BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Determinasi buah Persea americana Mill. dilakukan dengan mencocokan
buah Persea americana Mill. yang berasal dari depot es yang terletak di Ambarukmo
2. Pengumpulan bahan uji
Bahan uji penelitian ini adalah kulit buah Persea americana Mill. yang
masih segar dan tidak busuk, bahan uji dikumpulkan selama periode bulan Juni 2014.
Buah yang diambil adalah buah yang matang dengan warna kulit hijau.
3. Pembuatan serbuk kering kulit buah Persea americana Mill.
Kulit buah Persea americana Mill. yang telah dipisahkan dari dagingnya,
diambil kulitnya dan di cuci dibawah air yang mengalir. Setelah bersih
diangin-anginkan kemudian dipotong hingga menjadi potongan-potongan kecil bertujuan
untuk mempercepat proses pengeringan. Selanjutnya setelah dalam bentuk potongan
kecil dilakukan pengeringan di bawah sinar matahari. Pengeringan dilanjutkan
dengan oven pada suhu 500C selama 24 jam, kemudian diserbuk dan diayak dengan
ayakan No. 40 agar luas permukaan serbuk yang kontak dengan pelarut semakin
besar sehingga kandungan fitokimia yang terkandung dalam kulit buah Persea
americana Mill. lebih mudah terekstrak.
4. Penetapan kadar air serbuk kering kulit buah Persea americana Mill.
Penetapan kadar air secara sederhana menggunakan alat moisture balance.
Sebanyak 5 g serbuk kulit buah Persea americana Mill. dimasukkan ke dalam alat
moisture balance dan diratakan. Serbuk ditimbang sebagai bobot sebelum pemanasan
(bobot a). Kemudian serbuk dipanaskan pada suhu diatas 1050C dan serbuk
ditimbang kembali sebagai bobot setelah pemanasan (bobot b). Selisih bobot sebelum
5. Pembuatan ekstrak etanol kulit buah Persea americana Mill.
Pembuatan ekstrak etanol kulit buah Persea americana Mill. menggunakan
metode maserasi. Metode maserasi dipilih karena digunakan untuk menyari simplisia
dimana zat aktif yang terkandung di dalamnya mudah larut dalam cairan penyari.
Selain itu dalam proses pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana. Dalam
metode maserasi tidak dilakukan pemanasan sehingga bahan alam tidak akan terurai.
Cairan penyari yang digunakan adalah etanol karena senyawa hipotesis yang
diketahui adalah senyawa golongan glikosida fenolik yang dapat larut dalam pelarut
polar. Hal ini berdasarkan penelitian Javier, David, Maria, Petri dan Mario (2011),
menyatakan bahwa senyawa fenolik biji Persea americana Mill. merupakan hasil
isolasi dengan pelarut organik yang bersifat polar. Berdasarkan penelitian Shirly,
Hesty dan Wahyu (2013) menyatakan bahwa ekstrak etanol 70% daun Persea
americana Mill. mengandung senyawa flavonoid, saponin, dan kumarin.
Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi yaitu perendaman dengan
melarutkan 40 g serbuk kulit buah Persea americana Mill. dalam 200 ml pelarut
etanol 70 % dan dimaserasi selama 5 x 24 jam pada suhu kamar dengan sesekali
dilakukan penggojokan. Tujuan dilarutkannya dalam pelarut etanol supaya senyawa
kimia yang terkandung dalam kulit buah Persea americana Mill. dapat larut di dalam
pelarut. Selanjutnya hasil maserasi disaring untuk memisahkan filtrat dari serbuk
(residu) dengan menggunakan corong Buchner yang dilapisi kertas saring. Kemudian
serbuk hasil penyaringan tersebut di remaserasi atau maserasi kembali dengan pelarut
selanjutnya disaring. Kedua hasil ekstrak dicampurkan dan dievaporasi menggunakan
labu alas bulat. Ekstrak kental yang diperoleh ditempatkan dalam cawan petri dan
dilakukan penimbangan untuk mempermudah dalam perhitungan rendemen ekstrak
yang akan diperoleh. Kemudian hasil maserasi diuapkan kembali di atas waterbath
dengan suhu 800C hingga diperoleh bobot tetap kemudian disimpan di dalam
desikator.
Dilakukan perhitungan rata-rata rendemen enam replikasi ekstrak etanol
kulit buah Persea americana Mill. kental yang telah dibuat.
Rendemen ekstrak = berat cawan ekstrak kental – berat cawan kosong Berat serbuk kering
Rata-rata rendemen = rep.1 + rep.2 + rep.3 + rep.4 + rep.5 + rep.6
6
6. Penetapan konsentrasi pekat ekstrak
Berdasarkan penelitian Nopitasari (2013), digunakan konsentrasi pekat yang
dapat dibuat dimana pada konsentrasi tersebut ekstrak yang dibuat dapat dimasukkan
serta dikeluarkan dari spuit oral. Cara pembuatannya dengan melarutkan ekstrak
sebanyak 3,5 g dalam labu ukur 50 ml dengan pelarut yang sesuai yaitu CMC Na 1%.
Sehingga konsentrasi ekstrak dapat ditetapkan sebesar 7% b/v atau 0,07 g/ml atau 70
mg/ml.
7. Penetapan dosis ekstrak etanol kulit Buah Persea americana Mill.
Berdasarkan penelitian Nopitasari (2013), penetapan peringkat dosis
yang dapat dimasukkan dan dikeluarkan melalui spuit oral dan pemberian volume
cairan peroral yaitu 5 ml. Penetapan dosis tertinggi ekstrak etanol kulit buah Persea
americana Mill. dengan konsentrasi 7% diperoleh sebagai berikut :
D x BB = C x V
D x 0,250 kgBB = 70 mg/ml x 5 ml
D = 1400 mg/kgBB
Dua dosis lainnya diperoleh dengan menurunkan 2 dan 4 kalinya sehingga
didapatkan dosis 700 dan 350 mg/kgBB. Dosis yang digunakan dalam penelitian
adalah 350; 700; dan 1400 mg/kgBB atau 0,35; 0,70; dan 1,40 g/kgBB.
8. Pembuatan suspending agent CMC-Na 1%
Ditimbang sebanyak 5 g CMC Na, kemudian dilarutkan menggunakan
aquadest 200 ml, lalu didiamkan selama 24 jam hingga CMC mengembang,
kemudian di add dengan aquadest pada labu ukur hingga 500 ml.
9. Pembuatan larutan karbon tetraklorida
Karbon tetraklorida dibuat dalam konsentrasi 50% dengan cara melarutkan
50 ml karbon tetraklorida ke dalam olive oil sebanyak 50 ml (Janakat dan Merrie,
2002).
10.Uji pendahuluan
a. Penetapan dosis karbon tetraklorida bertujuan untuk mengetahui pada dosis
berapa karbon tetraklorida mampu menimbulkan kerusakan hati pada tikus yang
ditunjukan dengan adanya peningatan aktivitas serum ALT yang tinggi.
adalah 2 ml/kg BB yang terbukti mampu meningkatkan aktivitas serum ALT dan
AST yang diberikan secara intraperitonial (i.p). Pada penelitian yang dilakukan
Garri (2013) juga membuktikan bahwa 2 ml/kg BB mampu meningkatkan
aktivitas serum ALT dan AST yang pemberiannya melalui intraperitonial (i.p).
b. Penetapan waktu pencuplikan darah. Untuk mendapatkan waktu pencuplikan
darah dilakukan orientasi dengan satu kelompok. Dalam satu kelompok terdiri
dari 5 ekor tikus. Pengambilan darah dilakukan melalui sinus orbitalis mata. Pada
jam ke 0, 24, dan 48 jam setelah pemejanan karbon tetraklorida. Kemudian
lakukan pengukuran aktivitas ALT.
11.Pengelompokkan dan perlakuan hewan uji
Tiga puluh ekor tikus dibagi menjadi enam kelompok perlakuan secara acak,
masing-masing sejumlah lima ekor tikus.
a. Kelompok I (kontrol hepatotoksin) diberi larutan karbon tetraklorida : olive oil
(1:1) dosis 2 ml/kgBB secara intra peritonial, setelah dua puluh empat jam ambil
darahnya.
b. Kelompok II (kontrol negatif) diberi olive oil sebanyak 2 mL secara intra
peritonial, setelah dua puluh empat jam diambil darahnya.
c. Kelompok III (kontrol ekstrak) diberi ekstrak etanol kulit buah Persea americana
Mill. dosis 1,4 g/kgBB secara per oral, enam jam kemudian diambil darahnya.
d. Kelompok IV (dosis rendah) diberi ekstrak etanol kulit buah Persea americana
e. Kelompok V (dosis tengah) diberi ekstrak etanol kulit buah Persea americana
Mill. dosis 0,7 g/kgBB secara per oral.
f. Kelompok VI (dosis tinggi) diberi ekstrak etanol kulit buah Persea americana
Mill. dosis 1,4 g/kgBB secara per oral.
Enam jam kemudian kelompok IV-VI dipejani karbon tetraklorida dosis 2
ml/kgBB secara intraperitonial. Ambil darahnya setelah 24 jam melalui sinus orbitalis
mata, kemudian diukur aktivitas ALP-nya.
12.Pembuatan serum
Darah diambil melalui sinus orbitalis mata tikus dan ditampung dalam
tabung Eppendorf. Darah didiamkan selama ± 15 menit, kemudian disentrifugasi
selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm dan bagian supernatannya diambil.
13.Penetapan aktivitas serum ALP
Pengukuran aktivitas ALP dilakukan di Laboratorium PARAHITA,
Yogyakarta. Pengukuran dilakukan dengan cara memasukkan serum yang didapatkan
ke dalam alat Architect yang didalamnya terdapat reagen untuk pengukuran ALP
serum. Prinsip dari pengukuran aktivitas ALP serum yaitu alkali fosfatase dalam
sampel mempercepat hidrolisis p-nitrofenil fosftat (p-NPP) menjadi p-nitrofenol dan
fosfat anorganik. Pada pH basa, p-nitrofenol dalam bentuk phenoxide berwarna
kuning akan memberikan kenaikan absorbansi pada panjang gelombang 404 nm yang
