebanyak 40 g serbuk kulit buah P. americana direndam dalam 200 ml pelarut etanol 70% pada suhu kamar selama 5 x 24 jam. Setelah dilakukan perendaman, hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong Buchner yang dilapisi kertas saring sehingga diperoleh filtrat. Serbuk sisa perendaman dimaserasi kembali dengan 200 mL etanol 70 % selama 2 x 24 jam. Filtrat hasil saringan dipindahan ke labu alas bulat untuk dievaporasi untuk menguapkan cairan penyari pada proses maserasi. Hasil evaporasi dituangkan dalam cawan

porselen yang telah ditimbang sebelumnya karena hasil ekstrak merupakan ekstrak kental yang memiliki sifat lengket. Cawan porselen yang berisi larutan hasil evaporasi diuapkan di atas waterbath dengan suhu 80⁰C untuk

mendapatkan ekstrak etanol kulit buah P. amerciana dengan bobot pengeringan ekstrak yang tetap, kemudian dilakukan perhitungan rata-rata rendemen dari replikasi ekstrak etanol kulit buah P. americana kental yang telah dibuat. Persen rendemen ekstrak kental kulit buah P. americana diperoleh berdasarkan perhitungan :

% Rendemen = total ekstrak kulit buah 𝑃𝑃.𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 Mill .

total serbuk kulit buah 𝑃𝑃.𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 Mill . ^{X 100%}

6. Pembuatan CMC-Na 1%

Ditimbang sebanyak 1,0 gram CMC-Na kemudian dilarutkan menggunakan aquadest 50 mL, didiamkan selama 24 jam hingga CMC-Na mengembang setelah itu di add dengan aquadest hingga 100 mL pada labu ukur 100 mL.

7. Penetapan konsentrasi ekstrak

Konsentrasi yang dapat digunakan yaitu konsentrasi pekat yang dapat dibuat dimana pada konsentrasi tersebut ekstrak dapat dimasukkan serta dikeluarkan dari spuit oral. Cara pembuatannya dengan melarutkan Sebanyak 3,5 gram ekstrak dalam labu ukur 50 mL dengan pelarut yang sesuai yaitu CMC-Na 1% sehingga konsentrasi ekstrak dapat ditetapkan sebesar 7% b/v atau 0,07 gram/mL atau 70 mg/mL. Penetapan konsentrasi ekstrak kulit buah

8. Penetapan dosis ekstrak etanol kulit buah P. amerciana

Penetapan peringkat dosis didasarkan pada perhitungan dengan bobot tikus terbesar 250 mg, konsentrasi ektrak kulit buah P. americana yang dapat dimasukkan dan dikeluarkan melalui spuit oral yaitu 7% atau 70 mg/mL, serta volume maksimal pemberian oral yaitu 5 mL, maka dosis tertinggi dapat ditentukan sebagai berikut:

BB x D = C x V

0,250 kg x D = 70 mg/mL x 5 mL  D= 1400 mg/kg BB

Dosis tengah dan dosis rendah ditentukan dengan menurunkan dua kelipatan dari dosis tertinggi, sehingga diperoleh dosis 700 dan 350 mg/Kg BB. Dosis yang digunakan 350, 700, dan 1400 mg/kg BB. Penetapan dosis ekstrak etanol kulit buah P.americana ini mengacu pada penelitian Nopitasari (2013).

9. Pembuatan larutan karbon tetraklorida dalam olive oil

Larutan karbon tetraklorida dalam olive oil dibuat dengan cara mengambil volume karbon tetraklorida secara seksama, kemudian dilarutkan dengan olive oil dengan perbandingan 1 : 1.

10. Uji pendahuluan

a.

Pemilihan dosis karbon tetraklorida dilakukan untuk mengetahui dosis karbon tetraklorida yang mampu menyebabkan kerusakan pada organ hati tikus dengan melihat peningkatan aktivitas serum ALT dan AST paling tinggi tetapi tidak menimbulkan kematian. Berdasarkan Penetapan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida

penelitian Wijaya (2013) dosis 2 mL/KgBB karbon tetraklorida secara intraperitoneal mampu memberikan efek hepatotoksik.

b.

Aktivitas peningkatan ALT dan AST pada tikus teriduksi karbon tetraklorida dengan dosis 2 mL/KgBB secara intraperitoneal diukur pada jam ke-24, 48 dan72 setelah pemejanan. Hasil yang diperoleh dilihat kenaikan yang paling tinggi dari kedua serum tersebut. Waktu peningkatan serum ALT dan AST yang paling tinggi akan dijadikan sebagai waktu pencuplikan darah dalam penelitian antihepatotoksik. Penetapan waktu cuplikan darah

c.

Pemberian ekstrak metanol biji P. americana pada rentang waktu 6 jam sebelum induksi karbon tetraklorida merupakan waktu yang paling efektif diberikan dengan nilai persen hepatoprotektif sebesar 101 % dengan dosis pemberian ekstrak metanol biji P. americana 350 mg/kgBB (Sasadara, 2013).

Penetapan waktu pemberian ekstrak kulit buah P. americana

11. Pengelompokkan hewan uji

Tiga puluh ekor tikus dibagi ke dalam enam kelompok perlakuan secara acak dengan masing-masing sebanyak 5 ekor tikus.

a. Kelompok I (kontrol hepatotoksin) larutan campuran karbon tetraklorida : olive oil (1:1) dosis 2 mL/kgBB secara intraperitoneal.

b. Kelompok II (kontrol negatif) diberi olive oil dosis 2 mL/kgBB secara intraperitoneal.

c. Kelompok III (kontrol ekstrak) diberi ekstrak etanol kulit buah P.

americana dosis 1,4 g/kg BB secara peroral.

d. Kelompok IV (dosis rendah) diberi ekstrak etanol kulit buah P.

americana dengan dosis 0,35 g/kg BB secara peroral.

e. Kelompok V (dosis tengah) diberi ekstrak etanol kulit buah P. americana dengan dosis 0,70 g/kg BB secara peroral.

f. Kelompok VI (dosis tinggi) diberi ekstrak etanol kulit buah P. americana dengan dosis 1,4 g/kg BB secara peroral.

Enam jam setelah pemberian ekstrak etanol kulit buah P. americana, maka kelompok IV-VI dipejani dengan karbon tetraklorida dosis 2 mL/kgBB secara intraperitoneal, lalu setelah 24 jam diambil darahnya melalui sinus orbitalis mata, kemudian dilakukan pengujian aktivitas ALT-AST.

12. Pembuatan serum

Pengambilan darah dilakukan pada bagian sinus orbitalis mata tikus lalu ditampung dalam tabung Eppendorf. Darah didiamkan selama ± 15 menit, kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 8000 rpm dan bagian supernatannya diambil. Kemudian dilakukan resentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 10 menit.

13. Pengukuran aktivitas ALT-AST pada serum

Aktivitas ALT dan AST dinyatakan dalam U/L. aktivitas enzim diukur pada panjang gelombang 340 nm, pada suhu 37⁰C dengan faktor koreksi

1745. Pengukuran aktivitas ALT dan AST ini dilakukan di Laboratorium Parahita Yogyakarta.