BAB III. METODE PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
Determinasi simplisia daun sirih dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta sesuai dengan buku acuan Materia Medika IV (1980).
2. Pembuatan serbuk daun sirih
Sebelum dilakukan penyerbukan, simplisia daun sirih disortasi terlebih dahulu. Simplisia kering kemudian diserbuk dengan menggunakan alat penyerbuk dan diayak dengan ayakan no. 30. Simplisia disimpan dalam wadah tertutup dan diberisilica gel.
3. Pembuatan ekstrak daun sirih
Ekstraksi daun sirih dilakukan dengan cara maserasi. Serbuk daun sirih kering dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer. Kemudian ditambah etanol 96% dengan perbandingan serbuk dengan pelarut 1:10. Maserasi selama 48 jam. Maserat dipisahkan dan pelarut diuapkan dengan rotary vaccum evaporatorpada suhu 50ºC hingga didapat ekstrak yang lebih pekat. Sisa pelarut diuapkan dengan pemanasan di oven dengan suhu 50ºC.
4. Uji kandungan kimia dalam ekstrak etanol daun sirih
Uji kandungan kimia ekstrak etanol daun sirih dilakukan dengan penapisan fitokimia dan uji penegasan golongan senyawa degan KLT. Pengujian yang dilakukan adalah uji golongan alkaloid, saponin, tannin dan polifenol, flavonoid, terpenoid dan fenolat. Uji senyawa dengan KLT dilakukan untuk mengetahui kandungan eugenol dalam ekstrak.
a. Golongan alkaloid. Ekstrak etanol daun sirih dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambah 0,5 mL HCl 2% dan larutan dibagi dalam dua tabung. Tabung I ditambahkan 2-3 tetes reagen Dragendroff, tabung II ditambahkan 2-3 tetes reagen Mayer. Jika tabung I terbentuk endapan jingga dan pada tabung II terbentuk endapan kekuning-kuningan, menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun sirih mengandung alkaloid.
b. Golongan saponin. Ekstrak etanol daun sirih dimasukkan dalam tabung reaksi ditambah 10 mL air sambil dikocok selama 1 menit, apabila menimbulkan busa ditambah 2 tetes HCl 1N, bila busa yang terbentuk bisa tetap stabil selama ±30 menit maka ekstrak etanol daun sirih positif mengandung saponin.
c. Golongan tanin dan polifenol. Ekstrak etanol daun sirih ditambahkan
aquadest panas, kemudian diaduk dan didinginkan. Setelah itu 5 tetes NaCl 10% ditambahkan kemudian disaring. Filtrat dibagi menjadi 3 bagian, bagian A, B, dan C. Filtrat A digunakan sebagai blanko. Tiga tetes pereaksi FeCl3ditambahkan ke filtrat B, sedangkan pada filtrat C ditambahkan larutan gelatin. Jika terbentuk endapan pada filtrat C maka dalam ekstrak daun sirih terkandung tannin. Jika terbentuk warna hijau kehitaman pada filtrat B menunjukkan adanya tanin terhidrolisa. Jika terbentuk warna hijau kecoklatan pada filtrat B menunjukkan adanya senyawa polifenol.
d. Golongan terpenoid. Esktrak etanol daun sirih ditambah dengan vanilin dan H2SO4 pekat. Apabila terjadi perubahan warna menjadi ungu, maka ekstrak etanol daun sirih positif mengandung terpenoid.
e. Golongan fenolat. Ekstrak etanol daun sirih ditambah dengan larutan FeCl3 1%. Jika terjadi perubahan warna hijau, merah ungu, biru/hitam, maka ekstrak etanol daun sirih positif mengandung senyawa fenolat.
f. Uji kandungan eugenol dengan KLT. Uji kualitatif kandungan eugenol dalam ekstrak etanol daun sirih dilakukan dengan sistem KLT sebagai berikut:
Fase diam : silika gel 60 GF
Fase gerak : toluene-etil asetat (93:7 v/v) Deteksi : pereaksi vanilin H2SO4 5. Formulasi
Formula standar yang digunakan dalam penelitian ini mengacu pada dua formula, yaitu dariNew Cosmetic Science(Mitsui, 1997) danUnited States Patent
(Gupta, 2004).
Tabel II. Formula standar I (Mitsui, 1997)
Nama Bahan Jumlah (%)
Polyvinyl alcohol 15,0 Carboxymethyl cellulose 5,0 1,3-butylene glycol 5,0 Ethanol 12,0 Perfume q.s. Preservative q.s. Buffer q.s.
POE oleyl alcohol ether 0,5
Tabel III . Formula standar II (Gupta, 2004)
Nama bahan Jumlah (%)
Deionized water 69,2 Polyvinyl alcohol 11,00 Polyethylene glycol 4,0 Oleth-20 1,0 Glycerin 1,5 Sodium Hyaluronate 0,1 Preservative 0,5
Witch Hazel extract 5,0
Vitamin A Palmitate 0,1
Vitamin E acetate 0,1
Niacinamide 3,0
Asam askorbat 4,5
Formula standar tersebut kemudian dimodifikasi untuk pembuatan gel sebanyak 300 gram.
Tabel IV. Formula gel maskerpeel-off antiacnehasil modifikasi
Nama bahan Jumlah (g)
Carbopol 940 0,9 Polietilen glikol 400 12
Polivinil alkohol 21
Gliserin 19,5
Trietanolamin 6 tetes Ekstrak daun sirih hijau 1,5
Etanol 12
Pengawet 0,3
Aquadest 250
6. Pembuatan gel maskerpeel-off antiacnedari ekstrak etanol daun sirih
Carbopol dilarutkan dalam air hangat dan ditambahkan TEA (campuran 1). Polivinil alkohol dibasahi dengan aquadest, kemudian dilarutkan aquadest
yang sudah dipanaskan hingga 90ºC (campuran 2). Campuran 2 didiamkan hingga suhu kamar. Campuran 2 dimasukkan ke dalam campuran 1 sambil terus diaduk hingga homogen. Ekstrak etanol daun sirih yang dilarutkan terlebih dahulu dalam
etanol 70% ditambahkan ke dalam campuran, diaduk hingga homogen. Gliserin, PEG 400, dan pengawet (metil paraben) ditambahkan dalam campuran sambil terus diaduk hingga homogen.
Tabel V. Formula gel maskerpeel-off antiacnedari ekstrak etanol daun sirih
Nama Bahan Formula 1 (g) Formula a (g) Formula b (g) Formula ab (g) Carbopol 940 0,9 0,9 0,9 0,9 PEG 400 12 12 12 12 Polivinil alkohol 21 30 21 30 Gliserin 19,5 27 19,5 27
Trietanolamin 6 tetes 6 tetes 6 tetes 6 tetes Ekstrak etanol daun sirih 1,5 1,5 1,5 1,5 Etanol 12 12 12 12 Pengawet 0,3 0,3 0,3 0,3 Aquadest 250 250 250 250
*tiap formula direplikasi 3 kali 7. Uji sifat fisik dan stabilitas
a. Uji daya sebar. Pengukuran daya sebar sediaan gel dilakukan 48 jam setelah pembuatan dan setelah penyimpanan selama 14 hari dan 30 hari. Pengukuran daya sebar dilakukan dengan cara: gel ditimbang 1 gram kemudian diletakkan di tengah lempeng kaca bulat dan pemberat 125 gram, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicatat diameter sebarnya (Garg, Aggarwal, Garg, dan Singla, 2002).
b. Uji viskositas. Uji viskositas dilakukan tiga kali, yaitu setelah 48 jam pembuatan gel dan setelah gel disimpan 14 hari dan 30 hari. Masing-masing formula gel ditentukan viskositasnya dengan menggunakan alat Viscotester Rion
seri VT-04.
c. Uji lama pengeringan. Pengukuran lama pengeringan dilakukan di kulit tangan manusia, dengan mengoleskan 0,1 gram gel masker peel-off antiacne
pada kulit dengan luas pengolesan 2,5 cm x 2,5 cm. Olesan didiamkan hingga membentuk lapisan yang kering dan elastis. Lama kering dicatat.
d. Uji pergeseran viskositas. Pergeseran viskositas gel masker peel-off antiacne diketahui dengan menghitung persentase perubahan viskositas sediaan setelah penyimpanan selama 1 bulan.
8. Uji Iritasi Primer dengan metode Draize
Uji iritasi primer yang dilakukan menggunakan metode Draize dengan hewan uji kelinci. Cara: sejumlah 0,5 gram gel maskerpeel-off antiacnedioleskan pada kulit punggung kelinci seluas 2,5 cm x 2,5 cm yang telah dicukur, kemudian olesan tersebut ditutup dengan perban. Tempelan dibiarkan di kulit selama 4 jam, kemudian dibuka dan diamati terjadinya eritema dan edema pada interval waktu 1 jam, 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Terjadinya eritema dan edema diberi skor sesuai dengan tabel evaluasi reaksi iritasi kulit (Hayes, 2001).
Tabel VI. Evaluasi reaksi iritasi kulit (Hayes, 2001)
Jenis Iritasi Skor
Eritema Tanpa eritema 0
Eritema hampir tidak nampak 1 Eritema berbatas jelas 2 Eritema moderat sampai berat 3 Eritema berat (merah bit) sampai sedikit membentuk kerak
4
Edema Tanpa edema 0
Edema hampir tidak nampak 1 Edema tepi berbatas jelas 2 Edema moderat (tepi naik > 1 mm) 3 Edema berat (tepi naik > 1 mm dan meluas ke luar daerah pejanan)
4
Skor eritema dan edema keseluruhan pada jam ke-1, 24, 48, dan 72 dirata-rata. Rata-rata ini disebut indeks iritasi primer. Kriteria iritasi dicocokkan dengan tabel berikut:
Tabel VII. Indeks iritasi (Lu, 1995)
Indeks Iritasi Kriteria iritasi senyawa kimia 0 Tidak mengiritasi
<2 Kurang merangsang
2-5 Iritan moderat
>5 Iritan berat