BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Determinasi serbuk biji Perseae americana Mill. dilakukan dengan mencocokan ciri-ciri serbuk biji Perseae americana Mill. dengan serbuk biji
Persea americana Mill. yang telah dideterminasi dengan menggunakan buku acuan determinasi. Determinasi dilakukan secara makroskopis termasuk
organoleptis serbuk dan secara mikroskopis. Determinasi dilakukan oleh Yohanes
Dwiatamaka, M.Si yang merupakan Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan
Bahan uji yang digunakan adalah biji Perseae americana Mill. yang telah diserbukkan dan diperoleh dari Padang, Sumatera Barat, Bulan Januari 2013.
3. Pembuatan serbuk
Biji Persea americana Mill. dicuci bersih dibawah air mengalir. Setelah bersih, biji kemudian dipotong-potong, disortir dan dikeringanginkan hingga biji
dalam oven pada suhu 500 C selama 24 jam untuk mengoptimalkan proses pengeringan. Setelah kering, biji diserbukkan dan diayak dengan ayakan nomor
40. Pengayakan dilakukan agar kandungan fitokimia yang terkandung dalam biji
Persea americana Mill. lebih mudah tersekstrak karena luas permukaan spesifik yang kontak dengan pelarut semakin besar.
4. Pembuatan ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.
Sebanyak 10 gram serbuk kering biji Persea americana Mill. diekstraksi dengan cara maserasi. Serbuk dilarutkan dalam 100 ml pelarut metanol 70% di
dalam Erlenmeyer bersumbat kaca. Ekstraksi dilakukan pada suhu kamar.
Perbandingan jumlah serbuk dan pelarut adalah 1:10. Campuran serbuk dan
pelarut kemudian digojong selama 1 menit, didiamkan dalam ruangan gelap dan
ditutup. Setiap harinya selama 5 hari berturut-turut pada jam yang sama dilakukan
penggojogan selama 1 menit. Kemudian dilakukan penyaringan dengan kertas
saring dengan bantuan pompa vakum. Ekstrak kemudian diuapkan dengan
menggunakan rotary evaporator pada suhu 70 0C hingga tidak ada lagi tetesan pada rotary evaporator. Hasilnya kemudian dipindahkan ke dalam cawan porselen yang telah ditimbang bobotnya terlebih dahulu. Selanjutnya, dipekatkan
dengan menggunakan penangas air pada suhu 70 0C. dilakukan penimbangan setiap harinya hingga bobot ekstrak tetap (selisih bobot penimbangan dan bobot
hasil penimbangan sebelumnya adalah sama). Kemudian ekstrak disimpan di
5. Penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill.
Penetapan kadar air dilakukan dengan menggunakan cara susut
pengeringan. Sebanyak 5,0 g serbuk biji Persea americana Mill. ditimbang dan kemudian serbuk tersebut dimasukkan ke dalam alat moisture balance pada suhu 105 oC selama 15 menit dan kemudian dilakukan perhitungan kadar air berdasarkan selisih bobot sebelum dimasukkan ke dalam alat (sebelum
pemanasan) dengan sesudah dimasukkan ke dalam alat moisture balance (sesudah pemanasan) selisih tersebut merupakan kadar air serbuk yang diteliti.
6. Pembuatan larutan Natrium-Carboxy Methyl Cellulosa (CMC-Na) 1 %
Larutan CMC-Na 1% dibuat dengan cara menimbang 5,0 gram CMC-Na
serbuk yang telah digerus dalam mortar dan stamper terlebih dahulu. Serbuk kemudian ditaburkan secara merata di permukaan 200 mL aquadest di dalam
gelas kimia dan ditunggu hingga semua serbuk terbasahi, tanpa pengadukan.
Setelah semua serbuk CMC-Na terbasahi maka dilakukan pengadukan hingga
seluruh CMC-Na larut. Larutan CMC-Na kemudian dimasukkan ke dalam labu
takar 500 ml dan ditambahkan aquadest hingga batas tanda.
7. Pembuatan suspensi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dalam CMC-Na 1%
Suspensi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dibuat dengan konsentrasi 7% b/v. Pembuatan dilakukan dengan cara menimbang sebanyak 3,5 g
ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. secara seksama. Ekstrak tersebut kemudian dilarutkan dengan menggunakan larutan CMC-Na 1% hingga seluruh
mL dan ditambah dengan larutan CMC-Na 1% hingga batas tanda, selanjutnya
digojog hingga homogen.
8. Pembuatan larutan karbon tetraklorida (CCl4) konsentrasi 50%
Larutan CCl4 dalam Olive Oil dibuat dengan cara melarutkan 25 mL CCl4
dalam labu takar 50 mL kemudian ditambahkan dengan Olive Oil hingga tanda. Digojog hingga homogen. Pengambilan CCl4 dilakukan dengan menggunakan pipet gondok 25 mL.
9. Uji pendahuluan
a. Penetapan waktu cuplikan darah. Untuk mendapatkan waktu
pencuplikan darah dilakukan orientasi dengan 4 kelompok perlakuan waktu.
Masing-masing kelompok menggunakan sejumlah 5 ekor tikus. Kelompok I
diambil darah pada jam ke-0 atau sebelum dilakukan pemejanan karbon
tetraklorida (CCl4), kelompok II diambil darah pada jam ke-24 setelah pemejanan CCl4 2 mL/kgBB, kelompok III diambil darah pada jam ke-48 setelah pemejanan CCl4 2 mL/kgBB dan kelompok IV diambil darah pada jam ke-72 setelah pemejanan CCl4 2 mL/kgBB. Setelah pengambilan darah, darah diukur kadar kreatinin serum dan ditentukan waktu optimal pengukuran cuplikan darah
berdasarkan data kenaikan kreatinin serum.
b. Penetapan lama pemberian ekstrak metanol biji Persea americana
Mill. Lama waktu pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill dilakukan selama 1, 4, 6 jam pada hari yang sama sebelum dipejankan senyawa
pada waktu optimal pengukuran cuplikan darah, yaitu pada jam ke-48 setelah
pemejanan karbon tetraklorida 2 mL/kgBB.
10. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Sejumlah lima puluh dua ekor tikus dibagi secara acak ke dalam delapan
kelompok perlakuan. Kelompok I (kontrol nefrotoksin) diberi larutan karbon
tetraklorida 2 ml/KgBB secara intraperitonial. Kelompok II (kontrol negatif)
diberi minyak zaitun (Olive Oil) dosis 2 mL/kgBB. Kelompok III (kontrol ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill.) dosis 350 mg/kgBB yang diberikan pada waktu 6 jam sebelum pemejanan karbon tetraklorida 2 mL/kgBB. Kelompok IV
sampai dengan kelompok VIII berturut-turut diberi ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dosis 350 mg/kgBB pada selang waktu 1, 4 dan 6 jam sebelum pemejanan karbon tetraklorida 2 mL/kgBB. Pemberian ekstrak metanol-air biji
Persea americana Mill diakukan secara oral. Kemudian setelah 1, 4 dan 6 jam pemberian ekstrak metanol-air biji Persea americana Mill. dilakukan pemejanan karbon tetraklorida dosis 2 mL/kgBB secara intraperitonial.
Pengambilan darah dilakukan melalui sinus orbitalis mata pada waktu
yang sama dengan waktu optimal pengukuran cuplikan darah, yaitu pada jam
ke-48. Cuplikan darah kemudian diambil serumnya untuk diukur aktivitas kreatinin
serum.
11. Pembuatan serum
Darah tikus diambil melalui sinus orbitalis mata dan ditampung dalam
supernatannya (serum), supernatan ditampung dalam eppendrof 1,5 mL. Serum yang belum diukur kemudian disimpan dalam lemari pembeku (Freezer).
12. Penetapan kadar kreatinin serum
Alat yang digunakan untuk menganalisis kadar kreatinin serum adalah
vitalab mikro. Kadar kreatinin serum diukur pada panjang gelombang 340 nm,
suhu 370 C dengan faktor koreksi -1745. Kadar kreatinin serum dinyatakan dalam mg/dL. Pengukuran kadar serum kreatinin dilakukan di Laboratorium
Biokimia-Anatomi Manusia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Analisis dilakukan dengan cara sebagai berikut, sebanyak 50 μL serum dicampur
dengan reagen I sebanyak 1000 µL, divortex selama 5 detik. Didiamkan selama 1
menit. Selanjutnya dilakukan penambahan reagen II sebanyak 250 μL, divortex 5
detik dan dibaca serapannya setelah didiamkan selama 2 menit.
13. Pembuatan formalin 10%
Formalin yang diperoleh memiliki konsentrasi 37%. Untuk memperoleh
formalin dengan konsentrasi 10% maka dilakukan pengenceran formalin dengan
cara mengambil sebanyak 270 mL formalin 37%, dimasukkan dalam labu takar 1
L dan ditambah dengan aquadest hingga batas tanda, digojog hingga homogen.
14. Pencuplikan organ ginjal tikus untuk pengamatan gambaran histologis
Tiga ekor hewan uji tikus jantan Wistar diambil secara acak untuk
kemudian dikorbankan dengan menggunakan eter. Selanjutnya dilakukan nekropsi
hewan uji tikus untuk kemudian diambil organ ginjalnya. Organ ginjal dicuci
dengan formalin 10% untuk selanjutnya dibuat preparat di Fakultas Kedokteran
Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
